支原體核酸恆溫擴增方法
2023-04-27 10:27:41 1
支原體核酸恆溫擴增方法
【專利摘要】本發明公開了一種支原體核酸恆溫擴增方法，具體地，本發明方法包括步驟：在反應體系中進行擴增，所述的反應體系中含有擴增支原體的特異性引物對，所述引物可以從極低支原體拷貝數的檢測樣品中擴增出對應於支原體特徵性序列的擴增產物。本發明方法能夠高特異性、高靈敏度、低汙染、快速地對含有支原體RNA的待測樣品進行擴增，尤其適用於對含有生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP的待測樣品進行擴增和檢測，具有檢測效率高，準確度高的特點。
【專利說明】支原體核酸恆溫擴增方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物的生物檢測【技術領域】，具體涉及將特異性靶標捕獲技術和實時 螢光核酸恆溫擴增檢測技術結合的支原體的實時螢光核酸恆溫擴增檢測中使用的引物、探 針及相關試劑盒。
【背景技術】
[0002] 支原體是一類介於細菌與病毒之間的原核細胞微生物，缺少細胞壁，能獨立複製。 寄生於人和其他靈長類動物的泌尿生殖道中，依靠高度特異的寄生機制包括獨特的頂端細 胞器移植並侵入到人類細胞。
[0003] 近年來大量的流行病學資料提示，生殖支原體MG是人類泌尿生殖道的常見病原 體，與許多非淋球菌性尿道炎（NGU)、前列腺炎和盆腔炎等都有關係，是性傳播疾病的病原 體之一。
[0004]目前，MG的主要檢測方法有：培養法、免疫學方法和分子生物學方法等。分離培養 和血清學方法，繁雜費時，無法滿足同時處理大量樣本的需要。分子生物學方法需要經歷幾 十個溫度變化的循環過程，擴增反應時間長，且產物為DNA，易汙染，易受其他因素影響。因 此，開發一種快速、靈敏、特異且不易汙染的試劑盒非常必要。
[0005] 肺炎支原體（mycoplasmapneumoniae,MP)感染不僅引起肺部病變，且能侵入心、 腦、肝、腎等其他器官，引起多種肺外表現。由於感染常無特異性表現，容易與一般的病毒性 感冒相混淆。
[0006]目前，MP的實驗室診斷方法有培養法、免疫學方法和分子生物學方法等。然而，傳 統的MP分離培養需3周甚至更長時間；MP快速培養法是利用MP在選擇性液體培養基中生 長，根據其代謝產物使培養基顏色發生改變的特點來判斷MP是否生長，顯著縮短了MP的培 養時間，一般實驗室均可開展，但在判斷時需要注意假陰性。
[0007] 免疫學方法包括很多，其中冷凝集試驗（cold agglutinin test, CAT)的敏感性及 特異性均不理想。富士明膠顆粒凝集法（polystyrene latex agglutination reaction, PLA)的靈敏度和特異性均提高，操作簡單，價格便宜，無需特殊儀器設備，3小時能出報告， 適合臨床常規檢查。ELISA間接法用於檢測血清中特異性的IgM和IgG抗體，但檢測結果 受免疫系統狀況的影響。
[0008] 分子生物學主要為檢測DNA的PCR法和檢測RNA的恆溫擴增檢測法。PCR屬於 一種核酸體外擴增技術，用寡核苷酸指導的DNA合成的重複循環來實現對靶核酸序列的擴 增。從理論上PCR可將最初的靶DNA擴增109倍。最後可用凝膠電泳或探針雜交檢測擴增 的DNA。除了樣本中的抑制物會影響PCR的敏感性，導致出現假陰性結果外，PCR的另外一 個缺點是由於其本身技術原理的原因，容易造成假陽性汙染。
[0009] 最新發展RNA恆溫擴增技術的是Gen-Probe公司的轉錄介導擴增法（TMA)，其採用 化學發光法進行終點檢測，在檢測中，需要打開反應管進行滅活，在汙染控制上稍顯不足。
[0010]實時突光核酸恆溫擴增檢測技術（Simultaneous AMGlification and Testing， 簡稱SAT)是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時螢光PCR相比，不同之處， 前者檢測體系多了一個逆轉錄反應的步驟，核酸擴增在一個溫度下進行（42°C)，無需熱循 環。採用M-MLV逆轉錄酶和I7RNA聚合酶進行核酸擴增，相對於其它核酸擴增技術，反應抑 制物更少，能有效減少假陰性結果。然而，SAT技術在不同種類病毒的檢測中應用所面臨的 問題各不相同，需要具體分析病毒的特性進行專門設計。目前尚無針對生殖支原體（MG)及 肺炎支原體（MP)的實時螢光核酸恆溫擴增檢測技術的研究報導。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的是提供一種快速，高準確度，汙染易控，設備簡單，成本低的支原體 RNA檢測方法。
[0012] 本發明的第一方面，提供了一種支原體的擴增方法，所述擴增方法包括步驟：在 反應體系中進行擴增，所述的反應體系中含有擴增支原體的特異性引物對，所述引物對包 括：
[0013]T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和
[0014]nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示。
