一種虎杖組織培養快速繁殖方法

2023-04-27 14:42:11 1

一種虎杖組織培養快速繁殖方法
【專利摘要】本發明屬於生物【技術領域】，涉及通過植物組織培養技術的植物再生，具體為一種虎杖組織培養快速繁殖的方法。該方法包括以下步驟：（1）外植體的選取與滅菌，選取健壯、無病蟲害的野生虎杖帶腋芽幼嫩枝條作為外植體，並對其進行消毒處理；（2）不定芽的誘導，將步驟（1）中的外植體切成長2-3cm的單芽莖段，分別接種於誘導培養基中進行誘導培養，培養條件：溫度為25±2℃，光照強度1500-2000lux，光照時間14-16h；（3）不定芽的繼代培養等步驟。本發明中所述的方法快速、高效、成本低，移栽成活率高，便於推廣，遺傳穩定性好，縮短了虎杖的育苗周期，為今後進行工業化生產提供了可靠地來源和物質基礎。
【專利說明】一種虎杖組織培養快速繁殖方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，涉及通過植物組織培養技術的植物再生，具體為一種 虎杖組織培養快速繁殖的方法。

【背景技術】
[0002] 虎杖為寥科虎杖屬多年生草本植物根狀莖粗壯，橫走。莖直立，高1-2米，粗壯，空 心，具明顯的縱稜，具小突起，無毛，散生紅色或紫紅斑點。葉寬卵形或卵狀橢圓形，長5-12 釐米，寬4-9釐米，近革質，頂端漸尖，基部寬楔形、截形或近圓形，邊緣全緣，疏生小突起， 兩面無毛，沿葉脈具小突起；葉柄長1-2釐米，具小突起；託葉鞘膜質，偏斜，長3-5毫米，褐 色，具縱脈，無毛，頂端截形，無緣毛，常破裂，早落。花單性，雌雄異株，花序圓錐狀，長3-8 釐米，腋生；苞片漏鬥狀，長1. 5-2毫米，頂端漸尖，無緣毛，每苞內具2-4花；花梗長2-4毫 米，中下部具關節；花被5深裂，淡綠色，雄花花被片具綠色中脈，無翅，雄蕊8,比花被長； 雌花花被片外面3片背部具翅，果時增大，翅擴展下延，花柱3,柱頭流蘇狀。瘦果卵形，具 3稜，長4-5毫米，黑褐色，有光澤，包於宿存花被內。花期8-9月，果期9-10月。產陝西南 部、甘肅南部、華東、華中、華南、四川、雲南及貴州；生山坡灌叢、山谷、路旁、田邊溼地，海拔 140-2000米。朝鮮、日本也有。根狀莖供藥用，有活血、散瘀、通經、鎮咳等功效。
[0003] 虎杖根莖富含虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃酚、大黃酸槲皮素、槲皮素-3-阿拉 伯糖甙、槲皮素-3-半乳糖甙等，其提取物廣泛用於醫藥、保健品、化妝品等黃頁，國際市場 需求空間很大。而據統計提取1噸白藜蘆醇需要消耗500噸虎杖原料，但白藜蘆醇在植物 體內含量普遍較低。
[0004] 多年來，虎杖主要靠野外採挖。據統計，虎杖再生量為9. 8*106kg/年，其可持續採 挖量為4. 95*106kg/年，市場需求量為6. 0*106kg/年。因此，虎杖的野生資源已面臨過度採 挖的局面。長期的掠奪式地採挖還會加快野生資源的滅絕速度。虎杖以根狀莖入藥，目前 雖有人工種植，但虎杖主要靠根莖繁殖和種子繁殖，而根莖繁殖，易造成根的生長量和採挖 量降低；種子繁殖，據野外觀察虎杖種子很少成熟發芽成苗。因此，為保證藥用植物的可持 續利用，利用植物組織培養技術，能迅速緩解我國傳統醫學當今中草藥虎杖資源短缺問題， 且佔用空間小。採用植物組織培養技術，可以有效快速提高虎杖的繁殖速度和質量，實現虎 杖優質種苗的工廠化育苗，以滿足生產上的需要。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在於提供一種虎杖組織培養快速繁殖的方法，它能夠快速繁殖出大 量適合移栽的優質虎杖種苗，以滿足生產需要，為虎杖人工種植提供一條新的途徑。
