肌肉萎縮防止劑的製作方法

2023-05-17 19:09:51

專利名稱：肌肉萎縮防止劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及包括顯示低苦味、優異的穩定性和優異的安全性的乳清蛋白水解物作為活性成分的肌肉萎縮防止劑。本發明還涉及包括顯示低苦味、優異的穩定性和優異的安全性的乳清蛋白水解物作為活性成分的肌肉萎縮防止食品、肌肉萎縮防止飲品、肌肉萎縮防止營養組合物和肌肉萎縮防止飼料。肌肉萎縮防止劑對於防止老齡化期間的肌肉萎縮(即，肌肉質量的降低)是有效的，並顯示低苦味、優異的穩定性和優異的安全性。
背景技術：
長期不活動或失重狀態引發生物體的各種生理變化(如，骨骼肌萎縮、體重減輕 和骨脫 丐)。例如，用於治療骨折等的長期石膏固定(cast immobilization)狀態或長期臥床不起的狀態與健康個體相比引發肌肉質量的顯著降低。已知，在太空長期停留後返回地球的太空人由於肌肉質量的降低而無法站立。還已知在老齡化期間由於運動量或營養攝取降低而發生肌肉質量的降低，以致發生骨骼肌萎縮。為了解決上述問題，已進行了如下嘗試使用膳食成分(特別是蛋白質和胺基酸營養物)能夠防止骨骼肌萎縮或從骨骼肌萎縮中及早恢復。例如，非專利文獻I公開了使用大豆蛋白作為膳食蛋白來源來降低由於長期失重狀態所造成的骨骼肌萎縮的效果，並表明通過攝取大豆蛋白抑制了腹肌質量的降低。非專利文獻2涉及為了防止老齡化期間肌肉萎縮的發展而應當攝取的蛋白質的數量和質量。牛乳或乳製品通常被認為是食物過敏的原因。特別地，在人母乳中不包含的乳清蛋白被認為充當變應原。例如專利文獻2公開了通過用蛋白酶水解乳清蛋白來降低乳清蛋白的變應原性的方法。通過抑制ELISA(參見非專利文獻3)證實，通過專利文獻3中公開的方法所生產的乳清蛋白水解物具有等於或小於β -乳球蛋白和乳清蛋白抗原性的1/10，000的抗原性。證實乳清蛋白水解物經口服給藥具有脂肪累積抑制效果。因此，乳清蛋白水解物作為具有低變應原性和高功能性的材料而引起注意。相關技術文獻專利文獻專利文獻I JP-A-2-002319專利文獻2 JP-A-2-138991專利文獻3 :W02008/111562非專利文獻非專利文獻I Tada 等，Soy Protein Research, Vol. 2, pp. 112-117 (1999)非專利文獻2 Paddon-Jones 等，Am J. Clin. Nutr. , 87, pp. 1562S-6S (2008)非專利文獻3 Japanese Journal of Pediatric Allergy and ClinicalImmunology, 1，36 (1987)

發明內容
發明要解決的問題大豆肽具有肌肉萎縮防止效果。然而，由於大豆肽具有獨特的苦味，並且當大豆肽在水中分散時會產生混濁，因此大豆肽可能不會用於期望的食品或飲品等。特別地，大豆肽不能用於需要透明性的產品。包含在牛乳中的乳清蛋白與大豆蛋白相比具有高含量的支鏈胺基酸(其參與肌肉合成)，並具有高蛋白質淨利用率(net protein utilization)。因此，期望乳清蛋白具有類似於或高於大豆肽的肌肉萎縮防止效果。然而，還未系統地報導乳清蛋白或乳清肽(即，乳清蛋白水解物)的攝取對防止肌肉萎縮的效果。由於通過將包含在牛乳中的乳清蛋白水解所獲得的乳清蛋白水解物具有低抗原性和低苦味，並且不沉澱，因此可將乳清蛋白水解物適當地添加到食品或飲品中。然而，未報導乳清蛋白水解物具有肌肉萎縮防止效果。
