用於生產重組促性腺激素的無血清培養基的製作方法
2023-05-17 09:32:01
專利名稱：：用於生產重組促性腺激素的無血清培養基的製作方法用於生產重組促性腺激素的無血清培養基發明領域本發明屬於重組蛋白製造領域。更具體說，本發明涉及含抗氧化劑的無血清培養基在生產重組二聚體促性腺激素中的用途。所述抗氧化劑可選自L-穀胱苷肽、2-巰基乙醇、L-甲硫氨酸、及抗壞血酸和(+)-a-生育酚的組合。發明背景本發明涉及重組促卵泡激素(FSH)的生產。FSH屬於促性腺激素類。可用FSH來治療男性和女性患者的不育和生殖疾病。採用FSH誘導女性患者排卵(OI)和受控性超排卵(COH)，例如輔助生殖技術(ART)。在誘導排卵的典型治療方案中，患者每日注射給予FSH或其衍生物(每日約75-300IU的RFSH),時間約為6-12天。在受控性超排卵的典型治療方案中，患者每日注射給予FSH或其衍生物(每日約150-600IU的RFSH)，時間約為6-12天。還採用FSH誘導患有少精液症男性產生精子。採用每周3次150IU的FSH聯合每周2次2500IUhCG的治療方案己成功使患有低促性腺激素性性腺功能減退的男性精子數量得到提高。鑑於FSH在治療生育疾病中的重要性，提供高穩定性和高比活性的FSH成為當務之需。FSH天然由腦垂體腺產生。為了藥學應用，可用重組方法產生FSH(rFSH)或可從絕經期後的女性尿液中分離獲得(uFSH)。製備rFSH的過程必然有二個主要步驟:培養基因工程改造的表達FSH的細胞，和純化該蛋白質。然後將該蛋白與藥物學上可接受的運載體一起配製而獲得藥物組合物。為了培養細胞，過去通常在培養基中添加作為所有哺乳動物細胞系生長和維持的通用營養物的血清。但是，潛伏期或培育期長的傳染性牛神經變性疾病一牛海綿樣腦病(BSE)的出現引起了監管方(regulatory)對生物學活性產品生產中使用動物來源血清的關注。因此，目前優先採用無血清培養基來生產重組蛋白。這種培養基為本領域內所熟知，已有多家公司有商品供應，例如Sigma(西格馬)、BioWhittaker(百歐懷塔克)、GibcoBRL(吉比蔻)、Cambrex(凱布萊克司)和JRH。在貯藏rFSH時所遭遇的問題之一是存在FSH的氧化形式。為部分地解決這個問題，可在此藥物組合物中添加抗氧化劑使FSH蛋白在將其給予需要治療的患者之前穩定貯藏。例如，歐盟專禾UEP0853945(Skrabanja和VandenOetelaar,1998)描述了將含促性腺激素的液體製劑與穩定劑(例如，25-100mM的檸檬酸鈉和l-10mM的L-甲硫氨酸)相混合的方法。已證明這種劑型使FSH製劑得以長期貯藏。專利WO92/15614(TakruriH,1992)也提及抑制液體或半液體藥物組合物(例如貯存培養基或眼用水性溶液)中多肽氧化的方法。更具體說，WO92/15614顯示含濃度10mg/L的L-甲硫氨酸的眼藥水或眼用軟膏能穩定人表皮生長因子。然而上述文獻只公開了抗氧化劑在藥物製劑中的應用，沒有提及在培養基中的應用。也可在培養基中加入具有抗氧化活性的胺基酸和化合物，作為營養成分或可保護細胞系防止細胞死亡。例如美國專利N0.4,560,655公開了一種含濃度約30mg/L的L-甲硫氨酸的無血清培養基，可用這種培養基培養豬睪丸細胞、AG14骨髓瘤細胞和鼠脾細胞。專利WO95/12664描述了一種在特定細胞系中克服由於各種生長限制因子量不足所致危害的方法，這些生長限制因子之一為胺基酸甲硫氨酸。更具體說，W095/12664描述了一種使表達人M-CSF的CHOE5F3G細胞系適應細胞高密度生長的方法。在此法中，CHOE5F3G細胞在含有104mg/L的L-甲硫氨酸的培養基中生長(參見實施例和表2)。Yun等描述了在培養基中加入穀胱苷肽和鐵螯合劑的組合能減少CHO細胞的細胞死亡(Yun等，2003)。Saito等也描述了培養基中可採用多種抗氧化劑以保護細胞系防止細胞死亡(Saito等，2003)。然而，WO95/12664、美國專利NO.4,560,655、Yun等和Saito等都沒有提到胺基酸、穀胱苷肽和鐵螯合劑對細胞系所產生的重組蛋白氧化狀態的潛在影響(如果有任何影響的話)。總之，這些文獻只公開了採用L-甲硫氨酸或穀胱苷肽與鐵螯合劑組合來促進培養細胞的生長和/或活力。WO99/50390涉及用於由白細胞生產幹擾素-ot的培養基，所述培養基含甲硫氨酸。HPLC證明了由於培養基中加入了甲硫氨酸，純化後的幹擾素-a蛋白質量得到提高。WO99/50390的發明人假定這種提高可能是由於減少了幹擾素-a蛋白的氧化。WO99/50390還說明了甲硫氨酸用量太低導致效力降低，而用量太高可導致幹擾素產率降低。具體說，WO99/50390教導了用白細胞生產幹擾素-oc時，濃度範圍約為50-100mg/L是特別優選的範圍。另外，WO99/50390隻考慮了生產單體蛋白質幹擾素-a的培養基。WO99/503卯既沒有提及也沒有提出生產二聚體激素(例如只在二聚體化後才能分泌的FSH)的培養基(Matzuk等，綜上所述，上述文獻都沒有涉及在無血清培養基中採用抗氧化劑來減少二聚體促性腺激素的氧化。發明概述本發明依據在製備rFSH過程中意外發現細胞培養上清液中出現氧化形式的rFSH。