[0006] 為實現上述發明目的，本發明採用以下技術方案：
[0007] -種虎杖組織培養快速繁殖的方法，該方法包括以下步驟：
[0008] (1)外植體的選取與滅菌
[0009] 選取健壯、無病蟲害的野生虎杖帶腋芽幼嫩枝條作為外植體，並對其進行消毒處 理，消毒步驟如下：
[0010] 1)對材料進行流水衝洗，洗淨雜質後，用流水衝洗2-3h ;
[0011] 2)在超淨工作檯中先用質量濃度為75%的酒精浸泡30s，然後用無菌水清洗3-5 遍；
[0012] 3)用質量百分含量為0. 1%的HgCl2處理5-6min，然後用無菌水洗衝5-6次；
[0013] 4)用無菌濾紙吸乾水分備用。
[0014] (2)不定芽的誘導
[0015] 將步驟（1)中外植體切成帶芽莖段（長2-3cm)，分別接種於誘導培養基中進行誘 導培養，培養條件：溫度為25±2°C，光照強度1500-20001ux，光照時間14-16h。7天後長 出白色芽點，25d後形成不定芽。其中誘導培養基為MS培養基中含0. 2-2. 5mg/L的6-BA、 0? 1-0. 5mg/L 的 NAA 及 I. 0-5. Omg/L 的 VC，30g/L 蔗糖，6-7g/L 瓊脂粉，pH 值為 5. 8-6. 2。 [0016] (3)不定芽的繼代培養
[0017] 將步驟（2)中培養出的不定芽接種於繼代培養基繼續繼代培養，培養條件：溫度 為25±2°C，光照強度1500-20001UX，光照時間14-16h。7天後長出白色芽點，25d後形成 不定芽。其中誘導培養基為MS培養基中含0. 1-1. Omg/L的6-BA、0. 1-0. 5mg/L的IAA及 0? 1-0. 5mg/L 的 KT，30g/L 蔗糖，6-7g/L 瓊脂粉，pH 值為 5. 8-6. 2。
[0018] ⑷生根培養
[0019] 將步驟（3)中的不定芽剪切成含有2-3個節且帶頂芽的莖段接種於生根培養基 中。培養條件：溫度為25±2°C，光照強度1500-20001UX，光照時間14-16h。IOd後開始長 根，30d後長出大量根。其中生根培養基為MS培養基，該培養基中含0. 3-0. 5mg/L的IBA和 0? 2-0. 6mg/L 的 NAA，30g/L 蔗糖，6-7g/L 瓊脂粉，pH 值為 5. 8-6. 2。
[0020] (5)馴化煉苗
[0021] 帶步驟（4)中生根苗植株長至約4-6cm、生根條數達5-6條，且長度為3-4cm時，將 其移至自然條件下煉苗2d，2d後將其蓋打開繼續煉苗4-5d，備用；
[0022] (6)試管苗的移栽
[0023] 將步驟（5)中馴化好的虎杖植株將其從培養瓶中取出，洗淨根部的培養基。用800 倍50 %的多菌靈可溼性粉劑浸泡2_3h，稍晾乾根部水分即可進行移栽，移栽入經高溫消毒 過的營養土、自然土壤和蛭石體積比〇. 1-1:1-2:0.5-1的混合基質的營養缽並置於溫室 中。並隨時注意保溼，20d後將其直接移栽至大田中。本發明中所述培養基及專業術語 ：