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鑑於上述情況構思了本發明。本發明的目的為提供無苦味、混濁和沉澱並具有肌肉萎縮防止效果的肌肉萎縮防止劑。用於解決問題的方案本發明的發明人進行了銳意研究並發現，通過水解包含在牛乳中的乳清蛋白所獲得的乳清蛋白水解物具有高肌肉萎縮防止效果。該發現導致本發明的完成。具體地，本發明提供以下肌肉萎縮防止劑，以及包括所述肌肉萎縮防止劑的以下肌肉萎縮防止食品、肌肉萎縮防止飲品和肌肉萎縮防止飼料。[I] 一種肌肉萎縮防止劑，其包括乳清蛋白水解物作為活性成分，所述乳清蛋白水解物具有(I) IOkDa以下的範圍內的並具有200Da至3kDa的主峰的分子量分布，(2) 2至8的平均肽鏈長度(APL)，(3)20%以下的游離胺基酸含量，(4)20%以上的支鏈胺基酸含量，和
(5)等於或小於β_乳球蛋白抗原性的1/100,000的抗原性。[2]根據[I]所述的肌肉萎縮防止劑，其中所述乳清蛋白水解物通過進行以下步驟來獲得在PH 6至10和溫度50至70°C下用耐熱性蛋白酶將乳清蛋白水解並熱變性的水解步驟，和通過加熱使所述蛋白酶失活的失活步驟。[3]根據[I]所述的肌肉萎縮防止劑，其中所述乳清蛋白水解物通過進行以下步驟來獲得在pH 6至10和溫度20至55°C下用蛋白酶將乳清蛋白水解的初步水解步驟，在PH 6至10和溫度50至70°C下用耐熱性蛋白酶將未水解的乳清蛋白水解並熱變性的水解步驟，和通過加熱使所述蛋白酶失活的失活步驟。[4]根據[I]所述的肌肉萎縮防止劑，其中所述乳清蛋白水解物通過進行以下步驟來獲得在PH 6至10和溫度20至55°C下用蛋白酶將乳清蛋白水解的初步水解步驟，在pH 6至10和溫度50至70°C下用耐熱性蛋白酶將未水解的乳清蛋白水解並熱變性的水解步驟，通過加熱使所述蛋白酶失活的失活步驟，用具有截留分子量I至20kDa的超濾膜過濾由所述失活步驟獲得的反應溶液以獲得濾液的超濾步驟，和用具有截留分子量100至500kDa的微濾膜過濾所述濾液的微濾步驟。[5] 一種肌肉萎縮防止食品、肌肉萎縮防止飲品、肌肉萎縮防止營養組合物或肌肉萎縮防止飼料，其包括根據[I]至[4]任一項所述的肌肉萎縮防止劑。
[6] 一種生產肌肉萎縮防止劑的方法，其包括在pH 6至10和溫度50至70°C下用耐熱性蛋白酶將乳清蛋白水解並熱變性的水解步驟，和通過加熱使所述蛋白酶失活的失活步驟。[7]根據[6]所述的方法，其進一步包括，在所述水解步驟前，在pH 6至10和溫度20至55°C下用蛋白酶將乳清蛋白水解的初步水解步驟。[8]根據[6]或[7]所述的方法，其進一步包括，在所述失活步驟後，用具有截留分子量I至20kDa的超濾膜過濾由所述失活步驟獲得的反應溶液以獲得濾液的超濾步驟，和用具有截留分子量100至500Da的微濾膜過濾所述濾液以獲得滯留物(retentate)的微濾步驟。[9] 一種肌肉萎縮防止方法，其包括將乳清蛋白水解物以IOg/天以上的量給藥，所述乳清蛋白水解物具有(I) IOkDa以下的範圍內的並具有200Da至3kDa的主峰的分子量分布，(2)2至8的平均肽鏈長度(APL)，(3)20%以下的游離胺基酸含量，(4)20%以上的支鏈胺基酸含量，和(5)等於或小於β_乳球蛋白抗原性的1/100,000的抗原性。 發明的效果根據本發明的一個方面的肌肉萎縮防止劑顯示顯著的肌肉萎縮防止效果。
具體實施例方式以下詳細描述本發明。活性成分用作根據本發明的一個實施方案的肌肉萎縮防止劑的活性成分的乳清蛋白水解物具有(I) IOkDa以下的範圍內的並具有200Da至3kDa的主峰的分子量分布，(2) 2至8的平均肽鏈長度(APL)，(3)20%以下的游離胺基酸含量，(4)20%以上的支鏈胺基酸含量，和