[0015] 在另一優選例中，所述的支原體是生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0016] 在另一優選例中，所述反應體系中還包括M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶。
[0017] 在另一優選例中，所述反應體系還包括待測支原體的特異性捕獲探針。
[0018] 在另一優選例中，所述的待測支原體是生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0019] 在另一優選例中，所述反應體系還包括待測支原體的特異性檢測探針。
[0020] 在另一優選例中，所述的捕獲探針的一端標記螢光基團，另一端標記淬滅基團。
[0021] 在另一優選例中，所述的檢測探針的5'端標記FAM螢光基團，且檢測探針的3'端 標記DABCYL淬滅基團。
[0022] 在另一優選例中，所述檢測探針的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示。
[0023] 在另一優選例中，所述檢測探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 13所示。
[0024] 在另一優選例中，所述的捕獲探針可與生殖支原體MG的靶標核酸（MGRNA)序列 特異結合。
[0025] 在另一優選例中，所述方法還包括：在另一對照反應體系中進行擴增反應。
[0026] 在另一優選例中，所述的對照反應體系中含有所述特異性引物對、MG內標（MG1C RNA)、所述捕獲探針和所述檢測探針。
[0027] 在另一優選例中，所述捕獲探針的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0028] 在另一優選例中，所述的MG檢測探針用於與在I7RNA聚合酶作用下根據所述MG 靶標核酸（MGRNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合。
[0029] 在另一優選例中，所述的反應體系中生殖支原體MG或的拷貝數小於100個，較佳 地為1-50個拷貝，更佳地為1-10個拷貝。
[0030] 在另一優選例中，所述的捕獲探針可與肺炎支原體MP的靶標核酸（MPRNA)序列 特異結合。
[0031] 在另一優選例中，所述方法還包括：在另一對照反應體系中進行擴增反應。
[0032]在另一優選例中，所述的對照反應體系中含有所述特異性引物對、MP內標（MP1C RNA)、所述MP捕獲探針和所述MP檢測探針。
[0033] 在另一優選例中，所述捕獲探針的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0034] 在另一優選例中，所述的MP檢測探針用於與在I7RNA聚合酶作用下根據所述MP 靶標核酸（MPRNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合。
[0035] 在另一優選例中，所述的反應體系中肺炎支原體MP或的拷貝數小於100個，較佳 地為1-50個拷貝，更佳地為1-10個拷貝。
[0036] 在另一優選例中，所述方法還包括步驟：在擴增反應過程之中或之後，檢測待測支 原體的特異性探針發出的螢光信號。
[0037] 在另一優選例中，所述方法為實時螢光核酸恆溫擴增法。
[0038] 在另一優選例中，所述反應體系中還含有待測的生殖支原體或衍生自所述生殖支 原體核酸。
[0039] 在另一優選例中，所述的待測核酸是來自環境樣品或人類泌尿生殖道分泌物的核 酸。
[0040] 在另一優選例中，所述的待測核酸是來自環境樣本或人類泌尿生殖道或呼吸道 分泌物的核酸。
[0041] 本發明的第二方面，提供了一種支原體的非診斷性檢測方法，所述檢測方法包 括：
[0042] 用如本發明第一方面中所述的擴增方法擴增待測樣品；和
[0043] 在擴增反應過程之中或之後，檢測待測支原體的特異性探針發出的螢光信號。
[0044] 在另一優選例中，所述方法還包括設置一個或多個對照組。
[0045] 在另一優選例中，所述對照組包括：陽性對照組、陰性對照組、內標對照組。
[0046] 在另一優選例中，所述的待測支原體是生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0047] 本發明的第三方面，提供了一種支原體的檢測試劑盒，所述試劑盒包括：
[0048] (a)第一容器，以及位於所述容器內的擴增生殖支原體的特異性引物對，所述引物 對包括：
[0049]T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和
[0050]nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示；
[0051] 以及使用說明書。
[0052] 在另一優選例中，所述的試劑盒用於檢測含有生殖支原體（MG)和/或肺炎支原體 (MP)的待測樣品。