[0024] (I)MS基本培養基為（單位為mg/L) :MS (Murashige and Skoog，1962)包括大量元 素（硝酸銨1650,硝酸鉀1900,二水氯化鈣440,七水硫酸鎂370,磷酸二氫170)可配成20 倍母液，取母液50ml/L ;微量元素（一水硫酸錳22. 3,七水硫酸鋅8. 6,六水氯化鈷0. 025， 無水硫酸銅0. 025,硼酸6. 2,二水鑰酸鈉0. 25,碘化鉀0. 83)配成母液200倍，取母液5ml/ L ;鐵鹽（七水硫酸亞鐵28. 7,乙二胺四乙酸二鈉37. 3)配成母液200倍，取母液5ml/L ;有 機（煙酸0.5,煙酸吡哆醇0.5,鹽酸硫胺素0. 1，甘氨酸2.0)配成母液200倍，取母液5ml/ L，另加肌醇0. lg，蔗糖30g，固體培養基加瓊脂粉6. 5g，本發明中1/2MS固體培養基是大量 元素減半，其餘不變，pH值為5. 8-6. 5。
[0025] (2)本發明中所述激素為6-BA(6_苄基氨基腺嘌呤），NAA(萘乙酸），IAA( B引哚乙 酸），KT(激動素），IBA(吲哚丁酸）。
[0026] (3)本發明所涉及公式的測定方法：
[0027] 1)不定芽誘導率（％)=不定芽發芽數/接種外植體數*100% ;
[0028] 2)不定芽增值率（％) =(分化的不定芽數-接種數）/接種數*100% ;
[0029] 3)不定芽增值倍數=不定芽發芽數/接種不定芽數；
[0030] 4)生根率（％ )=出根條數/接種外植體數*100% ;
[0031] 5)移栽成活率（％) = (移栽試管苗數-死亡試管苗數）/移栽試管苗數*100%。
[0032] 本發明的積極效果體現在：
[0033] (1)本發明中所述的方法快速、高效、成本低，移栽成活率高，便於推廣，遺傳穩定 性好，縮短了虎杖的育苗周期，為今後進行工業化生產提供了可靠地來源和物質基礎。
[0034] (2)通過芽的繁殖進行快速繁殖，保證了遺傳的穩定性，有利於虎杖優良品種的選 育。
[0035] (3)本發明中通過芽的繁殖，不需要經過愈傷組織組織階段，且誘導出的不定芽不 需要經過壯苗階段，大大縮短了虎杖的育苗周期，節約了人力，物力，財力等。
[0036] (4)採用本發明所述的培養方法，不定芽的誘導率可達98. 5%以上，增值率為 99 %以上，增值倍數可達6-9倍，生根率為99. 5 %，平均長度可達3-4cm，生根條數為5-6 條，移栽成活率可達98%以上。 具體實施例
[0037] 實施例1 :
[0038] (1)外植體的選取與滅菌
[0039] 選取健壯、無病蟲害的野生虎杖帶腋芽幼嫩枝條作為外植體，並對其進行消毒處 理，消毒步驟如下：對材料進行流水衝洗，洗淨雜質後，用流水衝洗2_3h ;在超淨工作檯中 先用75 %酒精浸泡30s，無菌水清洗3-5遍；用質量百分含量為0. 1% HgCl2處理5-6min， 無菌水洗衝5-6次；用無菌濾紙吸乾水分備用。
[0040] ⑵不定芽的誘導
[0041] 將步驟（1)中外植體切成帶芽莖段（長2-3cm)，分別接種於誘導培養基中進行 誘導培養，培養條件：溫度為25±2°C，光照強度1500-20001ux，光照時間14-16h。7天後 長出白色芽點，25d後形成不定芽。其中誘導培養基為MS基本培養基+6-BA 2.0mg/L+NAA 0? 5mg/L+VC 3. Og/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 7g/L，pH 值為 5. 8-6. 2。
[0042] (3)不定芽的繼代培養
[0043] 將步驟（2)中培養出的不定芽接種於繼代培養基繼續繼代培養，培養條件：溫度 為25±2°C，光照強度1500-20001UX，光照時間14-16h。7天後長出白色芽點，25d後形成不 定芽。其中誘導培養基為MS基本培養基+6-BAO. 8g/L+IAA0. 4mg/L+KT0. 5mg/L+蔗糖30g/ L+ 瓊脂粉 7g/L，pH 值為 5. 8-6. 2。