(5)等於或小於β_乳球蛋白抗原性的1/100,000的抗原性。由於乳清蛋白水解物具有等於或小於β_乳球蛋白和乳清蛋白抗原性的1/100，000的抗原性，因此乳清蛋白水解物在抑制食物過敏方面是極其安全的。乳清蛋白水解物的水溶液是透明的，並具有約2的苦味。因此，乳清蛋白水解物在風味(口感)和外觀方面不限制肌肉萎縮防止劑。特別地，大量乳清蛋白水解物甚至可存在於特別期望透明性的肌肉萎縮防止劑中。可通過用超濾(UF)膜或微濾(MF)膜過濾乳清蛋白水解物來改進乳清蛋白水解物的水溶性。可將該肌肉萎縮防止劑用作具有上述肌肉萎縮防止效果且非常安全的肌肉萎縮防止食品、肌肉萎縮防止飲品、肌肉萎縮防止營養組合物或肌肉萎縮防止飼料的活性成分。由於使用乳清蛋白作為原料生產根據本發明的一個實施方案的肌肉萎縮防止劑，因此可容易且經濟地生產肌肉萎縮防止劑。生產方法通過以下步驟獲得包括在根據本發明的一個實施方案的肌肉萎縮防止劑中的乳清蛋白水解物在PH 6至10和溫度50至70°C下用耐熱性蛋白酶將乳清蛋白水解並熱變性，並通過加熱使所述蛋白酶失活。可通過在pH 6至10和溫度20至55 °C下用蛋白酶將乳清蛋白初步水解，然後在未冷卻乳清蛋白的上述條件下，立即將乳清蛋白水解來改進乳清蛋白水解物的收率。
肌肉萎縮防止效果可通過以下步驟進一步改進用具有截留分子量I至20kDa (優選2至IOkDa)的超濾(UF)膜和/或具有截留分子量100至500Da (優選150至300Da)的微濾(MF)膜濃縮如上所述製備的乳清蛋白水解物。由此獲得的乳清蛋白水解物顯示較低苦味和改進的透明性。本文所使用的術語「乳清蛋白」是指哺乳動物(例如，牛、水牛、山羊或人)的乳清，其聚集體、粉末或純化蛋白質。當用蛋白酶將乳清蛋白水解時，乳清蛋白以水溶液的狀態使用。將乳清蛋白水溶液的pH調整為6至10。因為乳清蛋白水溶液通常具有上述範圍內的pH，因此通常不需要調整乳清蛋白水溶液的pH。當必須調整乳清蛋白水溶液的pH時，使用酸(例如，鹽酸、檸檬酸或乳酸)或鹼(例如，苛性鈉、氫氧化鈣或磷酸鈉)的溶液將乳清蛋白水溶液的PH調整為6至10。將乳清蛋白水溶液加熱到50至70°C。優選在加熱乳清蛋白水溶液前添加耐熱性蛋白酶，以便在加熱期間也發生水解(S卩，改善收率)。

普通蛋白酶的最佳溫度為40°C以下，耐熱性蛋白酶的最佳溫度為45°C以上。可使用任意耐熱性蛋白酶，只要該耐熱性蛋白酶具有45°C以上的最佳溫度即可。此耐熱性蛋白酶的實例包括木瓜蛋白酶、蛋白酶S(商標名稱)、Proleather (商標名稱)、Thermoase (商標名稱)、Alcalase (商標名稱)和Protin A (商標名稱)等。優選使用當在80°C下加熱30分鐘時還具有10%以上剩餘活性的耐熱性蛋白酶。組合使用多種蛋白酶更加有效。反應時間優選約30分鐘至約10小時。然後加熱反應溶液以使蛋白酶失活。可通過在100°C以上加熱反應溶液10秒以上來使蛋白酶失活。蛋白酶失活後，離心反應溶液。然後收集上清液並乾燥，從而獲得粉末產物。因為由離心所形成的沉澱與上清液相比，其低變應原性處於較低水平，因此優選除去沉澱。注意，只要不存在抗原性問題，則可乾燥並直接使用反應溶液。已證實當通過抑制ELISA法測定時，通過所述方法獲得的乳清蛋白水解物具有等於或小於β-乳球蛋白和乳清蛋白抗原性的1/100，000的抗原性。因此，乳清蛋白水解物極其安全。乳清蛋白水解物的水溶液是透明的，並具有約2的苦味。因此，乳清蛋白水解物很少引起有關風味(口感)和外觀的問題。注意，通過以下方法評價乳清蛋白水解物的透明性和苦味。透明性的評價方法製備1%乳清蛋白水解物溶液並測量650nm下的吸光度。苦味的評價方法製備10%乳清蛋白水解溶液，並使用鹽酸奎寧(苦味物)評價溶液的苦味。具有2以下苦味(參見表I)的乳清蛋白水解物可用於食品或飲品等。可通過HPLC等測量乳清蛋白水解物的APL。表I
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鹽酸奎寧濃度苦味