而且，用無血清培養基生產rFSH可導致比用含血清培養基生產rFSH更高水平的氧化形式。在本發明的框架中，我們驚奇地發現不僅可在貯藏過程中而且可在培養步驟中降低氧化形式rFSH水平。實現這種降低不會損害產量。可通過在培養基中加入抗氧化劑來實現這種降低。具體說，已發現在培養表達rFSH的細胞過程中在無血清培養基中添加(i)2-巰基乙醇、(ii)抗壞血酸和(+)-a-生育酚的組合，(iii)L-甲硫氨酸，或(iv)L-穀胱苷肽中的任一種可以降低氧化形式rFSH水平。因此，本發明第一方面涉及無血清培養基在生產重組二聚體促性腺激素中的用途，其特徵在於，所述培養基包含一種選自以下的抗氧化劑-濃度範圍約l-20mg/L的L-穀胱苷肽；-濃度範圍約5-15mg/L的2-巰基乙醇；-濃度範圍約200-500mg/L的L-甲硫氨酸；和-濃度範圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度範圍約5-25mg/L的(+)-a-生育酚的組合。本發明第二方面涉及在重組二聚體促性腺激素的製備過程中減少氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法，其特徵在於，用含抗氧化劑的無血清培養基培養表達所述重組二聚體促性腺激素的細胞。本發明第三方面涉及一種用於生產重組二聚體促性腺激素的無血清培養基，其特徵在於，所述培養基包含一種選自以下的抗氧化劑-濃度範圍約l-20mg/L的L-穀胱苷肽；-濃度範圍約5-15mg/L的2-巰基乙醇；-濃度範圍約200-500mg/L的L-甲硫氨酸；和-濃度範圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度範圍約5-25mg/L的(+)-a-生育酚的組合。發明詳述本發明源自發現在含有抗氧化劑的無血清培養基中培養表達rFSH的細胞能顯著減少氧化形式rFSH水平。如實施例3中所示，在培養過程中(i)2-巰基乙醇、(ii)抗壞血酸和(+)-a-生育酚的組合物，(iii)L-甲硫氨酸，或(iv)L-穀胱苷肽中的任何一種都特別有利於減少氧化形式的rFSH水平。重要的是實現這種減少並不損害細胞的活力和代謝，也不破壞rFSH的滴度。因此，本發明第一方面涉及無血清培養基在生產重組二聚體促性腺激素中的用途，其特徵在於，所述培養基包括選自以下的抗氧化劑-濃度範圍約l-20mg/L的L-穀胱苷肽；-濃度範圍約5-1511^/1^的2-巰基乙醇；-濃度範圍約200-50011^1的1^甲硫氨酸；和-濃度範圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度範圍約5-25mg/L的(+)-ot-生育酚的組合。本發明的無血清培養基優選包含濃度範圍約1、1.5、2-至約4、5、6、7、8、9、10、15或20mg/L的L-穀胱苷肽。此無血清培養基最優選包含濃度約2.5或3mg/L的L-穀胱苷肽。本文中的"穀胱苷肽"與"L-穀胱苷肽"可互換使用。本發明的無血清培養基優選包含濃度範圍約5、6、7、8、9-至約11、12、13、14或15mg/L的2-巰基乙醇。此無血清培養基最優選包含濃度約10mg/L的2-巰基乙醇。本發明的無血清培養基優選包含濃度範圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度範圍約5-25mg/L的(+)-a-生育酚的組合。這種培養基更優選包含濃度範圍約為5、8、10或12至約16、18、20、22或25mg/L的(+)-a-生育酚和濃度範圍約為15、20或25至約35、40或45mg/L的抗壞血酸。這種無血清培養基最優選包含濃度約14mg/L的(+)-a-生育酚和濃度約30mg/L的抗壞血酸。本文中的"(+)-a-生育酚"可與"維生素A"互換使用，"抗壞血酸"可與"L-抗壞血酸"互換使用。本發明的無血清培養基優選包含濃度範圍約200、205、210、215、220、225、230、235、240或245至約300、325、350、375、400、425、450、475或500mg/L的甲硫氨酸。此無血清培養基最優選包含濃度約250mg/L的L-甲硫氨酸。本文中，"甲硫氨酸"可以與"L-甲硫氨酸"互換使用。任何無血清培養基中都可以添加本發明的抗氧化劑。本發明可採用可購得的商品化無血清培養基，例如，SFM90(JRH,67350)、SFM90.1(JRH,67350)、Supmed3007或改良的Supmed300(JRH,67350)、DMEM(吉比蔻,Gibco,7490571)、DMEM/F12(吉比蔻,Gibco,99.5043)、SFMCHO3a(百歐懷塔克,BioWhittaker)、CHOPFM(西格馬,Sigma,C6970)、ProCH05;EX-CELL培養基例如EX-CELL302(JRH,產品目錄號14312-1000M)或EX-CELL325(JRH,產品目錄號14335-1000M);CHO-CD3(西格馬,Sigma,產品目錄號:C-1490)、CHOIIIPFM(吉比蔻，Gibco,產