[0044] (4)生根培養
[0045] 將步驟（3)中的不定芽剪切成含有2-3個節且帶頂芽的莖段接種於生根培養基 中。培養條件：溫度為25±2°C，光照強度1500-20001UX，光照時間14-16h。IOd後開始長 根，30d後長出大量根。其中生根培養基為1/2MS培養基中+IBAO. 4mg/L+NAA0. 4mg/L+30g/ L蔗糖+7g/L瓊脂粉，pH值為5. 8-6. 2。
[0046] (5)馴化煉苗
[0047] 將步驟（4)中生根苗植株長至約4-6cm、生根條數達5-6條，且長度為3-4cm時，將 其移至自然條件下煉苗2d，2d後將其蓋打開繼續煉苗4-5d，備用；
[0048] (6)試管苗的移栽
[0049] 將步驟（5)中馴化好的虎杖植株將其從培養瓶中取出，洗淨根部的培養基。用800 倍50 %的多菌靈可溼性粉劑浸泡2-3h，稍晾乾根部水分即可進行移栽，移栽入經高溫消毒 過的營養土、自然土壤和蛭石體積比1:2:0. 5的混合基質的營養缽並置於溫室中。並隨時 注意保溼，20d後將其直接移栽至大田中。
[0050] 實施例2 :
[0051] (1)外植體的選取與滅菌
[0052] 選取健壯、無病蟲害的野生虎杖帶腋芽幼嫩枝條作為外植體，並對其進行消毒處 理，消毒步驟如下：對材料進行流水衝洗，洗淨雜質後，用流水衝洗2_3h ;在超淨工作檯中 先用75 %酒精浸泡30s，無菌水清洗3-5遍；用0. 1% HgCl2處理5-6min，無菌水洗衝5-6 次；用無菌濾紙吸乾水分備用。
[0053] (2)不定芽的誘導
[0054] 將步驟（1)中外植體切成帶芽莖段（長2-3cm)，分別接種於誘導培養基中進行誘 導培養，培養條件：溫度為25±2°C，光照強度1500-20001ux，光照時間14-16h。7天後長出 白色芽點，25d後形成不定芽。其中誘導培養基為MS基本培養基+6-BA2. 5mg/L+NAA 0. 5mg/ L+VC 3. Og/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 7g/L，pH 值為 5. 8-6. 2。
[0055] (3)不定芽的繼代培養
[0056] 將步驟（2)中培養出的不定芽接種於繼代培養基繼續繼代培養，培養條件：溫度 為25±2°C，光照強度1500-20001UX，光照時間14-16h。7天後長出白色芽點，25d後形成不 定芽。其中誘導培養基為MS基本培養基+6-BAO. 8g/L+IAA0. 5mg/L+KT0. 5mg/L+蔗糖30g/ L+ 瓊脂粉 7g/L，pH 值為 5. 8-6. 2。
[0057] (4)生根培養
[0058] 將步驟（3)中的不定芽剪切成含有2-3個節且帶頂芽的莖段接種於生根培養基 中。培養條件：溫度為25±2°C，光照強度1500-20001UX，光照時間14-16h。IOd後開始長 根，30d後長出大量根。其中生根培養基為1/2MS培養基中+IBAO. 3mg/L+NAA0. 3mg/L+30g/ L蔗糖+7g/L瓊脂粉，pH值為5. 8-6. 2。
[0059] (5)馴化煉苗
[0060] 帶步驟（4)中生根苗植株長至約4-6cm、生根條數達5-6條，且長度為3-4cm時，將 其移至自然條件下煉苗2d，2d後將其蓋打開繼續煉苗4-5d，備用；
[0061] (6)試管苗的移栽
