一種鑑定胡椒種質資源的方法
2023-05-17 11:37:31
專利名稱：一種鑑定胡椒種質資源的方法
技術領域：
本發明涉及生物信息技術領域，具體的說是涉及一種鑑定胡椒種質資源的方法。
背景技術：
胡椒(Piper nigrum L.)為胡椒科胡椒屬多年生常綠攀援藤本植物，是世界重要的香辛料作物，用途廣，經濟價值高。胡椒的種子含有揮髮油、胡椒鹼、粗脂肪、粗蛋白等成分，是人們喜愛的調味品。除此之外，胡椒在醫藥工業上可用作健胃劑、解熱劑及支氣管黏膜刺激劑等，治療消化不良、寒痰、咳嗽、腸炎、支氣管炎、感冒和風溼病等；在食品工業上用作防腐劑及天然食品添加劑等。胡椒種苗的真實性是衡量種苗質量的重要指標，直接影響胡椒的產量、品質和經濟效益。當前我國胡椒種子和種苗常存在純度低、品種混雜、以次充好現象，各級農作物品種審定機構和種子種苗生產部門對胡椒品種偽劣鑑定日益重視。但是，胡椒種質資源形態特徵較為相似，加上長期引種和生產管理疏漏，導致了同物異名、同名異物、品種混淆等問題。傳統形態鑑定法依賴於表型差異，而形態性狀受到氣候、環境、營養狀態和生物期等多種因素影響，且形態鑑定法工作量大、鑑定周期長、成本高，對於種苗鑑定、推廣品種以及育種等工作造成不利影響。DNA分子標記能反映生物個體或種群基因組中某種差異特徵的DNA片段，可以從根本上揭示植物內在的基因差異，近年來已經廣泛應用到作物品種鑑定和種質資源分類等研究領域。目前，應用較多的是SSR、ISSR、RAPD、RFLP和AFLP等分子標記。其中，ISSR(Inter-simple sequence repeat),即簡單序列重複區間擴增，是由加拿大蒙特婁大學Zietkiewicz等於1994年創建的一種分子標記技術,其原理是在SSR的3'或5 ^端錨定1-4個鹼基作為引物，對兩側具有反向排列SSR的一段序列進行擴增，而不是擴增SSR本身。錨定鹼基避免了 SSR在基因組上的滑動，因而大大提高了 PCR擴增的穩定性和可重複性。ISSR分子標記技術兼具SSR、RAPD, RFLP, AFLP等分子標記的優點，與SSR相比，ISSR不需要預先獲知序列信息而大大降低成本，且多態性更加豐富；與RAro相比，ISSR退火溫度在50°C左右，保證了 PCR擴增的穩定性和重複性；與RFLP, AFLP相比，ISSR利用在植物基因組中常出現的簡單重複序列設計引物，無需預先克隆和測序，技術要求不高、速度較快、成本低廉。目前，ISSR標記技術在種質資源的準確鑑定、遺傳多樣性、基因定位、遺傳圖譜構建及分子標記輔助選擇等研究中得到了廣泛應用。但在胡椒中，應用ISSR分子標記技術進行胡椒種質資源鑑定的方法尚未見報導。
發明內容
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種鑑定胡椒種質資源的方法，使該方法能夠利用ISSR分子標記技術準確、簡便的鑑定胡椒種質資源。為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案一種鑑定胡椒品種的方法，包括以下步驟
步驟I、選取標準胡椒品種中的一種或兩種以上，分別進行DNA提取，然後採用SEQID NO: I所示序列的ISSR引物進行PCR擴增，所得擴增產物進行凝膠電泳檢測，根據凝膠電泳圖結果以標準胡椒品種編號和擴增條帶數最多的標準胡椒品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一個橫、縱坐標交結處記錄標準胡椒品種條帶的檢測結果，將有擴增條帶的標記為有條帶，無擴增條帶的標記為無條帶，得到標準胡椒品種的ISSR指紋圖譜；步驟2、提取待測胡椒品種的DNA，採用SEQ ID NO: I所示序列的ISSR引物進行PCR擴增，將所得到的擴增產物進行凝膠電泳檢測，根據凝膠電泳圖結果以待測胡椒品種編號和步驟I所述擴增條帶數最多的標準胡椒品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一個橫、縱坐標交結處記錄待測胡椒品種條帶的檢測結果，將有擴增條帶的標記為有條帶，無擴增條帶的標記為無條帶，得到待測胡椒品種的ISSR指紋圖譜，然後與所述標準胡椒品種的ISSR指紋圖譜進行比對判斷。其中，作為優選方案，本發明所述PCR擴增體系為反應總體積為25iiL，其中Mg2+ 濃度為2mmol/L、dNTPs濃度為200 y mo/L、引物濃度為2 y mol/L、胡椒品種的DNA用量為IOOng, Taq DNA聚合酶用量為IU ；所述PCR擴增程序為94°C預變性3min ;94°C變性2min、50°C復性lmin、72°C延伸3min，循環35次；72°C延伸7min，4°C保存。