品目錄號96-0334SA)、CHO-S-SFMII(吉比蔻，Gibco，產品目錄號12052-098)、CHO-DHFR(西格馬,Sigma，產品目錄號:C-8862)、ProCHO5(凱布萊克司,Cambrex,產品目錄號:BE12-766Q)、SFM4CHO(海克隆，HyClone,產品目錄號:SH30549.01)、UltraCHO(凱布萊克司,Cambrex,產品目錄號12-724Q)、HyQPFCHO(海克隆,HyClone，產品目錄號:SH30220.01)、HyQSFXCHO(海克隆,HyClone,產品目錄號:SH30187.01)、HyQCDM4CHO(海克隆，HyClone,產品目錄號:SH30558.01)、ISCHO-CD(歐文科學,IrvineScientific,產品目錄號:#91119)、ISCHO-V(歐文科學,IrvineScientific,產品目錄號:#9197)和它們的衍生物。SFM90、SFM90.1、S叩Med300、DMEM、DMEM/F12、SFMCHO3a和CHPPFM的組合物也可以用於本發明，見下表l中所示。表l:本發明框架內可使用的五種可購得商品化無血清培養基的組成tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12在本發明的一優選實施方案中，此無血清培養基為化學成分明確的培養基，即以純化的成分配製的培養基，因此知道其確切的成分組成。具體說，此化學成分明確的培養基既不含有動物源成分也不含有不明確的水解產物。可用本發明生產的促性腺激素包括促黃體生成素(LH;OMIM登錄號152780)、促卵泡素(FSH;OMIM登錄號136530)、絨毛膜促性腺激素，(CG;OMIM登錄號118860)和促甲狀腺激素(TSH;OMIM登錄號188540)。促性腺激素是二聚體激素。這些激素中的每一種都是由a和P亞基構成的非共價二聚體。所有四種激素的a亞基相同(OMIM登錄號118850)，而P亞基則決定了二聚體的內分泌功能(Talmadge等1983)。在本發明的最優選實施方案中，所述促性腺激素為人FSH。本說明書中所用術語"EM"指一種包含與SwissProt登錄號P01215相對應的a亞基和與SwissProt登錄號P01225相對應的P亞基組成的二聚體蛋白質。由於FSH是可溶性分泌蛋白，可通過其天然信號肽或通過異源信號肽(即源自另一種分泌蛋白的信號肽，其在所用的特定表達系統中可能更有效)而釋放到細胞培養上清液中。術語"FSH"還包括由與SwissProt登錄號P01215相對應的a亞基和與SwissProt登錄號P01225相對應的3亞基構成的二聚體蛋白質的剪接變體、等位變體、突變體、功能衍生物、活性片段、融合蛋白和環狀可取代蛋白(circularlypermutedprotein)。本說明書中所用術語"突變體"指天然FSH或病毒FSH中的一個或多個胺基酸被不同胺基酸所替換、或發生缺失，或在FSH的天然序列中加入了一個或多個胺基酸殘基後產生的產物與野生FSH相比活性無顯著改變的FSH類似物。可採用已知的合成和/或通過定點突變技術或任何其它適用於此的技術來製備這些突變蛋白。本發明的突變體包括由能在嚴緊條件下與編碼FSH的DNA或RNA雜交的核酸(例如DNA或RNA)編碼的蛋白質。術語"嚴緊條件"指本領域普通技術人員通常稱為"嚴緊性"的那些雜交和隨後的洗滌條件(參見，例如Ausubel等，分子生物學的當前親i方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)同上，Interscience,N.Y.，6.3禾n6.4巻，1987,1992)。不受限制，嚴緊性條件的實例包括洗滌條件為在低於計算的所研究雜交體Tm值12-20°C下，用例如2xSSC和0.5°/。SDS洗滌5分鐘，用2xSSC禾fl0.1%SDS洗滌15分鐘；在37°C用0.1xSSC和0.5%SDS洗滌30-60分鐘，在68°C用0.1xSSC和0.5%SDS洗滌30-60分鐘。本領域普通技術人員知道嚴緊性條件還取決於DNA序列、寡核苷酸探針(例如10-40鹼基)或混合寡核苷酸探針的長度。如果採用混合探針，優選採用氯化四甲銨(TMAC)替代SSC。參見Ausubel，同上。在一個優選實施方案中，所述FSH突變蛋白與天然產生FSH的序列至少有40%的相同性。更優選其具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%的相同性，最優選至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性。相同性是通過序列對比反映兩條或多條多肽序列或兩條或多條聚核苷酸序列之間的關係。一般說來，相同性指兩條聚核苷酸或兩條多肽序列分別就做比對的序列長度而言，精確的核苷酸與核苷酸，胺基酸與胺基酸的對應性。對於那些沒有精確對應的序列，可檢測其"相同性百分比"。一般說來，通過排列兩條需對比的序列以獲得序列之間的最大關聯度。這可能包括要在一條或兩條序列中插入"缺口缺口(gap)"以提高排列對齊程度。