一種親環素基因抑制劑、其製備方法及應用的製作方法

2023-05-17 02:52:36

專利名稱：一種親環素基因抑制劑、其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程及醫藥領域，涉及親環素基因CYPJ的抑制劑在製備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
親環素Cycliphilins (CyPs)是普遍分布的細胞內蛋白，在植物、細菌和哺乳動物中均存在，具有高度保守性，最初是作為環孢素A的細胞受體被發現的。環孢素A (CyclosporinA, CsA)是從真菌代謝產物中分離得到的含11個胺基酸的環狀多肽，是一種用於器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制劑，已被廣泛用於臨床，年銷售額在50億美元以上。由於CsA用於臨床以來表現出各種毒副作用，對患者及移植物存活率的影響越來越引起人們的重視，許多科學研究者正在努力尋找與CsA作用類似的、毒副作用低的替代物。 目前CsA也已經開始用於腫瘤治療當中，並且主要是與其它抗癌藥物如紫杉醇、阿黴素、長春新鹼等搭配使用，增強這些藥物的抗腫瘤活性(C/ifl Cancer Res. 11，2320-23 )。因為環孢菌素A同時也是極為有效的免疫抑制劑，因此用於這些疾病的治療時不可避免會帶來免疫抑制的副作用。克服免疫抑制的方法主要兩種，一是對環孢菌素A的免疫抑制基團進行修飾，或者從真菌中提取非免疫抑制的環孢菌素衍生物；另一種方法是根據CYP蛋白的結構，篩選或設計新的非肽類小分子抑制劑。CyI3S廣泛分布於從微生物到哺乳動物的各類物種中。Cyclophilin A(CyPA)是首先從牛的胸腺細胞中發現的CyP家族中第一個成員，並驗證它具有PPIase活性(5bimCe， 226，544-547 Mature 337，473-478)。重組人 T 細胞的 cyclophilin A (hCyPA)的三維結構及它與CsA、四肽及一些二肽形成的複合物的三維結構已有報導Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 88，9483-9487 -J. Mol. Biol. 228，539-550 -J. Mol. Biol. 234， 1119-1130. -,Nature, 353，276-279 -,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88，3324-3328; Biochemistry, 35，7362-7368)。CyPA與HIV相關蛋白質的複合物的結構也已報導(CW入 87，1285-1294 -,Structure 5，139-146)。CyP家族的其他成員與CyPA具有序列同源性及三維結構類似的特性(/"roc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90，11850-11854 -,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91，5183-5186 -J. Mol. Biol. 331,45-56)。CyPJ是CyP家族的新成員，CYP-J cDNA長1. 25Kb，編碼161個胺基酸，已從人的胎腦cDNA文庫中分離並鑑定(Oio^^ei. Cell Genet. 92，231-236)。在胺基酸序列上與線蟲(C. elegans. ) CYP10具有72%的同源性。其具體核苷酸和胺基酸序列詳見NCBI網站上基因登陸號為AF146799的基因報告。CYPJ蛋白能促進肝癌細胞的克隆形成率，可以促進肝癌細胞物質的複製增殖，並且能促進肝癌腫瘤細胞生長，因此，可以作為篩選抗肝癌藥劑的靶標。惡性腫瘤已成為人類致死的最重要原因之一，但是目前市售的抗腫瘤藥物均有各種不良反應，因此，尋找新型的低副作用抗腫瘤藥物成為生物醫藥領域的一大熱點。

發明內容