本發明所述凝膠優選為瓊脂糖凝膠電泳，所述瓊脂糖凝膠電泳進一步優選採用膠濃度為I. 2%並包含GoodView核酸凝膠染色劑的瓊脂糖凝膠。本發明選取21種標準胡椒品種為胡椒種質資源材料(見表1)，採用100條UBC引物(由加拿大不列顛哥倫比亞大學命名的系列簡單重複序列，即University of BritishColumbia,簡稱UBC)分別擴增上述標準胡椒種質資源的DNA，根據上述UBC引物在21個胡椒種質中PCR擴增譜帶的特異性、多態性以及帶型的易區分程度進行篩選，篩選出在不同胡椒種質間能夠擴增出多態性豐富、帶型清晰而且能夠穩定重複的特徵譜帶的UBC引物；然後，在篩選出的這些UBC引物中選擇能夠擴增出上述胡椒種質間多態性信息含量最高，能夠準確區分所有胡椒種質的引物，並經過優化得到如SEQ ID NO: I所示序列的ISSR引物，經RAPDistance軟體檢驗無重合。SEQ ID NO: I所示序列的ISSR引物為簡併引物，其中Y表示為C/T。表I標準胡椒種質資源表
權利要求
1.一種鑑定胡椒種質資源的方法，其特徵在於，包括以下步驟 步驟I、選取標準胡椒品種中的一種或兩種以上，分別進行DNA提取，然後採用SEQ IDNO: I所示序列的ISSR引物進行PCR擴增，所得擴增產物進行凝膠電泳檢測，根據凝膠電泳圖結果以標準胡椒品種編號和擴增條帶數最多的標準胡椒品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一個橫、縱坐標交結處記錄標準胡椒品種條帶的檢測結果，將有擴增條帶的標記為有條帶，無擴增條帶的標記為無條帶，得到標準胡椒品種的ISSR指紋圖譜； 步驟2、提取待測胡椒品種的DNA，採用SEQ ID NO: I所示序列的ISSR引物進行PCR擴增，將所得到的擴增產物進行凝膠電泳檢測，根據凝膠電泳圖結果以待測胡椒品種編號和步驟I所述擴增條帶數最多的標準胡椒品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一個橫、縱坐標交結處記錄待測胡椒品種條帶的檢測結果，將有擴增條帶的標記為有條帶，無擴增條帶的標記為無條帶，得到待測胡椒品種的ISSR指紋圖譜，然後與所述標準胡椒品種的ISSR指紋圖譜進行比對判斷。
2.根據權利要求I所述方法，其特徵在於，所述標準胡椒品種為華山筠、萎葉、粗穗胡椒、海南筠、蓽菝、假筠、大葉筠、短筠、斜葉筠、毛筠、山筠、頂花胡椒、柬印93、柬埔寨小葉種、印尼大葉種胡椒、古晉胡椒、73F5胡椒、興熱I號胡椒、大山胡椒、雲選I號胡椒和班尼約爾I號胡椒。
3.根據權利要求I所述方法，其特徵在於，所述PCR擴增體系為 反應總體積為25 u L，其中Mg2+濃度為2mmol/L、dNTPs濃度為200 u mo/L、引物濃度為2iimol/L、胡椒品種的DNA用量為lOOng、Taq DNA聚合酶用量為1U。
4.根據權利要求I所述方法，其特徵在於，所述PCR擴增程序為 94°C預變性3min ； 94°C變性 2min、50°C復性 lmin、72°C延伸 3min，循環 35 次； 72°C 延伸 7min，4°C 保存。
5.根據權利要求I所述方法，其特徵在於，所述標記為有條帶為標記為I。
6.根據權利要求I所述方法，其特徵在於，所述標記為無條帶為標記為O。
7.根據權利要求I所述方法，其特徵在於，所述凝膠電泳為瓊脂糖凝膠電泳。
8.根據權利要求7所述方法，其特徵在於，所述瓊脂糖凝膠電泳採用膠濃度為I.2%並包含GoodView核酸凝膠染色劑的瓊脂糖凝膠。
全文摘要
本發明涉及生物信息技術領域，公開了一種鑑定胡椒種質資源的方法。該方法將標準胡椒品種DNA用SEQ ID NO:1所示序列引物進行PCR擴增，根據擴增產物的凝膠電泳結果以胡椒品種編號和條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一橫、縱坐標交結處記錄標準胡椒品種條帶的檢測結果，得到標準胡椒品種的ISSR指紋圖譜；將待測胡椒品種DNA用SEQ ID NO:1所示序列引物PCR擴增，擴增產物按上述方法構建待測胡椒品種的ISSR指紋圖譜，並與標準胡椒品種的ISSR指紋圖譜比對判斷。本發明應用ISSR分子標記技術從遺傳本質上對胡椒種質資源進行了準確鑑定，解決了胡椒種質鑑定困難的問題，且簡單、易操作，檢測迅速。
文檔編號C12Q1/68GK102703598SQ20121023051
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月4日 優先權日2012年7月4日
發明者楊建峰, 祖超, 範睿, 譚樂和, 邢谷楊, 鄔華松, 鄭維全, 郝朝運 申請人:中國熱帶農業科學院香料飲料研究所