可檢測要比較的各序列的全長(所謂"總體對比")相同性百分比，這尤其適合於長度相同或非常相似的序列，或較短而長度明確的序列(所謂"局部對比")，更適合於不等長的序列。在本發明的框架內，相同性百分比指檢測要比較的各序列全長的相同性總體百分比。可採用已知的電腦程式來檢測任何具體多肽是否與本發明的序列有一定百分比的相同性。這種計算機算法和程序包括例如有TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA禾PCLUSTALW(Altschul等，1990;Altschul等，1997;Higgins等，1996;Pearson和Lipman，1988;Thompson等，1994)。蛋白和核酸序列同源性優選用本領域眾所周知的局部比對檢索基礎工具(BasicLocalAlignmentSearchTool("BLAST"))進行評價(Altschul等.，19卯；Altschul等.，1997;Karlin和Altschul,1990)。BLAST程序通過鑑定査詢氨基或核酸序列與優選從蛋白質或核酸序列資料庫獲得的測試序列之間的相似區段(本文稱為"高評分區段配對")來鑑定同源序列。高評分區段配對優選通過評分矩陣方法(即比對)來鑑定，這些方法中的許多為本領域所熟知。可採用的評分矩陣可以是BLOSUM62矩陣(Gonnet等，1992;Henikoff和Henikoff,1993)。也可採用PAM或PAM250矩陣(參見例如Schwartz和Dayhoff，編，(1978)檢測距離相關性矩陣蛋白質序列和結構的圖表集(MatricesforDetectingDistanceRelationships:AtlasofProteinSequenceandStructure)，Washington:NationalBiomedicalResearchFoundation)。可用BLAST程序評價所鑑定的所有高評分區段配對的統計學顯著性，和優選那些能滿足用戶的特定顯著性閾值，例如用戶特定的同源性百分比的區段。優選用Karlin統計學顯著性公式評價高評分區段配對的統計學顯著性(Karlin和Altschul,1990)。可在BLAST程序中利用默認參數或用戶提供的修改參數。優選的檢測查詢序列(本發明序列)與目標序列之間最佳全長匹配的方法也稱為全序列比對法，可採用基於Brutlag算法的FASTDB電腦程式檢測(Brutlag等，1990)。在序列比對中查詢序列和目標序列皆為胺基酸序列。所述全長序列比對的結果為相同性百分比。在FASTDB胺基酸比對中所用的優選參數為矩陣二PAMO、k-元組(k-tuple^2、錯配罰分=1、連接罰分=20、隨機化群=25、長度=0、截取分數=1、窗口大小=序列長度、缺口罰分=5、缺口大小罰分=0.05、窗口大小=247或任何更短的目標胺基酸序列長度。如果目標序列因為N-或C-末端缺失而非內部缺失導致其比查詢序列為短，由fFASTDB程序在計算總長相同性百分比時沒有將目標序列N-和C-末端的截取計算在內，必須人工校正其相同性百分比結果。對於N-和C-末端截短的目標序列相對於查詢序列，可通過計算查詢序列與所對應目標序列的N-和C-末端不與對應的目標殘基匹配/對齊的殘基數，作為查詢序列總鹼基的百分數，以校正其相同性百分比。某一殘基是否匹配/對齊取決於FASTDB序列比對的結果。然後從上述用特定參數的FASTDB程序計算出的相同性百分比中減去此百分數，從而獲得最終百分比相同性評分。此最終百分比相同性評分即為用於本發明目的的評分。只有當目標序列的N-和C-末端殘基不與查詢序列匹配/對齊時，即只有當查詢胺基酸殘基超出目標序列最遠端N-和C-末端殘基時，才考慮人工調整此百分比相同性評分。例如，將一條90個胺基酸殘基的目標序列與一條100個殘基的査詢序列作比對檢測相同性百分比。因目標序列的N-末端有缺失，用FASTDB排列比對時N-末端的前幾個殘基不匹配/對齊。這樣10個沒配對的殘基代表了此序列的10%(N-和C-末端沒有配對的殘基數/査詢序列的殘基總數)，故從FASTDB程序所計算出的相同性百分比評分中減去10%。如果其餘90個殘基完全匹配，那麼最終相同性百分比為90%。本發明突變蛋白中的優選變異是稱為"保守性"的替換。FSH的保守性胺基酸替換包括具有充分相似理化性質的同組中成員之間的同義胺基酸替換，因而可保留該分子的生物學功能(Grantham，1974)。已明確還可在上述序列中進行胺基酸的插入和缺失而不會改變其功能，尤其是如果這種插入或缺失只涉及少數胺基酸，例如少於30個，優選少於IO個胺基酸，而不去除或替換對功能構象具有關鍵作用的胺基酸(例如半胱氨酸)時。通過這種插入和/或缺失所產生的蛋白質和突變蛋白屬於本發明的範圍之內。術語FSH的"融合蛋白"指包含與其它(例如)能延長在體液內存留時間的蛋白相融合的FSH、FSH的突變體或片段的多肽。例如，FSH可與免疫球蛋白或其片段(例如免疫球蛋白Fc部分)融合。成熟FSH的序列也可與能增強分泌的信號肽和/或引導序列融合。在本發明的一個優選實施方案中，FSHP亞基或其片段與hCGe亞基的羧基-末端肽(CTP)融合。獲得的蛋白在體外具有與FSH相同的受體結合和生物學活性，但循環半衰期更長(LaPolt等，1992)。