[0053] 在另一優選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的一種或多種組分：
[0054](b)捕獲探針；
[0055] (c)檢測探針；
[0056] (d)待測序列的內標序列；和/或
[0057](e)內標檢測探針。
[0058] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括一種或多種酶。
[0059] 在另一優選例中，所述的酶是M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶。
[0060]在另一優選例中，所述M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶存在於一酶液中，所述捕獲 探針存在於一核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和MG檢測探針存在於一檢測液中。
[0061] 在另一優選例中，所述M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶存在於一酶液中，所述捕獲 探針存在於一核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和MP檢測探針存在於一檢測液中。
[0062] 在另一優選例中，所述的內標檢測探針存在於MG檢測液中。
[0063] 在另一優選例中，所述的內標檢測探針存在於MP檢測液中。
[0064] 在另一優選例中，所述MG內標為競爭性內標，並與MG靶標核苷酸（MGRNA)使用 同一對引物07和nT7)。
[0065] 在另一優選例中，所述MP內標為競爭性內標，並與MP靶標核苷酸（MPRNA)使用 同一對引物07和nT7)。
[0066] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括陽性對照和/或陰性對照。
[0067] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括MG陽性對照和/或MG陰性對照。
[0068] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括MP陽性對照和/或MP陰性對照。
[0069] 在另一優選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的一個或多個特徵：
[0070] 所述捕獲探針是與生殖支原體的靶標核酸（MGRNA)序列特異結合的捕獲探針； 和/或
[0071] 所述檢測探針是與根據所述MG靶標核酸（MGRNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特 異結合的MG檢測探針；和/或
[0072] 所述的待測序列的內標序列是MG的內標序列。
[0073] 在另一優選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的一個或多個特徵：
[0074] 所述捕獲探針是與肺炎支原體的靶標核酸（MPRNA)序列特異結合的捕獲探針； 和/或
[0075] 所述檢測探針是與根據所述MP靶標核酸（MPRNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特 異結合的MP檢測探針；和/或
[0076] 所述的待測序列的內標序列是MP的內標序列。
[0077] 在另一優選例中，所述的捕獲探針和/或所述的MG檢測探針還可與生殖支原體MG 的靶標核酸（MGRNA)序列特異結合。
[0078] 在另一優選例中，所述的捕獲探針和/或所述的MP檢測探針還可與肺炎支原體MP 的靶標核酸（MPRNA)序列特異結合。
[0079] 在另一優選例中，所述試劑盒包含以下組分：裂解液、核酸提取液、洗滌液、MG反 應液、MG檢測液、SAT酶液、MG陽性對照、MG陰性對照和MG內標；
[0080] 其中，
[0081] 所述裂解液包括硫酸銨（(NH4) 2S04)和HEPES;
[0082] 所述核酸提取液包括捕獲探針和磁珠；
[0083] 所述洗滌液包括NaCl和SDS;
[0084] 所述MG反應液包括dNTP和NTP;
[0085] 所述MG檢測液包括17引物、n!7引物、MG檢測探針和內標檢測探針；
[0086] 所述SAT酶液包括M-MLV反轉錄酶、T7RNA聚合酶；
[0087] 所述MG陽性對照包括含生殖支原體16SRNA的體外轉錄RNA稀釋物；
[0088] 所述的MG陰性對照是不含有生殖支原體靶標核酸（MGRNA)序列或不含有生殖支 原體的溶液，較佳地，所述的陰性對照是生理鹽水；
[0089] MG內標：含MG內標RNA(MGICRNA，序列如SEQIDN0:7所示）稀釋物。
[0090] 在另一優選例中，所述試劑盒包含以下組分：裂解液、核酸提取液、洗滌液、MP反 應液、MP檢測液、SAT酶液、MP陽性對照、MP陰性對照和MP內標；
[0091] 其中，
