水溶性螢光樹枝狀大分子的合成方法及其應用的製作方法
2023-05-17 12:59:21 1
專利名稱：水溶性螢光樹枝狀大分子的合成方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於樹枝狀大分子合成、基因載體及生物細胞標記領域，特別涉及一類合成可生物降解的茈類螢光樹枝狀大分子應用於非病毒體系的基因載體。
背景技術：
伴隨先進生物技術療法的發展，基因導入體系變得更加重要。目前常用的基因載體主要有病毒型和非病毒型兩大類，病毒型基因轉染載體具有安全問題及低基因轉染效率的局限性，限制了它們的應用範圍。研發具有安全性的非病毒基因載體一直是生物材料領域的熱點研究課題。目前研究較多的非病毒基因載體體系主要有陽離子多聚合物型載體、可生物降解的聚合物體系、多複合物脂質體體系、熱敏型聚合物體系等。研究得比較多的陽離子型基因載體有聚乙烯亞胺(PEI)、聚賴氨酸(PLL)以及聚醯胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM ),其中樹枝狀高分子的應用研究尤其受到重視。茈及其衍生物具有很好的光、熱、化學穩定性、幾乎100%的螢光量子產率(FQY)、窄的螢光發射峰、能夠與細胞背景螢光(395-479nm)分開以及優異的染色性能，已廣泛應用於有機光電器件、雷射染料以及生物螢光探針領域。近年來，此類化合物已經應用於生物領域，如蛋白質靶向標記和細胞特異性標記等，然而水溶性差直接影響了它在這一領域的應用，因此提高此類化合物的水溶性及在水溶液中保持高螢光量子產率具有重要意義。在茈的外圍進行功能基團修飾可以使其最大吸收峰發生很大紅移，能夠更好的避開細胞背景螢光。樹枝狀大分子由於其精確的三維納米分子結構，分子內部存在著大量空腔、攜帶大量的表面官能團，能夠廣泛應用於生物醫藥領域，如藥物載體和基因載體等。目前所合成的以茈衍生物為螢光 核的樹枝狀大分子都具有良好的水溶性、生物相容性、較低的細胞毒性以及優異的細胞標記特性。然而，這些大分子合成步驟繁瑣，需要對中間產物保護與解保護，而保護/去保護的過程往往會反應不完全且伴有副反應，從而導致樹枝狀大分子結構存在缺陷；同時，這些合成的茈衍生物樹枝狀大分子呈現電中性，還沒有報導將它們應用於藥物載體和基因載體等方面。因而，發明一種簡單、高效的製備水溶性的茈類衍生物螢光樹枝狀大分子的方法，對於其在生物醫藥領域(如細胞標記、藥物載體、基因載體等)具有非常重要的意義。
發明內容
本發明的目的在於提供一類光、熱、化學穩定性好、水溶性好、可生物降解、結構可設計性的茈類螢光樹枝狀大分子，且其具有很好的生物相容性、細胞標記性。首先通過成熟的合成方法製備攜帶四個伯胺官能團的茈螢光核A0，然後通過不對稱單體選擇性「點擊」化學反應，合成不同代數、攜帶不同官能團的螢光樹枝狀大分子。將攜帶不同氨基官能團的螢光陽離子樹枝狀大分子B1、B2和B3分別與活體細胞進行培養，研究其穿透細胞膜的能力；將B1、B2和B3分別與DNA複合，然後與細胞進行培養，研究其運載基因的能力。
合成一類以茈衍生物為螢光核的樹枝狀大分子，包括:(1)攜帶官能基團的茈類衍生物及其類似物(本發明選擇多環芳香族烴的萘，芘，茈，terylene和它們的衍生物作為螢光發射團)與不對稱單體AB (AB型不對稱單體為甲基丙烯醯氧基丙烯酸乙酯、甲基丙烯醯氧基丙烯酸丙酯或甲基丙烯醯氧基乙氧基乙氧基丙烯酸乙酯)反應後，重複依次加入不對稱單體巰基乙胺和AB，通過AB與巰基乙胺之間選擇性「點擊」化學反應製備茈類螢光樹枝狀大分子。(2)茈螢光樹枝狀大分子端基的官能化修飾:將羥基、PEG鏈功能基團引入到螢光樹枝狀大分子的最外圍末端。(3)水溶性陽離子螢光樹枝狀大分子應用於基因載體，研究B1、B2、B3穿透細胞膜及運載基因能力。其具體製備步驟為:1.樹枝狀大分子的設計合成1.1首先以商業螢光化合物四溴茈酐(4Br-PDA)為原料，經過醯胺化反應合成具有高螢光量子產率的茈類衍生物4Br-PBI ;然後利用取代反應將氨基引入到茈核的「海島」位置，從而得到攜帶四個伯胺基團的茈類化合物AO (化合物AO屬於茈類螢光發射團系列)，其結構式如下:
權利要求
1.水溶性螢光樹枝狀大分子的合成方法，其特徵在於: 四個伯胺基團的茈類化合物，以下簡稱化合物A0，化合物AO的結構式如下:
