人血管生成抑制素基因、含有該基因的載體和菌株及其表達產物的生產和應用的製作方法
2023-05-17 12:50:51 3
專利名稱：人血管生成抑制素基因、含有該基因的載體和菌株及其表達產物的生產和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及人血管生成抑制素基因、含有該基因的載體以及用該載體轉化的微生物菌株及其表達產物的生產和應用。
臨床上常見某些原位腫瘤經手術切除後，往往加速其遠位轉移瘤的生氏。多年來，這一現象的機制一直懸而未決。1994年，O』Reilly等人從接種Lewis肺癌低轉移突變株(LLC-LM)小鼠的尿液和血清中分離純化得到一種蛋白質，命名為血管生成抑制素(Angiostatin)。抗體中和實驗表明血管生成抑制素是原發瘤抑制轉移瘤生長的關鍵，動物實驗研究表明血管生成抑制素對人前列腺癌、乳腺癌、結腸癌等細胞株在小鼠體內形成的原發瘤有95％以上的抑制作用，顯示其在腫瘤治療研究領域誘人的應用前景。
血管生成旺盛是實體腫瘤組織得以迅速生長和轉移的基礎。人血管生成抑制素通過抑制新生血管的形成，切斷腫瘤的血液供應和營養供給從而抑制腫瘤生長。由於正常組織的血管內皮細胞是不再分裂增殖的，因而不受該藥物的影響，這充分顯示此類生物基因工程藥物優於以往的抗癌藥物，具有高度的選擇性、特異性和極小的毒副作用。由於從血液或尿液中提取，或經彈性蛋白酶消化製得的血管生成抑制素來源有限且價格昂貴，因而利用基因工程技術生產重組人血管生成抑制素十分必要。
本發明的目的是利用基因工程技術，提供重組人血管生成抑制素基因，構建含有該基因的載體，特別是表達載體及其轉化的微生物菌株，並且提供由這些菌株高效表達、生產重組人血管生成抑制素的方法及表達產物的應用。
胺基酸序列分析表明血管生成抑制素是纖溶酶原的一個內片段，相當於纖溶酶原第98至440位胺基酸序列，即Kringle1-4(至少包括Kringle1-3)。人纖溶酶原經彈性蛋白酶消化後產生這一區段，具有抑制毛細血管內皮細胞增殖，抑制血管生成和轉移瘤生長的生物活性，而完整的纖溶酶原並不具有這一活性。
本發明的人血管生成抑制素基因是以人纖溶酶原cDNA為模板，經PCR方法擴增而得到的，它來源於人纖溶酶原cDNA的Kringle1-4或Kringle1-3結構域所對應的基因片段。
按照上述的人血管生成抑制素基因，它最好是人纖溶酶原cDNA上292bp至1320bp(相當於98位至440位胺基酸)的片段，其核甘酸序列及其所編碼的胺基酸序列如序列表1(SEQID No.1)所示。
本發明所用作模板的人纖溶酶原cDNA已在以下文獻中公開Forsgren M,et al.Molecular cloning and characterization of a full-length cDNAclone for human plasminogen.FEBS Lett,1987,213:254-260本發明還構建了含有上述人血管生成抑制素基因的載體；特別是含有該基因的大腸桿菌表達載體以及枯草桿菌、假絲酵母和漢遜酵母的表達載體。這些載體的構建方法是按常規方法，將通過PCR方法合成的人血管生成抑制素基因經酶切和分離純化後，接入到已有的相應載體的相應酶切位點之間，即構建成所需的含有人血管生成抑制素基因的表達載體。
上述含人血管生成抑制素基因的大腸桿菌表達載體優選由本發明合成的人血管生成抑制素基因與大腸桿菌表達載體pBV220構建成的重組表達載體，命名為pBVA2。其構建圖和酶切分析見圖2及圖3。本發明還用上述含有人血管生成抑制素基因的相應表達載體分別構建了能高效表達人血管生成抑制素的大腸桿菌重組株以及枯草桿菌、假絲酵母和漢生酵母重組株。
本發明還提供了利用上述大腸桿菌重組株生產人血管生成抑制素的方法。先將菌株進行培養發酵並經熱誘導使其高效表達人血管生成抑制素重組蛋白，再收集菌體，經分離純化得到重組人血管生成抑制素產品。