[0092] 所述裂解液包括硫酸銨（(NH4) 2S04)和HEPES;
[0093] 所述核酸提取液包括捕獲探針和磁珠；
[0094] 所述洗滌液包括NaCl和SDS;
[0095] 所述MP反應液包括dNTP和NTP;
[0096] 所述MP檢測液包括17引物、n!7引物、MP檢測探針和內標檢測探針；
[0097] 所述SAT酶液包括M-MLV反轉錄酶、T7RNA聚合酶；
[0098] 所述MP陽性對照包括含肺炎支原體16SRNA的體外轉錄RNA稀釋物；
[0099] 所述的MP陰性對照是不含有肺炎支原體祀標核酸（MPRNA)序列或不含有肺炎支 原體的溶液，較佳地，所述的陰性對照是生理鹽水；
[0100] MP內標：含MP內標RNA(MPICRNA，序列如SEQIDN0:14所示）稀釋物。
[0101]在另一優選例中，所述試劑盒包括A盒和B盒，其中，
[0102] A盒為標本處理單元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液；
[0103] B盒為核酸擴增檢測單元，包括所述MG反應液、MG檢測液、SAT酶液、MG陽性對照、 MG陰性對照及MG內標。
[0104] 在另一優選例中，所述試劑盒包括A盒和B盒，其中，
[0105] A盒為標本處理單元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液；
[0106] B盒為核酸擴增檢測單元，包括所述MP反應液、MP檢測液、SAT酶液、MP陽性對照、 MP陰性對照及MP內標。
[0107] 在另一優選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的一個或多個特徵：
[0108] 所述檢測探針包括如SEQIDN0:5所示的核苷酸序列；和/或
[0109] 所述的捕獲探針包括如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；和/或
[0110] 所述的待測序列的內標序列包括如SEQIDN0:7所示的核苷酸序列；和/或
[0111] 所述的內標檢測探針包括如SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；
[0112] 或所述的試劑盒包括選自下組的一個或多個特徵：
[0113] 所述檢測探針包括如SEQIDN0:13所示的核苷酸序列；和/或
[0114] 所述的捕獲探針包括如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；和/或所述的待測序列 的內標序列包括如SEQIDN0:14所示的核苷酸序列；和/或
[0115] 所述的內標檢測探針包括如SEQIDN0:6所示的核苷酸序列。
[0116] 本發明的第四方面，提供了一種擴增支原體的特異性引物對，所述引物對包括：
[0117] T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和
[0118] nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示。
[0119] 在另一優選例中，所述的支原體優選為生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0120] 本發明的第五方面，提供了一種如本發明第三方面所述的試劑盒或本發明第四方 面所述的引物對的用途，其特徵在於，用於檢測在環境微生物樣品或人類泌尿生殖道分泌 物或人類呼吸道分泌物樣品中是否存在支原體。
[0121] 在另一優選例中，所述的環境微生物樣品包括：水源、貝類等水產品、水果和蔬菜 等即食性食品、色拉，或其組合。
[0122] 在另一優選例中，所述的人類泌尿生殖道分泌物樣本包括尿液、男性尿道分泌物、 前列腺液、精液、尿液離心沉澱物，宮頸和陰道分泌物；所述的人類呼吸道分泌物樣本包括 痰液、胸膜積液、支氣管肺泡灌洗物、氣管吸液。
[0123] 在另一優選例中，所述的支原體是生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0124] 應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在 此不再一一累述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0125] 圖1為比對組MG的引物對和探針序列的螢光檢測結果；
[0126] 圖2為本發明組MG的引物對序列的螢光檢測結果；
[0127] 圖3為比對組MP的引物對和探針序列的螢光檢測結果；
[0128] 圖4為本發明組MP的引物對序列的螢光檢測結果；
[0129] 圖5為MG臨床拭子樣本SAT檢測的靶標螢光檢測結果；
[0130] 圖6為MG臨床拭子樣本SAT檢測的內標螢光檢測結果；
[0131] 圖7為MG臨床拭子樣本SAT檢測的熔解曲線圖；
[0132] 圖8為MP臨床咽拭子樣本SAT檢測的靶標螢光檢測結果；