本發明要解決的問題是提供一種腫瘤細胞增殖的抑制劑，尤其是抑制親環素CyPJ 表達的物質。本發明提供了一種親環素基因抑制劑，它是序列為5』 -CCAACAGGAACTGGAAGAG-3』 (SEQ ID NO 1)、5，- CCAACAGGAACUGGAAGAG -3，(SEQ ID NO 2)、5，-CTCTTCCAGTTCCTGTTGG -3，(SEQ ID NO 3)或者 5』 - CUCUUCCA⑶UCCU⑶UGG -3，(SEQ ID NO 4)的核酸分子。本發明中簡稱為CYPJsi。為了增強效果，上述4個種核酸分子可以組合成混合物，例如5』 -CCAACAGGAACUGGAAGAG -3'禾P 5' - CUCUUCCAGUUCCUGUUGG -3'，或者 5'-CCAACAGGAACTGGAAGAG -3』 和 5』 - CTCTTCCAGTTCCTGTTGG -3，。本發明提供了序列中包括 5，- CCAACAGGAACTGGAAGAG-3，和 5，-CTCTTCCAGTTCCTGTTGG -3，的載體，以及序列中包括 5，- CCAACAGGAACUGGAAGAG -3，和 5，-CUCUUCCAGUUCCUGUUGG -3』的載體。所述的載體可以是各種市售的載體，尤其是病毒載體， 例如實施例中使用的慢病毒載體。上述4個核酸分子以及2種混合物可以用於製備抗腫瘤藥劑。上述4個核酸分子可以通過按照SEQ ID NO 1_4所示的序列，將各核糖核酸基團或者脫氧核糖核酸基團依次脫水縮合的方法獲得。也可以從細胞或者組織中分離純化獲得。本發明提供了一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，即在細胞培養液中加入上述核酸分子。所述的腫瘤細胞可以是肝癌細胞或者結腸癌細胞等。具體的說，所述的腫瘤細胞是例如QGY細胞或者SMMC-7721細胞的肝癌細胞，或者例如sw620細胞的結腸癌細胞。加入CYPJsi的具體方法可以採用實施例中所採用的方法，或者其它常規的操作。本發明還提供了一種檢測親環素基因的試劑盒，該試劑盒含有上述核酸分子。本發明還提供了相應的晶片，該晶片含有上述核酸分子。由於CYPJ在腫瘤細胞和組織中通常活性較高，通過檢測親環素基因CYPJ的表達量及活性就能初步輔助判斷腫瘤細胞活躍程度及腫瘤的發生發展狀況。利用上述試劑盒或者晶片檢測親環素基因CYPJ的方法可可以使用常規操作。通常的思路是將CYPJsi作為寡聚核苷酸探針，然後加入樣品核酸溶液，根據與寡聚核苷酸探針結合的親環素基因CYPJ的量計算樣品中親環素基因CYPJ的量。所述的試劑盒或者晶片中除了含有利用CYPJsi製備的探針，還包括陽性對照和陰性對照，通常還有說明書或者操作指南及相關試劑。本發明的親環素基因抑制劑CYPJsi，是基於親環素CypJ設計的寡聚核苷酸分子抑制劑。其中，5』 - CTCTTCCAGTTCCTGTTGG -3』 (SEQ ID NO 3)是 5，-CCAACAGGAACTGGAAGAG-3，(SEQ ID NO 1)的反向互補序列，CUCUUCCA⑶UCCU⑶UGG -3， (SEQ ID NO 4)禾口 5，- CCAACAGGAACUGGAAGAG -3，(SEQ ID NO 2)是前兩者相應的 RNA 序列。本發明的CYPJsi能夠抑制CYPJ的活性或者表達量，對於CYPJ表達量高的腫瘤細胞殺傷效果更好。實驗表明，本發明的CYPJsi對腫瘤細胞增殖有抑制作用。結果顯示， CYPJsi對胚腎細胞四31\肝癌細胞QGY、SK-h印1和結腸癌細胞sw620的增殖有一定程度的抑制作用。此外，CYPJsi還能夠有效降低肝癌細胞SMMC-7721細胞的克隆形成率。本發明的CYPJsi，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於) 鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的 CYPJsi可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的CYPJsi還可與其他治療劑一起使用。本發明提供了一種親環素基因抑制劑CYPJsi，該抑制劑能夠明顯降低CYPJ蛋白的表達水平，同時顯著抑制腫瘤細胞的增殖。CYPJSI是針對細胞靶點CYPJ設計的藥物，不易形成耐藥性，對於高表達CYPJ蛋白的腫瘤細胞效果特別明顯。因此，本發明的CYPJsi可以作為新的抗腫瘤藥物進行開發，抑瘤效果明顯，特異性好。同時，CYPJsi可以作為檢測和監視腫瘤發生發展情況的指標，為儘早抑制和緩解腫瘤發生發展提供了一種新的途徑和手段。
具體實施例方式實施例1 CYPJsi對親和素CYP的抑制情況