在本發明中，FSH的"活性片段"或其突變蛋白，包括此蛋白分子本身多肽序列的任何片段或前體，或與締合分子結合的或接連有(例如)糖或磷酸殘基的此蛋fl，或此蛋白分子或糖基的自身聚集物，只要所述片段的活性與FSH充分相似。本說明書中所用的FSH"功能衍生物"包括FSH或其突變蛋白的衍生物，這些衍生物可通過本領域已知的方法利用胺基酸殘基支鏈的功能基團或N-或C-末端基團來製備，只要它們仍是藥物學上可接受的，即它們基本上不會破壞此蛋白質基本上類似於促性腺激素的活性，並且不會使包含它的組合物具有毒性，都包括在本發明範圍內。這些衍生物例如可包含能遮蔽抗原位點和延長FSH在體液中存留時間的聚乙二醇支鏈。其它衍生物包括含羧基的脂肪族酯、通過與銨或伯胺或仲胺反應形成的羧基的醯胺、胺基酸殘基的游離氨基與乙醯部分(如垸醯基或碳環芳醯基)形成的N-乙醯衍生物、或游離羥基(如絲氨醯或蘇氨醯殘基的游離羥基)與乙醯基部分形成的O-乙醯衍生物。在一優選實施方案中，對應於FSH分子的功能衍生物顯示有額外的葡糖基化。本說明書中所用的術語"FSH的鹽"指FSH的羧酸鹽和氨基的酸加成鹽。可用該領域已知方法形成的羧基的鹽包括無機鹽，例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽等；與有機鹼，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等形成的鹽。酸加成鹽包括，例如與無機酸，如鹽酸或硫酸形成的鹽，與有機酸，如乙酸或草酸形成的鹽。當然，任何這種鹽都必須保留促性腺激素的生物學活性。本說明書中所用術語"重組二聚體促性腺激素"指培養經基因工程改造的細胞產生的促性腺激素。可用任何來源的細胞生產促性腺激素。表達二聚體促性腺激素的基因工程改造細胞能表達所述二聚體促性腺激素的二種亞基。本說明書中所用的術語"基因工程改造細胞"指通過導入外源DNA而能表達所需促性腺激素二種亞基的細胞。此外源DNA可包含編碼所需促性腺激素的亞基的序列。或者，此外源DNA可包含能活化編碼所需促性腺激素亞基的內源序列表達的序列(參見例如WO91/09955)。所述細胞可以是例如動物、昆蟲或微生物來源。本說明書中所用術語"動物細胞"包括人和非人哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞和雜交瘤細胞。能產生重組二聚體促性腺激素的哺乳動物細胞例子包括例如3T3細胞、COS細胞、人骨肉瘤細胞、MRC-5細胞、BHK細胞、VERO細胞、CHO細胞、rCHO-tPA細胞、rCHO-HepB表面抗原細胞、HEK293細胞、rHEK293細胞、rC127-HepB表面抗原細胞、正常人成纖維細胞、基底細胞、肝細胞、？￡11(6細胞和人永久性羊膜細胞。能產生重組二聚體促性腺激素的雜交瘤細胞例子包括例如DA4.4細胞、123A細胞、127A細胞、GAMMA細胞和67-9-B細胞。在本發明的框架內，優選培養中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)。本發明的第二方面涉及降低製備過程中氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法，其特徵在於，用含抗氧化劑的無血清培養基培養表達所述重組二聚體促性腺激素的細胞。本說明書中所用術語"氧化形式(產物)"指因氧化劑導致其一個或多個胺基酸殘基被氧化的多肽。可通過例如實施例2.1中所述的HPLC檢測來檢測此種FSH形式。所述培養可在任何合適的環境中進行，例如在陪替培養皿、T型瓶或轉瓶中培養，但優選在具有較大體積的容器中例如生物反應器中培養。培養步驟包括以下幾步一在所述無血清培養基中接種所述細胞，一生長期培養；和一生產期培養。生產期是細胞培養程序的一部分，在此期中設定程序參數以支持細胞生長。一旦達到理想的細胞密度，通常將細胞培養物轉換到生產期，此期中設定的程序參數可支持細胞生產。生長期間和生產期間的程序參數可以相同。在生產期，細胞濃度優選範圍為每mL包含l.x106—5.xl7個細胞，例如約1x.106、5x.106、17或5xl07個細胞/mL。最優選所述細胞是CHO細胞。在一個實施方案中，在接種細胞前將抗氧化劑加入無血清培養基中。在另一實施方案中，在接種細胞後即刻(如接種後不超過24小時)將抗氧化劑加入無血清培養基中。此製備過程優選包括收集含有重組二聚體促性腺激素的培養液步驟。在本發明的一個優選實施方案中，此製備過程還包括純化重組二聚體促性腺激素。純化促性腺激素的方法是本領域所熟知。例如可按專利EP04105639.1、WO98/20039、WO00/63248或WO88/10270所述方法純化FSH。在本發明另一優選實施方案中，此製備過程還包括配製重組二聚體促性腺激素和藥學上可接受的運載體而獲得藥物組合物。本說明書中所用術語"藥學上可接受的運載體"指包括不會干擾活性成分的生物學活性作用，且對給予其的宿主沒有毒性的任何運載體。例如，對於腸胃外給藥，可採用運載體，如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和林格(Ringer's)溶液將一種或多種活性蛋白質配製成用於注射用的單位劑量形式。