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用法根據本發明的一個實施方案的乳清蛋白水解物可直接用作肌肉萎縮防止劑，或可使用常規方法製成粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或飲劑(drinkable prepareation)等。用超濾(UF)膜或微濾(MF)膜獲得的乳清蛋白水解物可直接用作肌肉萎縮防止劑，或可乾燥後使用。還可使用常規方法將乳清蛋白水解物製成藥物等。可將製成藥物等的乳清蛋白水解物添加到營養製劑、食品或飲品(例如，酸奶、乳類飲料或薄餅(wafer))、飼料或補充劑等。肌肉萎縮防止食品、肌肉萎縮防止飲品、肌肉萎縮防止營養組合物或肌肉萎縮防止飼料中的乳清蛋白水解物的含量不特別限制，但優選使成人可以以IOg/天以上、優選20g/天以上的量攝取乳清蛋白水解物來確定。用作活性成分的乳清蛋白水解物可與適當的佐劑混合，並成形為任意口服製劑(肌肉萎縮防止劑)。 可將根據本發明的一個實施方案的肌肉萎縮防止劑施用給任何人，但優選施用給中年人(30歲以上)、老年人、長期處於不活動狀態(例如，長期石膏固定狀態或長期臥床不起的狀態)的人群以及在太空停留的人群。以下通過實施例和比較例進一步解釋本發明。注意本發明不受以下實施例限制。實施例I向IL 10%乳清蛋白水溶液中添加木瓜蛋白酶(50U/g ·乳清蛋白)和Proleather (由Amano Enzyme Inc.製造)(150U/g 乳清蛋白)。將混合物的pH調整到8後，在55°C下將乳清蛋白水解變性6小時。在100°C下加熱反應溶液15秒以上使蛋白酶失活。然後離心反應溶液，收集上清液並乾燥以獲得乳清蛋白水解物(實施例I產物)。乳清蛋白水解物(實施例I產物)具有IOkDa以下的範圍內並具有I. 3kDa的主峰的分子量分布，APL為7. 2,遊尚胺基酸含量為18. 9%。乳清蛋白水解物(實施例I產物)具有等於或小於β_乳球蛋白抗原性的1/100,000的抗原性(抑制ELISA法測定)。收率(即，上清液乾重與原料乾重的比(%))為80.3%。苦味為2。由此獲得的乳清蛋白水解物(實施例I產物)可直接用作根據本發明的一個實施方案的肌肉萎縮防止劑。實施例2向IL 10%乳清蛋白水溶液中添加木瓜蛋白酶(50U/g ·乳清蛋白)和Proleather (150U/g 乳清蛋白)。將混合物的pH調整到8後，在50°C下將乳清蛋白水解3小時。將該混合物加熱至55°C，在55°C下將乳清蛋白水解並變性3小時。接下來，在100°C下加熱混合物15秒以上使蛋白酶失活。通過具有截留分子量IOkDa的UF膜(由STC製造)和具有截留分子量300Da的MF膜(由STC製造)過濾反應溶液，從而收集濃縮液級分。然後乾燥該級分以獲得乳清蛋白水解物(實施例2產物)。乳清蛋白水解物(實施例2產物)具有IOkDa以下的範圍內並具有500Da的主峰的分子量分布，APL為3. O,遊尚胺基酸含量為15. 2%。乳清蛋白水解物(實施例2產物)具有等於或小於β-乳球蛋白抗原性的1/100，000的抗原性(抑制ELISA法測定)。收率為65. 4%。苦味為2。由此獲得的乳清蛋白水解物(實施例2產物)可直接用作根據本發明的一個實施方案的肌肉萎縮防止劑。比較例I將120g乳清蛋白溶解於1800ml的純水中，用IM苛性鈉溶液將該溶液的pH調整為7. O。在60°C下將該溶液滅菌10分鐘，並保持在45°C。在添加20g Amano A(由AmanoEnzyme Inc.製造)後,使混合物反應2小時。然後在80°C下將混合物加熱10分鐘從而使蛋白酶失活，並冷凍乾燥,從而獲得乳清蛋白水解物(比較例I產物)。乳清蛋白水解物的水解率為18%,收率為80. 6%。比較例2將120g乳清蛋白溶解於1800ml的純水中，用IM苛性鈉溶液將該溶液的pH調整為7. O。在60°C下將該溶液滅菌10分鐘，並保持在45°C。在添加20g Amano A(由AmanoEnzyme Inc.製造)後,使混合物反應8小時。然後在80°C下將混合物加熱10分鐘從而使蛋白酶失活，並冷凍乾燥，從而獲得乳清蛋白水解物。乳清蛋白水解物的水解率為30%，收率·為 80. 6%ο試驗例I透明性試驗製備實施例I和2以及比較例I和2中所獲得的各乳清蛋白水解物的1%水溶液，並測量650nm下的吸光度。結果示於表2。表權利要求