[0133] 圖9為MP臨床咽拭子樣本SAT檢測的內標螢光檢測結果；
[0134] 圖10為MP臨床咽拭子樣本SAT檢測的熔解曲線圖。
【具體實施方式】
[0135] 本發明人經過長期而深入的研究，經過大量篩選和驗證，開發了一種高特異性，高 靈敏度，且能夠用於多種支原體核酸擴增的引物對。使用該特定的引物序列對支原體的核 酸進行擴增，具有高特異性，高靈敏等優異優點，可以用於準確地檢測一系列支原體。基於 上述發現，發明人完成了本發明。
[0136] 引物
[0137] 如本文所用，術語"擴增支原體的特異性引物"指這樣的引物（對），它擴增出的擴 增產物具有支原體的互補鏈序列。優選的引物序列包括如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4組 成的引物對，所述的引物對可以用於擴增支原體的RNA序列，較佳地可以用於擴增生殖支 原體和/或肺炎支原體的靶標核酸序列，可以用於單一支原體的檢測或多種支原體的總量 檢測。
[0138] 本發明的引物序列設計包括使用DNAStar、DNAMAN軟體和人工設計，得到支原體 通用的引物序列。
[0139] 在引物設計過程中，產生了諸多對支原體通用引物序列，比如17-2引物序列
【權利要求】
1. 一種支原體的擴增方法，其特徵在於，所述擴增方法包括步驟：在反應體系中進行 擴增，所述的反應體系中含有擴增支原體的特異性引物對，所述引物對包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述反應體系還包括待測支原體的特異性 捕獲探針。
3. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述反應體系還包括待測支原體的特異性 檢測探針。
4. 如權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括步驟：在擴增反應 過程之中或之後，檢測待測支原體的特異性探針發出的螢光信號。
5. -種支原體的非診斷性檢測方法，其特徵在於，所述檢測方法包括： 用如權利要求1中所述的擴增方法擴增待測樣品；和 在擴增反應過程之中或之後，檢測待測支原體的特異性探針發出的螢光信號。
6. -種支原體的檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括： (a) 第一容器，以及位於所述容器內的擴增生殖支原體的特異性引物對，所述引物對包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示； 以及使用說明書。
7. 如權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，還含有選自下組的一種或多種組分： (b) 捕獲探針； (c) 檢測探針； (d) 待測序列的內標序列；和/或 (e) 內標檢測探針。
8. 如權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，包括選自下組的一個或多個特徵：所述檢測探針包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕獲探針包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和/或 所述的待測序列的內標序列包括如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；和/或 所述的內標檢測探針包括如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； 或所述的試劑盒包括選自下組的一個或多個特徵： 所述檢測探針包括如SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕獲探針包括如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；和/或所述的待測序列的內 標序列包括如SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列；和/或 所述的內標檢測探針包括如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
9. 一種擴增支原體的特異性引物對，其特徵在於，所述引物對包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示。
10. 如權利要求6所述的試劑盒或權利要求9所述的引物對的用途，其特徵在於，用於 檢測在環境微生物樣品或人類泌尿生殖道分泌物或人類呼吸道分泌物樣品中是否存在支 原體。
【文檔編號】C12Q1/68GK104342487SQ201310330643
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月31日 優先權日:2013年7月31日
【發明者】王敏, 馬道亮, 湯嘉維, 於明輝, 居金良 申請人:上海仁度生物科技有限公司