然後可通過多種途徑將根據本發明配製的藥物組合物給予個體。給藥途徑包括皮內、經皮(如以緩釋製劑形式)、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、口服、顱內、硬膜外、局部、直腸和鼻內途徑。可採用任何其它治療上有效的途徑，例如通過上皮或內皮組織吸收，或通過將編碼活性成分的DNA分子給予患者(如通過載體)作基因治療，使該活性成分在體內表達和分泌。另外，本發明的蛋白質也可與生物學活性劑的其它組分，例如藥學上可接受的表面活性劑、賦形劑、運載體、稀釋液和媒介物一起給藥。對於腸胃外給藥(如靜脈內、皮下、肌肉內)給藥，可將一種或多種活性蛋白質與藥學上可接受的腸胃外媒介物(如水、鹽水、葡萄糖溶液)和能維持等滲性(如甘露醇)或化學穩定性(如防腐劑和緩衝液)的添加劑一起配製成溶液、懸浮液、乳液或凍乾粉末。可採用常規技術對製劑進行滅菌。在本發明一個優選實施方案中，降低製備過程中氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法的特徵在於，所述製備過程至少在2、3、4、5或6個步驟中存在抗氧化劑。優選實施此製備過程的所有步驟中都存在抗氧化劑，例如，整個製造過程都在抗氧化劑存在下實施。例如，降低製備過程中氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法可包括以下步驟一用含抗氧化劑的無血清培養基培養表達所述重組二聚體促性腺激素的細胞；一收集含有所述重組二聚體促性腺激素的培養液；和一在抗氧化劑存在下純化所述重組二聚體促性腺激素。降低製備過程中氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法優選還包括將所述重組二聚體促性腺激素配製成含抗氧化劑的藥物組合物的步驟。製備過程所有步驟中使用的抗氧化劑可以相同，其中採用一種抗氧化劑。或者，培養步驟、純化步驟和/或配製步驟中可採用不同的抗氧化劑。本領域知道眾多具有抗氧化作用的化合物。這些化合物包括例如半胱氨酸、抗壞血酸、L-甲硫氨酸、L-穀胱苷肽、2-巰基乙醇、a-生育酚及其衍生物、BO-653、叔丁醯-4-甲氧基-酚、2，6-雙(1,1-二甲基乙基)-4-甲基酚、雙金屬重亞硫酸氫鉀或鈉、亞硫酸氫鈉、組氨酸、牛磺酸、甘氨酸、丙氨酸、肌肽、鵝肌肽、1-甲基組氨酸。本發明第三方面涉及用於生產重組二聚體促性腺激素的無血清培養基，其特徵在於，所述培養基包含的抗氧化劑選自-濃度範圍約l-20mg/L的L-穀胱苷肽；-濃度範圍約5-15mg/L的2-巰基乙醇；-濃度範圍約200-5001^凡的1^-甲硫氨酸；和-濃度範圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度範圍約5-25mg/L的(+)-a-生育酚的組合。無血清培養基通常包括水、滲透性調節劑、緩衝液、能源、胺基酸、無機或重組鐵源、重組或合成的生長因子、和任選的非鐵金屬離子、維生素和輔因子。例如，可按照本發明改良以上所列出的市售無血清培養基。現已對本說明書作了完整描述，本領域技術人員知道不脫離本發明的思路和範圍其無須過多實驗，可採用等價的參數、濃度和條件在廣泛範圍內實施本發明的內容。雖然本發明已結合具體實施方案作了說明，但應理解可對其作進一步改進。本發明的應用應包括總體上遵循本發明的原理所作的任何變更，應用或調整，並且包括例如那些背離目前所披露信息但屬於本發明
技術領域：
內的己知或常規實踐的內容，和可應用上文確立的基本特徵的內容，均屬於附件權利要求書的範圍之內。獻，包括期刊論文或摘要、公布或未公布的美國或外國的專利申請、授權的美國或外國的專利或任何其它參考文獻，包括引用文獻中的所有數據、表格、圖和內容都納入本文作參考。另外，本說明書所引用的參考文獻中引用的參考文獻全部內容也全部納入本文作為參考。對已知方法步驟、常規方法步驟、已知方法、或常規方法的參考引用不以任何方式承認本發明的任何方面，描述或實施方案已在相關領域公開，說明或建議過。上述具體實施方案的描述將完全公開本發明的全部性質，從而使得他人可在不背離本發明的總體思路下無須過多實驗，只須通過應用本領域的知識(包括本文引用參考文獻的內容)，即可很容易地修改和/或調整這些具體實施方案的各種應用。因此，認為根據本文提供的說明和指導做出的這種調整和修改也屬於本文所公開的實施方案範圍內。應知道本說明書中的用辭和術語目的是為了描述而不是限制，因此本領域技術人員藉助本文提供的說明和指導，結合本領域普通技術人員的知識，可解釋本說明書中的術語和用辭。實施例l:細胞培養程序1.1細胞系和培養基所有實驗都用能表達人FSH二種亞基的CHO細胞系進行。產物蛋白質為二聚體促性腺激素，也稱為rFSH。其a-亞基與SwissProt登錄號P01215相對應，P-亞基與SwissProt登錄號P01225相對應。細胞培養用的培養基是為培養CHO細胞而設計的基礎無血清培養基(SFM)。SFM培養基添加有實施例3中詳述的待測試抗氧化劑。