2.根據權利要求1所述的水溶性螢光樹枝狀大分子的合成方法，其特徵在於還包括: 將上述Al和巰基乙胺按照摩爾比在1:9-1:11之間溶解在二甲基亞碸DMSO中，在氮氣氛圍下室溫攪拌30-45min後，得到氨基官能化的第一代螢光樹枝狀大分子BI。
3.根據權利要求2所述的水溶性螢光樹枝狀大分子的合成方法，其特徵在於還包括: 將上述化合物BI和MAEA按照摩爾比在1:32-1:80之間混合加入反應管中，在氮氣氛圍下室溫攪拌過夜，然後在48-53°C反應56-72h，得到端甲基丙烯酸酯的第二代螢光樹枝狀大分子A2。
4.根據權利要求3所述的水溶性螢光樹枝狀大分子的合成方法，其特徵在於還包括: 將上述A2和巰基乙胺按照摩爾比在1:18-1:21之間溶解在二甲基亞碸DMSO中，在氮氣氛圍下室溫攪拌30-45min後，得到氨基官能化的第二代螢光樹枝狀大分子B2。
5.根據權利要求4所述的水溶性螢光樹枝狀大分子的合成方法，其特徵在於還包括: 將上述化合物B2和MAEA按照摩爾比在1:80-1:400之間混合加入反應管中，在氮氣氛圍下室溫攪拌過夜，然後在48-53°C反應72-120h，得到端甲基丙烯酸酯的第三代螢光樹枝狀大分子A3 ； 將上述A3和巰基乙胺按照摩爾比在1:38-1:42之間溶解在二甲基亞碸DMSO中，在氮氣氛圍下室溫攪拌30-45min後，得到氨基官能化的第三代螢光樹枝狀大分子B3。
6.根據權利要求1或3或5所述的水溶性突光樹枝狀大分子的合成方法,其特徵在於還包括: 將上述Al和巰基甘油按照摩爾比在1:18-1:22之間溶解在DMSO中，並以三乙胺為催化劑，氮氣氛圍下室溫攪拌22-26h後，得到羥基官能化的第一代螢光樹枝狀大分子Cl ；將上述A2和巰基甘油按照摩爾比在1:36-1:42之間溶解在DMSO中，並以三乙胺為催化劑，氮氣氛圍下室溫攪拌35-38h後，得到羥基官能化的第二代螢光樹枝狀大分子C2 ；將上述A3和巰基甘油按照摩爾比在1:80-1:100之間溶解在DMSO中，並以三乙胺為催化劑，氮氣氛圍下室溫攪拌38-48h後，得到羥基官能化的第三代螢光樹枝狀大分子C3。
7.根據權利要求2或4所述的水溶性螢光樹枝狀大分子的合成方法，其特徵在於還包括:化合物AO與乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在無溶劑、無催化劑、氮氣氛圍下室溫攪拌過夜，然後在48-52°C反應48-56h，合成出了端PEG鏈的第一代茈類螢光樹枝狀大分子Dl ；化合物BI與乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在無溶劑、無催化劑、氮氣氛圍下室溫攪拌過夜，然後在48-55°C反應68-72h，合成出了端PEG鏈的第二代茈類螢光樹枝狀大分子D2 ；化合物B2與乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在無溶劑、無催化劑、氮氣氛圍下室溫攪拌過夜，然後在48-60°C反應78-100h，合成出了端PEG鏈的第三代茈類螢光樹枝狀大分子D3。
8.採用權利要求2或4或5所述方法合成的大分子的應用，其特徵在於還包括: 將合成的樹枝狀大分子BI，B2, B3用1-4M的酸酸化處理後，按加入細胞培養液中，培養活體細胞I小時以上後，這些分子都能進入活體細胞；這些分子能和外源核酸物質DNA或RNA結合,充當載體, 攜帶外源核酸物質轉染活體細胞。
全文摘要
本發明公開了水溶性螢光樹枝狀大分子的合成方法及其應用。該類樹枝狀大分子採用「發散法」或「收斂法」製備了不同代數、攜帶不同官能團的螢光樹枝狀大分子。其中外圍攜帶銨鹽陽離子的螢光樹枝狀大分子具有良好的水溶性和生物相容性，能夠進入活細胞，並且能與負電性的DNA結合，可以作為基因載體將外源核酸構件DNA或RNA帶入細胞。細胞攝取實驗表明隨著代數的增加，樹枝狀大分子穿透細胞膜及運載基因的能力增強。本發明具有合成簡便、效率高、產品純化簡單等優點，且合成的樹枝狀大分子安全低毒、水溶性優異、光穩定性好，可作為多功能細胞螢光標記分子、基因載體，應用於生物醫藥領域的科學研究和基因診斷。
文檔編號C08G83/00GK103204999SQ20131009519
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月22日 優先權日2013年3月22日
發明者尹梅貞, 許澤軍, 何碧程, 沈傑 申請人:北京化工大學