以無血培養基製備a群鏈球菌製劑的方法及無血培養基的製作方法

2023-04-27 07:50:46

專利名稱：以無血培養基製備a群鏈球菌製劑的方法及無血培養基的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物發酵工程領域，涉及一種利用無血培養基代替血培養基 製備A群鏈球菌製劑的方法，特別涉及一種以無血培養基製備A群鏈球菌製劑 的方法及無血培養基。
背景技術：
A群鏈球菌製劑又稱OK-432，屬於生物治療藥物，是A群鏈球菌弱毒株經
培養、擴增、青黴素處理後製成的凍幹品，已應用於臨床治療，如癌性胸腹水
及惡性腫瘤的免疫治療等，其性能穩定且抗癌療效顯著。但由於傳統製備工藝
中常用含血及血漿培養基，使該製劑成本相對較高，並且容易帶入異源性物質，
增加熱源物質含量，注射給藥易引起患者的過敏反應。

發明內容
本發明的目的是提供一種以無血培養基製備A群鏈球菌製劑的方法。 本發明的另一 目的是提供一種無血培養基。
以無血培養基製備A群鏈球菌製劑的方法如下 該方法包括以下步驟
(1) 、無血培養基的準備對無血培養基在4500r/min的條件下離心30min、 抽濾，以保證培養基澄清無雜質，然後滅菌待用；
(2) 、傳代在無菌室內開啟A群鏈球菌弱毒株工作種子批，在斜面培養 基上在37。C的條件下，培養20小時傳三代，然後分別接種在無血培養基，在 37°C、 120r/min的條件下振蕩培養20小時製備種子液，在傳代前要進行革蘭氏
染色鏡檢，如發現汙染雜菌則廢棄；
(3) 、製備A群鏈球菌製劑；將制好的生產用種子液接種在無血培養基中， 在37°C、 140r/min的條件下振蕩培養20小時，在接種前要進行革蘭氏染色鏡檢， 如發現汙染雜菌則廢棄；
(4) 、菌體滅活將青黴素和過氧化氫加入培養物內滅活，經過振蕩、45 。C水浴30min， 4500r/min離心30min;
(5) 、產品收集經過菌體滅活後的培養物用生理鹽水懸浮，二次離心後 將沉澱物在-37'C凍幹72小時得到白色菌體乾粉製劑即A群鏈球菌製劑，稱重 後密封保存於無菌瓶中。其中的青黴素由華北製藥集團有限公司生產製造；所 使用的A群鏈球菌為A群鏈球菌ATCC19615 ，由吉林省疾病防止控制中心提供； A群鏈球菌弱毒株工作種子批由吉林大學生命科學技術研究所提供。
上述步驟中
滅菌所用的設備為YXQ-SG41-280高壓滅菌鍋，由上海醫用核子儀器廠生 產製造；
離心所用的設備為RC-3BPLUS低速大容量冷凍離心機，由美國Du Pont公 司生產製造。
振蕩所用的設備為HZQ-Q全溫振蕩器，由哈爾濱東聯電子技術開發有限公 司生產製造；
水浴所用的設備為DK-89-I電子恆溫水浴鍋，由天津市斯泰特一起有限公 司生產製造；
凍幹所用的設備為Lyolab3000冷凍乾燥機，由丹麥生產製造； 鏡檢所用的設備為HK光電顯微鏡，由臺灣OLYMPUS公司生產製造。
無血培養基
無血培養基的優化
重點考察培養基氮源、碳源和能源對菌體生物產量的影響，選擇胰蛋白腖、 葡萄糖和酵母粉含量為考察因素，以生物產量為試驗指標，設計均勻實驗，實 驗結果進行偏最小二乘回歸建模確定最佳配比。
經過回歸分析可得出最佳培養基重量配比為胰蛋白腖1.2%、葡萄糖0.9%、 酵母粉0.4%、氯化鈉0.5%、磷酸二氫鉀0.5%、其餘為水；pH值為7.4 7.6。其 中的胰蛋白腖及酵母粉由英國OXID公司生產製造。試驗設計及結果如表1所 示。
表l優化實驗設計及結果
x2x3實驗指標 y(g/1)
實驗號l胰蛋白腖 (%)2葡萄糖 (%)3酵母粉 (o/o)11(0.5)2(0.4)3(0.25)0.1745
22(0.75)4(0.6)6(0.4)0.1825
33(1.0)6(0.8)2(0.2)0.1785
44(1.25)1(0.3)5(0.35)0.2730
5(1.5)3(0.5)1(0.15)0.2750
66(1.75)5(0.7)4(0.3)0.3120
77(2.0)7(0.9)7(0.45)0.3095
實驗結果進行偏最小二乘回歸建模分析，得到最優指標因素組合為: xl，2。/。;x2,0.9。/。;x3,0.4。/。;最優組合目標函數y=0.3435g/l。
得到如下二次多項式回歸模型
y^.4594081國0.083747x廣0.540402x2-0.458285x3+0.010952x!2+0.221875x22+0.0030 65x32 +0.097986乂^2+0.130168乂^3+0麓083乂詢；
同時得到Press值和誤差分析圖，從圖1可知，在考察氮源、碳源和能源三 個組分(3個潛變量)時，Press值最小且誤差最小，說明回歸模型的擬合程度 較好。
A群鏈球菌在無血培養基和含血培養基中的生長情況及形態特徵
對不同培養基的種子液和發酵液中的菌體分別進行革蘭氏染色鏡檢，通過 觀察，菌體細胞呈圓形或卵圓形，直徑0.5 2.0um，在液體培養基中，以成對 或鏈狀出現，不運動，不生芽孢，革蘭氏陽性，視野內無雜菌。從圖2中的對 比可知，A群鏈球菌在無血培養基與含血培養基上的形態均符合A群鏈球菌的 形態特徵，這說明A群鏈球菌在無血培養基上生長良好。
本發明的有益效果是利用無血培養基代替含血培養基培養製備A群鏈球
菌製劑，降低了製劑中潛在的異源性物質，避免使用血液成分還能有效降低培
養基成本；利用數學建模對無血培養基優化進行實驗設計，對試驗結果進行統
計分析，簡化了實驗步驟，得到培養基最佳重量配比，保證了製劑生物產量不
減少和產量的穩定性。