基礎SFM中待測試抗氧化劑的初始濃度如表I所示。表l.基礎無血清培養基中抗氧化劑的初始濃度formulaseeoriginaldocumentpage201.2.接種、生長和生產條件培養程序也稱為"運作(mn)"，包括接種步驟、生長期和生產期培養。進行了5種不同的運作，稱為運作l、2、3、4和5。將至少2.4.xl(^個能產生rFSH的活細胞轉移到裝有11升有效工作容積帶有微載體的15升生物反應器(新MBR，newMBR，蘇黎士)中。接種後立即進入持續2或3天的分批期(batchphase)。然後用SFM按每天1倍的稀釋速率給生物反應器連續補料，灌注速率為11L/天。生長期和生產期培養用的pH和溫度(37。C,pH=7)相同。在整個運作過程中維持溶氧(DO)為50%的氣體飽和度。實施例2:分析方法2丄氧化形式rFSH的檢測按Bassett和Driebergen(Bassett和Driebergen，2005)所述，用RP-HPLC檢測粗製收穫物中的氧化形式(產物)。以運作2中含280mg/LL-半胱氨酸所獲得的氧化形式百分比為參照，對氧化形式百分比進行標準化(即氧化形式百分比除以23.4%)。2.2測定活細胞總濃度活細胞總濃度定義為附著於微載體的細胞濃度和懸浮活細胞濃度之和。用結晶紫細胞核計數方法檢測附著於微載體的細胞濃度(福祿卡，Fluka61135)。用臺盼藍排除法檢測懸浮活細胞濃度(西格馬,SigmaT-8154)。按如下公式計算活細胞總比率(TVC比率)[測試結束時的活細胞總濃度]/[測試開始時的活細胞總濃度]，其中測試開始定義為培養基中加入新的抗氧化劑的那一天，測試結束定義為培養基中加入下一次抗氧化劑的那一天。2.3.rFSH滴度的測定用瓦雷斯(Wallac)-ADL的DelphiahFSH試劑盒(分類號n°A017-201)作免疫螢光檢測試驗檢測rFSH滴度。2.4.葡萄糖消耗速率(GCR)的檢測葡萄糖消耗速率(GCR)表示為克/L天，按如下公式計算GCR=(G-Gt)Dt+(Gt-廣Gt)，G表示"葡萄糖濃度"和D表示"稀釋速率"。指數含義如下-0:補加SFM時；-t:在時間t時測量；和-t-l:在時間t-l時測量。實施例3:不同抗氧化劑的效果為了降低無血清方法獲得的氧化形式(產物)的水平，實施了二次15L的運作(運作1和2)以測試不同抗氧化劑的效果。作為對照實施一次不加任何抗氧化劑的運作(運作3)。SFM中加入了幾種抗氧化劑或氧化劑組合使其達到表n所示的最終濃度。對每種抗氧化劑或抗氧化劑組合都測試了約IO天時間。測試第一天，加入達到設定點所需體積的抗氧化劑溶液。此後每天，通過灌注從生物反應器中洗去特定量的抗氧化劑並通過一次性加入來替換更新(對於每天1倍的稀釋速率，每24小時更新生物反應器體積的63.2%，這代表了每天更換抗氧化劑的量)。測試期結束時，通過灌注從生物反應器中洗去抗氧化劑，用另一待測試抗氧化劑替代。每次測試結束時檢測氧化形式rFSH的百分比(表11)。標準化後其值低於1.0表明該測試抗氧化劑減少rFSH氧化形式水平比L-半胱氨酸更有效。每天檢測活細胞總濃度，GCR和rFSH滴度。表II顯示活細胞總比率(TVC比率)。TVC比率高於或等於l.O表明測試的抗氧化劑對細胞沒有毒性效應。表II:抗氧化劑對rFSH氧化形式的影響tableseeoriginaldocumentpage22WD60—WD70WD70L-甲硫氨酸73414.00.601.0WD70—WD80WD79L-抗壞血酸+(+)-a-生育酚301414.80.631.0運作2WDO—WD20WD20L-半胱氨酸28023.41.006.3WD20-WD30WD30半胱氨酸2HC15017.30.741.4WD30-WD40WD38N-乙醯基-L-半胱氨酸26018.10.771.3WD40-WD50WD50L-半胱氨酸35020.50.881.0WD50-WD56WD561^-半胱氨酸+乙-抗壞血酸+2-巰基乙醇280101019.00.811.0表II所示結果表明2-巰基乙醇、抗壞血酸和(+)-a-生育酚組合、L-甲硫氨酸和L-穀胱甘肽是能獲得低rFSH氧化形式水平的最佳抗氧化劑。只有在加入2-巰基乙醇時，活細胞總TVC比率才低於1.0。因此運作1和2中的所有測試的抗氧化劑(除2—巰基乙醇外)都沒有毒性。另外，GCR和rFSH滴度的檢測表明多種抗氧化劑中沒有一種對代謝和產量模式有任何重要影響(數據沒有給出)。選擇L-甲硫氨酸和L-穀胱甘肽進行生產程序的進一步優化。進行一次運作(運作3)測試不同濃度(l-20mg/L)的L-穀胱甘肽，和一次運作(運作4)測試不同濃度(0.25-3g/L)的L-甲硫氨酸。由於微載體受到損傷，測試L-穀胱甘肽的運作3在生產30天時就過早結束。運作3和4中L-甲硫氨酸或L-穀胱甘肽的測試濃度如表III所示。工作天O天(WDO)定義為反應器接種的那天。生產天O天(PDO)定義為細胞培養程序從生長期轉為生產期的那天。另外，運作期間不改變抗氧化劑的濃度。此次運作中，從一開始就加入250mg/L的L-甲硫氨酸(運作5)。對所有的運作定期檢測rFSH的氧化形式百分比(表IV)。