1.一種肌肉萎縮防止劑，其包括乳清蛋白水解物作為活性成分，所述乳清蛋白水解物具有(I) IOkDa以下的範圍內的並具有200Da至3kDa的主峰的分子量分布，(2) 2至8的平均肽鏈長度(APL)，(3)20%以下的游離胺基酸含量，(4)20%以上的支鏈胺基酸含量，和(5)等於或小於P -乳球蛋白抗原性的1/100，000的抗原性。
2.根據權利要求I所述的肌肉萎縮防止劑，其中所述乳清蛋白水解物通過進行以下步驟來獲得在PH 6至10和溫度50至70°C下用耐熱性蛋白酶將乳清蛋白水解並熱變性的水解步驟，和通過加熱使所述蛋白酶失活的失活步驟。
3.根據權利要求I所述的肌肉萎縮防止劑，其中所述乳清蛋白水解物通過進行以下步驟來獲得在pH 6至10和溫度20至55°C下用蛋白酶將乳清蛋白水解的初步水解步驟，在PH 6至10和溫度50至70°C下用耐熱性蛋白酶將未水解的乳清蛋白水解並熱變性的水解步驟，和通過加熱使所述蛋白酶失活的失活步驟。
4.根據權利要求I所述的肌肉萎縮防止劑，其中所述乳清蛋白水解物通過進行以下步驟來獲得在PH 6至10和溫度20至55°C下用蛋白酶將乳清蛋白水解的初步水解步驟，在pH 6至10和溫度50至70°C下用耐熱性蛋白酶將未水解的乳清蛋白水解並熱變性的水解步驟，通過加熱使所述蛋白酶失活的失活步驟，用具有截留分子量I至20kDa的超濾膜過濾由所述失活步驟獲得的反應溶液以獲得濾液的超濾步驟，和用具有截留分子量100至500Da的微濾膜過濾所述濾液的微濾步驟。
5.一種肌肉萎縮防止食品、肌肉萎縮防止飲品、肌肉萎縮防止營養組合物或肌肉萎縮防止飼料，其包括根據權利要求I至4任一項所述的肌肉萎縮防止劑。
6.一種生產肌肉萎縮防止劑的方法，其包括在pH 6至10和溫度50至70°C下用耐熱性蛋白酶將乳清蛋白水解並熱變性的水解步驟，和通過加熱使所述蛋白酶失活的失活步驟。
7.根據權利要求6所述的方法，其進一步包括，在所述水解步驟前，在pH6至10和溫度20至55°C下用蛋白酶將乳清蛋白水解的初步水解步驟。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其進一步包括，在所述失活步驟後，用具有截留分子量I至20kDa的超濾膜過濾由所述失活步驟獲得的反應溶液以獲得濾液的超濾步驟，和用具有截留分子量100至500Da的微濾膜過濾所述濾液以獲得滯留物的微濾步驟。
9.一種肌肉萎縮防止方法，其包括將乳清蛋白水解物以IOg/天以上的量給藥，所述乳清蛋白水解物具有(I)IOkDa以下的範圍內的並具有200Da至3kDa的主峰的分子量分布，(2)2至8的平均肽鏈長度(APL)，(3)20%以下的游離胺基酸含量，(4)20%以上的支鏈胺基酸含量，和(5)等於或小於乳球蛋白抗原性的1/100,000的抗原性。
全文摘要
本發明公開了一種肌肉萎縮防止劑，其對肌肉萎縮具有優異的防止效果，並包括乳清蛋白水解物。具體公開了一種包括乳清蛋白水解物的肌肉萎縮防止劑，其中所述乳清蛋白水解物具有10kDa以下的分子量分布(其中主峰出現在200Da至3kDa)，2至8的APL(平均肽鏈長度)，相對於全部成分總量的20%以下的游離胺基酸含量，20%以上的支鏈胺基酸含量，以及β-乳球蛋白抗原性的1/100,000以下的抗原性。
文檔編號A61P21/04GK102781460SQ20118001239
公開日2012年11月14日 申請日期2011年3月4日 優先權日2010年3月4日
發明者三浦晉, 內藤久士 申請人:雪印惠乳業株式會社