[0062] 將步驟（5)中馴化好的虎杖植株將其從培養瓶中取出，洗淨根部的培養基。用800 倍50 %的多菌靈可溼性粉劑浸泡2_3h，稍晾乾根部水分即可進行移栽，移栽入經高溫消毒 過的營養土、自然土壤和蛭石體積比〇. 5:1:0. 5的混合基質的營養缽並置於溫室中。並隨 時注意保溼，20d後將其直接移栽至大田中。
[0063] 實施例3 :
[0064] (1)外植體的選取與滅菌
[0065] 選取健壯、無病蟲害的野生虎杖帶腋芽幼嫩枝條作為外植體，並對其進行消毒處 理，消毒步驟如下：對材料進行流水衝洗，洗淨雜質後，用流水衝洗2-3h ;在超淨工作檯中 先用75 %酒精浸泡30s，無菌水清洗3-5遍；用0. 1% HgCl2處理5-6min，無菌水洗衝5-6 次；用無菌濾紙吸乾水分備用。
[0066] (2)不定芽的誘導
[0067] 將步驟（1)中外植體切成帶芽莖段（長2-3cm)，分別接種於誘導培養基中進行 誘導培養，培養條件：溫度為25±2°C，光照強度1500-20001ux，光照時間14-16h。7天後 長出白色芽點，25d後形成不定芽。其中誘導培養基為MS基本培養基+6-BA I. 5mg/L+NAA 0? 5mg/L+VC 3. Og/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 7g/L，PH 值為 5. 8-6. 2。
[0068] (3)不定芽的繼代培養
[0069] 將步驟（2)中培養出的不定芽接種於繼代培養基繼續繼代培養，培養條件：溫度 為25±2°C，光照強度1500-20001UX，光照時間14-16h。7天後長出白色芽點，25d後形成不 定芽。其中誘導培養基為MS基本培養基+6-BAO. 5g/L+IAA0. 3mg/L+KT0. 3mg/L+蔗糖30g/ L+ 瓊脂粉 7g/L，PH 值為 5. 8-6. 2。
[0070] (4)生根培養
[0071] 將步驟（3)中的不定芽剪切成含有2-3個節且帶頂芽的莖段接種於生根培養基 中。培養條件：溫度為25±2°C，光照強度1500-20001UX，光照時間14-16h。IOd後開始長 根，30d後長出大量根。其中生根培養基為1/2MS培養基中+IBAO. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+30g/ L蔗糖+7g/L瓊脂粉，PH值為5. 8-6. 2。
[0072] (5)馴化煉苗
[0073] 帶步驟（4)中生根苗植株長至約4-6cm、生根條數達5-6條，且長度為3-4cm時，將 其移至自然條件下煉苗2d，2d後將其蓋打開繼續煉苗4-5d，備用；
[0074] (6)試管苗的移栽
[0075] 將步驟（5)中馴化好的虎杖植株將其從培養瓶中取出，洗淨根部的培養基。用800 倍50 %的多菌靈可溼性粉劑浸泡2_3h，稍晾乾根部水分即可進行移栽，移栽入經高溫消毒 過的營養土、自然土壤和蛭石體積比1:2:1的混合基質的營養缽並置於溫室中。並隨時注 意保溼，20d後將其直接移栽至大田中。
[0076] 採用本發明中實施例1至實施例3中培養方法培養的虎杖組培苗，不定芽的誘導 率可達98. 5%以上，增值率為99%以上，增值倍數可達6-9倍，生根率為99. 5%，平均長度 可達3-4cm，生根條數為5-6條，移栽成活率可達98%以上。
[0077] 對比例1 :
[0078] 虎杖組織培養快速繁殖的方法步驟同實施例1-3中的培養步驟及其培養條件，僅 改變步驟⑵中各激素及VC的含量中所添加的物質，測定其不同激素水平對虎杖外植體的 誘導不定芽的誘導率。測定結果如下表：
[0079]

【權利要求】