23表III:運作3和4中的抗氧化劑濃度tableseeoriginaldocumentpage24表IV:抗氧化劑對rFSH氧化形式的影響tableseeoriginaldocumentpage24對培養基中加入抗氧化劑後rFSH氧化形式的分析表明L-甲硫氨酸是一種很好的抗氧化劑。與運作1和運作2用L-半胱氨酸為抗氧化劑得到的結果相比，運作5中在250mg/L的L-甲硫氨酸存在下培養細胞時的氧化形式平均百分比下降約40%(參見表II和IV)。L-穀胱甘肽也是一種很好的抗氧化劑，尤其是在濃度約為2.5mg/L時。與運作1和運作2用半胱氨酸作為氧化劑相比，運作3中在濃度2.5mg/L的L-穀胱甘肽存在下培養細胞時，其氧化形式百分比下降了約35%(參見表II和IV)。在運作4中可見隨著L-甲硫氨酸濃度在250-2000mg/L之間的增加，氧化形式百分比有下降趨勢。然而，看來所觀測到的差異沒有超過此法的差異度範圍，因為在L-甲硫氨酸測試濃度為250mg/L的運作5整個過程中所觀測到的差異度相當。此外，可以確認L-穀胱甘肽和L-甲硫氨酸在所測試的濃度範圍內對細胞活力、代謝和產量模式沒有任何重要影響(數據沒有給出)。參考文獻1.Altschul，S.F.，Gish,W"Miller，W"Myers,E.W"和Lipman,D丄(1990)，Basiclocalalignmentsearchtool."局部排列對比的基礎檢索工具"J.Mol.Biol.2"，403-410。2.Altschul,S.F.,Madden,T.L.,Schaffer,A.A.,Zhang,J.，Zhang,Z.,Miller，W.,和Lipman，D.J.(1997)，GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms"缺口BLAST和PSI-BLAST:新一代蛋白質資料庫檢索程序"NucleicAcidsRes.25,3389-3402。3.Bassett,R.M.禾口Driebergen，R.(2005)，Continuedimprovementsinthequalityandconsistencyoffollitropinalfa，recombinanthumanFSH"人重組促濾泡激素aFSH質量和組成的不斷改進"Reprod.Biomed.Online,/0，169-177。4.Brutlag,D丄.，Dautricourt，J.P"Maulik,S.，禾卩Relph,J.(1990)，Improvedsensitivityofbiologicalsequencedatabasesearches."生物序列資料庫檢索靈敏度的提高"Comput.Appl.Biosci.6,237-245。5.Gonnet,G.H.,Cohen,M.A.,禾卩Benner,S.A.(1992)，Exhaustivematchingoftheentireproteinsequencedatabase"整個蛋白質序列資料庫的詳盡匹配"Science256,1443-1445。6.Grantham，R.(1974)，Aminoaciddifferenceformulatohelpexplainproteinevolution."胺基酸結構的差異有助於解譯蛋白質的進化"ScienceM5，862-864。7.Henikoff,S.禾卩Henikoff,J.G,(1993).Performanceevaluationofaminoacidsubstitutionmatrices"胺基酸替代矩陣的性能評價"Proteins/7,49-61。8.Higgins,D.G.,Thompson，J.D,禾口Gibson,T丄(1996)，UsingCLUSTALformultiples叫uencealignments"採用CLUSTAL排列對比多條序歹U"MethodsEnzymol.風383-402。9.Karlin,S.禾卩Altschul,S,F.(1990)，Methodsforassessingthestatisticalsignificanceofmolecularsequencefeaturesbyusinggeneralscoringschemes."採用基因評分方案評估分子序列特徵的方法"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.2264-2268。10.LaPolt,P.S"Nishimori,K.，Fares，F.A"Perlas,E.,Boime,I"和Hsueh,A.J.(1992)，Enhancedstimulationoffolliclematurationandovulatorypotentialbylongactingfollicle-stimulatinghormoneagonistswithextendedcarboxyl-terminalpeptides."含延伸羧基末端肽的長效濾泡刺激激素激動劑對濾泡成熟和排卵潛力的剌激增強"Endocrinology"7,2514-2520。11.M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