本發明的上述能表達人血管生成抑制素的大腸桿菌重組菌株優選由含有人血管生成抑制素基因的表達載體pBVA2轉化大腸桿菌DH5α而得到的菌株，命名為Escherichia coliDH5α(pBVA2)，簡稱E.coli DH5α(pBVA2)。
利用該大腸桿菌重組菌株E.coli DH5α(pBVA2)生產人血管生成抑制素的具體方法為(1)菌種的培養發酵將菌種(挑取單菌落)接種在含有氨苄青黴素的LB液體培養基中30～37℃,150～200轉/分培養過夜，次日轉種於相同的培養基中，30～37℃,150～250轉/分培養2～4h，升溫至42℃繼續振搖培養3～4h後收菌；(2)表達產物的純化收集上述培養的菌體，將細胞破碎後離心收集包涵體沉澱，用含Triton X-100和2M尿素的TE溶液反覆洗滌沉澱，然後將沉澱溶於8M尿素中，用復性液復性並經Sephadex G-100凝膠過濾層析，對水透析，經凍幹即為純化的人血管生成抑制素。
上述方法中的菌種培養發酵步驟還可採用15升發酵罐進行高密度發酵，以提高生產效率和產量。
上述方法所得到的重組人血管生成抑制素在雞胚絨毛尿囊膜實驗和動物實驗中表現出抗血管生成及對腫瘤生長和轉移的強抑制作用，所以可作為有效成份用於製備新一代的抗腫瘤(抗癌)藥物。
本發明的大腸桿菌重組菌株E.coli DH5α(pBVA2)已保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國武漢大學校內)，保藏編號CCTCC M98014，保藏日1998年9月21日。
由該E.coli DH5α(pBVA2)菌株可擴增、提取得到本發明的重組表達載體pBVA2及人血管生成抑制素基因。方法是(1)取E.coli DH5α(pBVA2)單菌落接種於LB培養基中，37℃培養過夜，離心收集菌種，用常規的鹼裂解法提取質粒pBVA2。
(2)用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶解質粒pBVA2產生兩條帶，分離提取約1kb的小帶即為人血管生成抑制素基因。
用上述得到的人血管生成抑制素基因與適當的載體連接，即可構建出所需的含人血管生成抑制素基因的載體。用所構建的表達載體即可轉化並構建出相應的能表達重組人血管生成抑制素的重組菌株。
本發明的人血管生成抑制素基因通過與適當的表達載體連接後可在相應的微生物菌株中高效表達，經分離純化即可獲得高純度的重組人血管生成抑制素，而且具有表達水平高，容易純化的優點。例如，本發明的由含有人血管生成抑制素基因的表達載體pBVA2轉化的大腸桿菌株E.coli DH5α(pBVA2)，其對人血管生成抑制素的表達量可達263mg/L(培養物)。所以，通過本發明，可方便地大量生產重組人血管生成抑制素，而且成本較低。這將為獲得來源穩定、成本便宜的重組人血管生成抑制素並用其製備高療效低毒副作用的新一代抗癌(腫瘤)藥物提供一條切實可行的途徑。
以下通過實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。
圖1是以人纖溶酶原cDNA為模板的PCR擴增產物(重組人血管生成抑制素基因)的凝膠電泳分析圖。其中1．PCR產物2．分子量標準3．pCR2.1 4．pCR2.1-A/EcoRⅠ。
圖2是重組表達載體pBVA2的構建過程示意圖，其中，PR、PL為(噬菌體啟動子，T1、T2為rrnB的轉錄終止序列。
圖3是質粒pBVA2的酶切分析，其中1．pBV220/EcoRⅠ+BamHⅠ,2．pMA1/EcoRⅠ+BamHⅠ,3．pBVA2/EcoRⅠ+BamHⅠ,4．分子量標準。
圖4是重組人血管生成抑制素基因表達產物的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜。其中，1．蛋白質分子量標準，2．E.coli DH5α(pBVA2)不誘導，3．E.coli DH5α(pBV220)誘導，4．E.coliDH5α(pBVA2)誘導，5．E.coli DH5α(pBVA2)裂解物上清，6．E.coli DH5α(pBVA2)裂解物沉澱。