將CYPJsi的SiRNA片段與PCDNA3. 1-CYPJ-myc質粒共轉染細胞，鑑定幹擾小 RNA片段對外源轉染CYPJ的敲減效果。結果顯示，CYPJsi片段能夠在蛋白水平上比較有效地敲減外源轉染CYPJ的表達。為了檢測CYPJsi對內源CYPJ的敲減，我們分別用RT-PCR和實時定量PCR檢測了 67/ymRNA水平的表達量變化。結果顯示，CYPJsi能夠在mRNA水平上比較高效的降低內源cr/y表達，而對內源CYPA的表達沒有影響，證明其敲減作用是特異的。實施例2 MTS法測定CYPJsi對腫瘤細胞的生長抑制作用
QGY細胞(ATCC公司)3X103 /孔接種至96孔板，培養M小時使之貼壁後加入CYPJsi， siRNA陰性片段5』-UUCUCCGAACGUCACGU-3』 (NS),作為對照。設6個濃度梯度，每個濃度設 3個復孔。細胞在37°C，5% CO2條件下培養72小時後，倒掉培養液，用MTS試劑盒(Promega 公司)測定細胞存活率，測試方法為將細胞用無血清培養基洗一遍，按照100 μ 1/well的量加入預先配製好的MTS顯色溶液(10 ml無血清培養基中加入2 ml溶液1和100 μ 1溶液2，充分混勻)。將一個沒有細胞的孔設為本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把細胞放入細胞培養箱中繼續培養2 4小時，然後用酶標儀讀取光吸收值(參考波長630-700 nm, 測定波長490 nm),計算細胞存活率，以測定孔光吸收值/對照孔光吸收值作為細胞存活率的數值。結果加入了 CYPJsi後，QGY細胞的數量約為對照的78%。用同樣的方法處理sw620細胞(ATCC)，結果sw620細胞(ATCC)的數量約為對照的 65%。實施例3 LV-CYPJ-RNAi病毒(上海GenChem公司)對CYPJ mRNA的敲減為了更好的發揮CYPJsi的作用，根據CYPJsi的序列構建了慢病毒載體。LV-CYPJ-RNAi是攜帶CYPJsi的病毒載體，而LV-non_siIencing是攜帶對照片段(siRNA 陰性片段5』 -UUCUCCGAACGUCACGUdTdT-3』)的病毒載體。為了檢測慢病毒攜帶的sh-RNA % CYPJ的敲減效果，將SK-Ifepl細胞和細胞種96孔板後，加入MOI = 20的 LV-CYPJ-RNAi病毒和LV-non-silencing病毒進行感染。24h後換液。傳代後培養至48 小時觀察GFP (綠色螢光)螢光，抽提總RNA、反轉錄，然後用實時定量PCR測定細胞內 mRNA的相對表達量(似/ /7 WmRNA作為內參)。結果顯示，當用高於20的復感染指數 (MOI)感染72小時後，LV-CYPJ-RNAi病毒和LV-non-silencing病毒均可以達到75%以上的感染效率。而且，LV-CYPJ-RNAi病毒能有效的敲減細胞內表達。實施例4對CYPJ基因內源表達的消減作用的細胞水平篩選實驗
種細胞和SK-Ifepl細胞於96孔板中，種板密度0. 8*104/孔。24h後將攜帶CYPJsi 的Ientivirus(慢病毒，吉凱公司)轉導入細胞。Lentivirus滴度為106TU/ul，取MOI為100， 即每孔加入80ul病毒液。具體轉導方法為給每孔細胞換上50ul新鮮培養基(PH7. 0)，加入適量病毒液，7- 後每孔補加50ul培養基。將細胞擴大培養，利用流式細胞術對細胞進行GFP綠色螢光分選，篩選出病毒轉導陽性細胞，並檢測其陽性率。Western檢測陽性細胞和陰性細胞的CYPJ內源蛋白表達水平的變化。結果顯示，GFP綠色螢光陽性率50%以上，轉導方法正確。與對照相比，導入攜帶 CYPJsi的Ientivirus的細胞的CYPJ蛋白表達量是對照的27. 8%。實施例5對SMMC-7721細胞克隆形成率的影響
SMMC-7721細胞(ATCC公司，肝癌細胞株)1000個/皿接種於60mm細胞培養皿，一組轉染CYPJsi，另一組加入陰性片段作為對照。連續培養15-20天時間，中間酌情換液。用室溫 IXPBS洗一次，加aiil預冷的甲醇4°C固定lOmin。棄去固定用的甲醇，用預冷的IXPBS 洗一次，加GIMESA染色劑，室溫染色lOmin，清水洗3遍，去浮色，拍照、計數。根據細胞數目確定克隆大小，大於200個細胞的稱為大克隆，100-200個細胞之間的稱為中克隆，50-100個細胞之間的稱為小克隆。比較大中克隆之間的差異，重複2次每次三皿取平均值，加入CYPJsi後7721細胞所形成的克隆數顯著少於對照組所形成的克隆數。這些結果提示，CYPJsi能抑制腫瘤細胞克隆形成。實施例6 LV-CYPJ-RNAi病毒敲減CYPJ表達對肝癌細胞增殖的影響