1. 一種虎杖組織培養快速繁殖方法，其特徵在於該方法包括以下步驟： (1) 外植體的選取與滅菌 選取健壯、無病蟲害的野生虎杖帶腋芽幼嫩枝條作為外植體，並對其進行消毒處理； (2) 不定芽的誘導 將步驟（1)中的外植體切成長2-3cm的單芽莖段，分別接種於誘導培養基中進行誘導 培養為不定芽，培養條件為：溫度為25±2°C，光照強度1500-20001UX，光照時間14-16h ; (3) 不定芽的繼代培養 經過步驟（2)誘導的不定芽接種於繼代培養基中，繼續繼代培養，培養條件同步驟 (2)； (4) 誘導生根 經過繼代培養後的虎杖不定芽長至4-6cm後，將其直接誘導生根，將步驟（3)中的不定 芽剪切成含有2-3個節且帶頂芽的莖段接種於生根培養基中，培養條件：溫度為25±2°C， 光照強度1600-2000 lux，光照時間14-16h ; (5) 馴化 帶步驟（4)中生根苗植株長至4-6cm、生根條數達5-6條，且根長度為3-4cm時，將其移 至自然條件下煉苗2d，2d後將其蓋打開繼續煉苗4-5d，備用； (6) 試管苗的移栽 將步驟（5)中馴化好的虎杖植株將其從培養瓶中取出，洗淨根部的培養基；用800倍質 量百分含量為50%的多菌靈可溼性粉劑浸泡2-3h，稍晾乾根部水分即可進行移栽，移栽入 經高溫消毒過的營養土、自然土壤和蛭石體積比0. 1-1:1-2:0. 5-1的混合基質的營養缽並 置於溫室中，並隨時注意保溼，20d後將其直接移栽至大田中。
2. 根據權利要求1中所述的虎杖組織培養快速繁殖的方法，其特徵在於：所述的步驟 (1) 中其消毒處理的具體步驟如下： (1) 對材料進行流水衝洗，洗淨雜質後，用流水衝洗2-3h ; (2) 在超淨工作檯中先用75%酒精浸泡30s，無菌水清洗3-5遍； (3) 用0· 1% HgCl2處理5-6min，無菌水洗衝5-6次； (4) 用無菌濾紙吸乾水分備用。
3. 根據權利要求1中所述的虎杖組織培養快速繁殖的方法，其特徵在於：所述的步驟 (2) 中其不定芽的誘導培養基為 MS+6-BA0. 2-2. 5mg/L+NAA0. 1-0. 5mg/L+VC L 0-5. 0 mg/L， 另加6-7g瓊脂粉，30g蔗糖，pH值為5. 8-6. 2,其中VC添加的作用是防止虎杖不定芽的褐 化。
4. 根據權利要求1中所述的虎杖組織培養快速繁殖的方法，其特徵在於：所述的步驟 (3) 中其不定芽的繼代增殖培養基為 MS+6-BA0. 1-1. 0mg/L+IAA0· 1-0. 5mg/L+KT0. 1-0. 5mg/ L，另加6-7g瓊脂粉，30g蔗糖，pH值為5· 8-6. 2。
5. 根據權利要求1中所述的虎杖組織培養快速繁殖的方法，其特徵在於：所述的步驟 (4) 中其生根培養基為 1/2MS+IBA0. 3-0. 5mg/L+NAA0. 2-0. 6mg/L，另加 6-7g 瓊脂粉，30g 蔗 糖，pH 值為 5. 8-6. 2。
6. 根據權利要求1中所述的虎杖組織培養快速繁殖的方法，其特徵在於：所述步驟（5) 中揭蓋馴化時要隨時注意保溼，以免其缺水死亡。
7.根據權利要求1中所述的虎杖組織培養快速繁殖的方法，其特徵在於：所述步驟（6) 中其混合基質中營養土、自然土壤和蛭石體積比為〇. 1-1:1-2:0. 5-1。
【文檔編號】A01H4/00GK104255502SQ201410526530
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月8日 優先權日:2014年10月8日
【發明者】洪漢君, 熊小燦 申請人:成都市三禾田生物技術有限公司