圖5是重組人血管生成抑制素基因表達產物的CAM血管生成抑制活性分析結果示意圖。其中(A)為負對照，(B)為添加本發明生產的重組人血管生成抑制素的結果。
圖6示重組人血管生成抑制素基因表達產物對小鼠黑色素瘤的抑制作用，其中，單只為不用藥對照小鼠，雙只為用藥小鼠。
實施例1人血管生成抑制素基因的合成根據已發表的人纖溶酶原cDNA全序列，設計合成兩段引物，上遊引物是在第292位鹼基起的18個同源鹼基前加上SalⅠ,EcoRⅠ的限制酶切位點以及起始密碼子ATG(5』CCGTCGACGAATTCAATGTATCTCTCAGAGTGCAAC)，下遊引物是在第1320位鹼基起的前18個同源鹼基加上限制酶切位點BamHⅠ,HindⅢ和終止密碼子TAG(5』-CCCAAGCTTGGATCCTAGTCTGTGGTAAAACACCAG)，以人纖溶酶原cDNA為模版，經PCR方法擴增人纖溶酶原第98位至440位胺基酸序列相應的DNA序列即人血管生成抑制素基因，反應條件為第一循環94℃變性4分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；以後各循環94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，共25個循環。
PCR擴增產物的電泳鑑定圖見圖1。從圖1可見PCR擴增了一段長約1.0kb的序列。
將擴增產物連接到T-載體pCR2.1TM上得到重組質粒pCR2.1A。以重組質粒pCR2.1A為模版，pCR2.1TM的一對通用引物和合成的一對與目的基因中間一段同源的引物進行序列測定，結果證實PCR產物與人纖溶酶原cDNA上第292位至1320位鹼基序列一致，表明克隆的PCR產物是人血管生成抑制素基因。人血管生成抑制素基因序列測定結果見序列表1。為了構建表達載體的方便，用SalⅠ及HindⅢ從pCR2.1A上將人血管生成抑制素基因切下轉入質粒pMl的SalⅠ及HindⅢ位點上獲得重組質粒pMA1。
實施例2含人血管生成抑制素基因的大腸桿菌表達載體pBVA2的構建質粒pMA1經限制酶EcoRⅠ及BamHⅠ酶切後走瓊脂糖凝膠電泳，分離純化約1.0kb的人血管生成抑制素基因片段；大腸桿菌表達質粒pBV220經限制酶EcoRⅠ及BamHⅠ酶切後分離純化3.67kb的大片段，與1.0kb的人血管生成抑制素基因片段按1∶2混合，用T4連接酶連接16小時後用標準氯化鈣轉化法轉入大腸桿菌DH5α中，篩選具氨苄青黴素抗性的轉化子，以標準方法提取質粒，篩選大小約4.7kb的重組質粒，用限制酶EcoRⅠ及BamHⅠ酶切重組質粒，得到1.0kb和3.67kb的兩個片段，大小分別與人血管生成抑制素基因和表達載體pBV220大小相同，證明人血管生成抑制素基因已克隆入大腸桿菌表達載體pBV220中，重組質粒命名為pBVA2。質粒構建圖和酶切分析圖見圖2及圖3。
實施例3能高效表達人血管生成抑制素的大腸桿菌重組株E.coli DH5α(pBVA2)的構建用CaCl2法將pBVA2轉化E.coli DH5α，在含氨苄青黴素的LB平板上篩選轉化子，經質粒檢測和酶切分析獲得含pBVA2的重組轉化子E.coli DH5α(pBVA2)。
實施例4含血管生成抑制素基因的枯草桿菌漢生酵母和假絲酵母工程菌的構建。
(1)枯草桿菌工程菌DB1342(pURTQAg)的構建用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切質粒pCR2.1A，分離1kb的小片段即人血管生成抑制素基因，然後將此片段插入質粒pURTQ4的相應位點上，獲得含人血管生成抑制素基因的質粒pURTQAg。
用感受態轉化法將pURTQAg轉入枯草桿菌DB1342，即獲得枯草桿菌工程菌DB1342(pURTQAg)。
(2)漢生酵母工程菌Hansenula polymorpha A16(pMIRHA2)的構建。