為了研究CYPJ敲減對肝癌細胞增殖的影響，將SK-Hepl細胞種6孔板後，分別加入 LV-CYPJ-RNAi病毒和LV-non-silencing病毒。感染96小時後，用MTS法測定各孔的光吸收，作為細胞數量的指標。結果顯示，用LV-CYPJ-RNAi病毒幹擾CYPJ的表達後，細胞生長明顯減緩。三次重複實驗結果表明，加入LV-CYPJ-RNAi病毒幹擾的細胞數量為加入LV-non-silencing 病毒的細胞數量的67.9%。同時，抑制細胞增殖的效果隨著加入LV-CYPJ-RNAi病毒的增多更為明顯。實施例7 LV-CYPJ-RNAi病毒敲減CYPJ表達對裸鼠皮下移植瘤生長的影響將裸鼠放入SPF級動物房(無特定病原體級實驗動物房)，使其適應培養環境約一個星
期。同時，大量培養肝癌細胞株SK-!fepl。將SK-Hepl注射至裸鼠皮下成瘤。當腫瘤體積長至10-30 mm3體積時，將20「 1含
有3 X 107 TU滴度病毒的PBS用注射器直接注入腫瘤內。實驗組注射LV-CYPJ-RNAi病毒幹擾CYPJ的表達，對照組注射LV-non-silencing病毒。兩天後，再用同樣的方法和劑量注射一次病毒。每三天測量一次腫瘤的直徑並計算瘤體體積。實驗組和對照組小鼠各八隻進行測量，從感染第四天起，實驗組腫瘤和對照組腫瘤體積出現顯著差異。32天後，處死小鼠，並從皮下取出瘤塊進行稱量。從第一次注射病毒之日開始，每3天測量並記錄每隻小鼠的瘤體的長徑短徑和體重，瘤體的體積v=ab2/2 (a長徑長度，b短徑長度)。
結果顯示，實驗組腫瘤的平均體積為0.16c m3，對照組腫瘤的平均體積為
0.72士0.14 c m3，差異顯著。實驗組腫瘤的平均重量為0.洲士0. 08 c m3，對照組腫瘤的平均重量為0.49士0. 17 c m3，差異顯著。對瘤體的切片、染色和螢光檢測顯示，LV-CYPJ-RNAi 和LV-non-silencing病毒均成功感染了瘤體。
權利要求
1.一種親環素基因抑制劑，其特徵在於，它是序列為5 』 -CCAACAGGAACTGGAAGAG-3，、 5' - CCAACAGGAACUGGAAGAG _3'、5' - CTCTTCCAGTTCCTGTTGG -3'或者 5'-CUCUUCCA⑶UCCU⑶UGG -3，的核酸分子。
2.—種核酸分子混合物，其特徵在於，它由序列是5』 - CCAACAGGAACUGGAAGAG -3』和 5，- CUCUUCCA⑶UCCU⑶UGG -3，的核酸分子組成。
3.一種核酸分子混合物，其特徵在於，它由序列是5』 - CCAACAGGAACTGGAAGAG -3』和 5，- CTCTTCCAGTTCCTGTTGG -3，的分子組成。
4.序列中包括5，- CCAACAGGAACTGGAAGAG-3，和 5，- CTCTTCCAGTTCCTGTTGG -3，的載體。
5.序列中包括5，- CCAACAGGAACUGGAAGAG -3，禾口 5，- CUCUUCCA⑶UCCU⑶UGG -3，的載體。
6.權利要求1所述的抑制劑在製備抗腫瘤藥物中的應用。
7.權利要求2或者3所述的核酸分子混合物在製備抗腫瘤藥劑中的應用。
8.—種體外抑制腫瘤細胞增殖的方法，其特徵在於，在細胞培養液中加入權利要求5 所述的載體。
9.一種檢測親環素基因的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒含有權利要求1所述的核酸分子。
10.一種檢測親環素基因的晶片，其特徵在於，該晶片含有權利要求1所述的核酸分子。
全文摘要
本發明屬於基因工程及醫藥領域，涉及親環素基因CYPJ的抑制劑在製備抗腫瘤藥物中的應用。本發明提供了一種親環素基因抑制劑，它是序列為5』-CCAACAGGAACTGGAAGAG-3』、5』-CCAACAGGAACUGGAAGAG-3』、5』-CTCTTCCAGTTCCTGTTGG-3』或者5』-CUCUUCCAGUUCCUGUUGG-3』的核酸分子。本發明的CYPJsi作為新的抗腫瘤藥物進行開發，抑瘤效果明顯，特異性好。同時，CYPJsi可以作為檢測和監視腫瘤發生發展情況的指標，為儘早抑制和緩解腫瘤發生發展提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號A61K48/00GK102382822SQ20101027060
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月2日 優先權日2010年9月2日
發明者餘龍, 周君, 唐麗莎 申請人:復旦大學