圖1為本發明的潛變量個數與Press值(a)及誤差(b)關係圖。
圖2為A群鏈球菌在無血培養基(a)及含無血培養基(b)內的生長形態。
具體實施例方式
方法實施例包括以下步驟 (1)、無血培養基的準備將無血培養基在4500r/min的條件下離心30min， 抽濾，以保證培養基澄清無雜質，然後滅菌待用；
(2)、傳代在無菌室內開啟A群鏈球菌弱毒株工作種子批，在斜面培養基 上在37。C的條件下，培養20小時傳三代，然後分別接種在無血培養基，在37 。C、 120r/min的條件下振蕩培養20小時製備種子液，在傳代前要進行革蘭氏染 色鏡檢，如發現汙染雜菌則廢棄；
(3) 、製備A群鏈球菌製劑；將制好的生產用種子液接種在無血培養基中， 在37°C、 140r/min的條件下振蕩培養20小時，在接種前要進行革蘭氏染色鏡檢， 如發現汙染雜菌則廢棄；
(4) 、菌體滅活將青黴素和過氧化氫加入培養物內滅活，經過振蕩、45 。C水浴30min， 4500r/min離心30min;
(5) 、產品收集經過菌體滅活後的培養物用生理鹽水懸浮，二次離心後 將沉澱物在-37"C凍幹72小時得到白色菌體乾粉製劑即A群鏈球菌製劑，稱重 後密封保存於無菌瓶中。
無血培養基實施例l:
按胰蛋白腖1.0%、葡萄糖0.8%、酵母粉0.2%、氯化鈉0.5°/。、磷酸二氫鉀 0.5%、其餘為水;pH值為7.4比例配製培養基，按回歸方程計算生物產量為0.2055 g/1。實際試驗中得到生物產量為0.1997 g/1同等配比的含血培養基生物產量為 0.2010 g/1 。
無血培養基實施例2:
按胰蛋白腖0.8%、葡萄糖0.7%、酵母粉0.3%、氯化鈉0.5%、磷酸二氫鉀 0.5%、其餘為水；pH值為7.5比例配製培養基，按回歸方程計算生物產量為 0.3240g/l。實際試驗中得到生物產量為0.3302 g/1同等配比的含血培養基生物產量為0.3260 g/1 。
無血培養基實施例3:
按胰蛋白腖1.2%、葡萄糖0.9%、酵母粉0.4%、氯化鈉0.5%、磷酸二氫鉀 0.5%、其餘為水；pH值為7.6比例配製培養基，按回歸方程計算生物產量為 0.2389g/l。實際試驗中得到生物產量為0.2410 g/1同等配比的含血培養基生物產 量為0.2410g/1 。
權利要求
1、一種以無血培養基製備A群鏈球菌製劑的方法，該方法包括以下步驟無血培養基的準備將無血培養基在4500r/min的條件下離心30min、抽濾，以保證培養基澄清無雜質，然後滅菌待用；傳代在無菌室內開啟A群鏈球菌弱毒株工作種子批，在斜面培養基上在37℃的條件下，培養20小時傳三代，然後分別接種在無血培養基，在37℃、120r/min的條件下振蕩培養20小時製備種子液，在傳代前要進行革蘭氏染色鏡檢，如發現汙染雜菌則廢棄；製備A群鏈球菌製劑；將制好的生產用種子液接種在無血培養基中，在37℃、140r/min的條件下振蕩培養20小時，在接種前要進行革蘭氏染色鏡檢，如發現汙染雜菌則廢棄；菌體滅活將青黴素和過氧化氫加入培養物內滅活，經過振蕩、45℃水浴30min，4500r/min離心30min；產品收集經過菌體滅活後的培養物用生理鹽水懸浮，二次離心後將沉澱物在-37℃凍幹72小時得到白色菌體乾粉製劑即A群鏈球菌製劑，稱重後密封保存於無菌瓶中。
2、 一種用於製備權利要求1所述的A群鏈球菌製劑的無血培養基，其重 量配比為胰蛋白腖1.2%、葡萄糖0.9%、酵母粉0.4%、氯化鈉0.5%、磷酸二 氫鉀0.5%、其餘為水；pH值為7.4 7.6。
全文摘要
本發明公開了一種以無血培養基製備A群鏈球菌製劑的方法及無血培養基，該方法是將A群鏈球菌弱毒株工作種子批經過傳代，在無血培養基中製備種子液及培養，所得培養物經過菌體滅活、凍幹工序得到白色菌體乾粉製劑即A群鏈球菌製劑的過程；所用無血培養基重量配比為胰蛋白腖1.2％、葡萄糖0.9％、酵母粉0.4％、氯化鈉0.5％、磷酸二氫鉀0.5％、其餘為水，pH值為7.4～7.6；本發明利用無血培養基代替含血培養基培養製備A群鏈球菌製劑，降低了製劑中潛在的異源性物質，避免使用血液成分還能有效降低培養基成本；該重量配比的培養基保證了製劑生物產量不減少和產量的穩定性。
文檔編號C12R1/46GK101096647SQ20071005572
公開日2008年1月2日 申請日期2007年6月6日 優先權日2007年6月6日
發明者盧日峰, 吳戰宇, 邱芳萍, 維 郎 申請人:長春工業大學