用限制酶SalⅠ及HindⅢ酶切質粒pMA1，分離人血管生成抑制素基因，重組進質粒pMIRH-2獲得含人血管生成抑制素基因的重組質粒pMIRHA2，然後用LiCl轉化法將pMIRHA2引入漢生酵母Hansenula polymorpha A16，獲得漢生酵母工程菌Hansenula polymorpha A16(pMIRHA2)。
(3)假絲酵母工程菌Candida boidinii(pULA3)的構建。
用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ將人血管生成抑制素基因從質粒pCR2.1A上切下，轉入大腸桿菌-酵母質粒pUL4，獲得含人血管生成抑制素基因的重組質粒pULA3，再用LiCl轉化法將pULA3引入波氏假絲酵母獲得含人血管生成抑制素基因的工程菌Candida boidinii(pULA3)。
實施例5利用大腸桿菌基因T程菌F.coli DH5α(pBVA2)生產重組人血管生成抑制素。
(1)菌種的培養發酵挑取大腸桿菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVA2)單菌落接種在含100ug/ml氨苄青黴素的液體LB培養基中，30℃,200轉/分鐘振蕩培養過夜，次日按10％接種量轉種於適當體積的相同培養基中，按30℃,250轉/分鐘振蕩培養3小時，待A600約為0.4時轉至45℃水浴中搖動5分鐘，使之迅速升溫至42℃誘導外源基因表達，在42℃條件下繼續振蕩培養4小時後收菌。合成的人血管生成抑制素基因在大腸桿菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVA2)中已獲得高效表達。
另外，可以通過15升發酵罐進行高密度發酵。挑取大腸桿菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVA2)單菌落接種在含100μg/ml氨苄青黴素的液體LB培養基中，30℃200轉/分鐘振蕩培養過夜，按1％轉種到4個500mL三角瓶中，每瓶含250mL的LB培養液，含50μg/mL氨苄青黴素，30℃ 200轉/每分鐘搖床培養12小時作為種子液。15升發酵罐B.Braun Biostat C型，含9升LB培養液，少量食用油作為防沫劑。120℃滅菌20分鐘，加1克氨苄青黴素，1升種子液。pH6.8-7.4，攪拌速度500轉/每分鐘，通氣量4-6升/每分鐘，溶氧50％,30℃發酵3小時至A600=0.5，升溫至42℃進行熱誘導4小時完成發酵從10升發酵液中得到50克溼菌體，重組人血管生成抑制素表達量為263mg/mL。
取少量細胞加2×上樣緩衝液，煮沸5分鐘後按標準方法走SDS-PAGE凝膠電泳。結果見圖4，顯示經誘導的DH5α(pBVA2)在43kd的位置上出現一條新的蛋白帶，未誘導的DH5α(pBVA2)及DH5α(pBV220)不出現此帶，證明人血管生成抑制素已在DH5α(pBVA2)中誘導表達。
(2)表達的重組人血管生成抑制素的純化收集高效表達重組人血管生成抑制素的菌體，經超聲波破碎後離心收集包含體沉澱，用含TritonX-100的TE溶液和含2M尿素的TE溶液反覆洗滌沉澱，除去細胞碎片，雜蛋白，核酸等雜質，最終包含體中目標蛋白純度為90％以上。回收率76％。按每10毫克包含體加2毫升含8M尿素的溶解緩衝液中，室溫放置1小時即可溶解。緩緩加入10倍體積的復性液復性。復性蛋白經Sephadex G-100柱(1.5×50cm)凝膠過濾層析，用洗脫緩衝液洗脫，流速3mL/min，每管收集5毫升測定A280，繪製洗脫曲線。收集各吸收峰進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，將目標峰樣品滴加等體積復性液，4℃攪拌24小時，使之進一步復性，再對水充分透析，凍幹即為重組人血管生成抑制素純品。
實施例6 CAM血管生成抑制活性分析在6天齡雞胚的載樣濾紙片上加30ng bFGF作為對照，實驗組加同劑量的bFGF和不同劑量的重組人血管生成抑制素，作用48小時後觀察。結果表明，對照組的絨毛尿囊膜在bFGF作用下有明顯的放射狀新生毛細血管芽形成，實驗組隨著重組人血管生成抑制素劑量的增加，新生毛細血管的形成受不同程度的抑制，50μg/只和100μg/只劑量組減少了新生毛細血管的數量但未能完全抑制新生毛細血管的生成，而200μg/只劑量組則管生成抑制素在濾紙片中心附近形成無血管區，如圖5所示。
實施例7重組人血管生成抑制素對小鼠原位B16黑色素瘤生長的抑制作用C57B16/J小鼠。20±2g,20隻，背部皮下接種0.2mL B16黑色素瘤細胞懸液(5×106個/mL)。接種10天後待瘤體積達100-200mm3時，將小鼠隨機分5組，每組4隻1)對照組注射0.3ml PBS；2)50mg/kg體重劑量組，每12小時投藥一次；3)100mg/kg體重劑量組，每24小時投藥一次；4)150mg/kg體重劑量組，每24小時投藥一次；5)200mg/1kg體重劑量組，每24小時投藥一次；兩周後觀察小鼠體重及瘤體積重量的變化。從結果可見，重組人血管生成抑制素可高效抑制B16黑色素瘤細胞的生長，抑瘤效應呈劑量依賴性。結果如表1和圖6所示。
表1 Ecoli DH5α(pBVA2)表達產物對C57BL6/J小鼠原位B16黑色素瘤的生長抑制作用
序列表1(SEQ ID No.1)CCGTCGACGA ATTCA ATG TAT CTC TCA GAG TGC AAG ACT GGG AAT GGA48Met Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly1 5 10AAG AAC TAC AGA GGG ACG ATG TCC AAA ACA AAA AAT GGC ATC ACC TGT96Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys15 20 25CAA AAA TGG AGT TCC ACT TCT CCC CAC AGA GCT AGA TTC TCA CCT GCT144Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala30 35 40ACA CAC CCC TCA GAG GGA CTG GAG GAG AAC TAC TGC AGG AAT CCA GAC192Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp45 50 55AAC GAT CCG CAG GGG CCC TGG TGC TAT ACT ACT GAT CCA GAA AAG AGA280Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg60 65 70 75TAT GAC TAC TGC GAC ATT CTT GAG TGT GAA GAG GGA TGT ATG CAT TGC328Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys80 85 90AGT GGA GAA AAC TAT GAC GGC AAA ATT TCC AAG ACC ATG TCT GGA CTG376Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu95 100 105GAA TGC CAG GCC TGG GAC TCT CAG AGC CCA CAC GCT CAT GGA TAC ATT424Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile110 115 120CCT TCC AAA TTT CCA AAC AAG AAC CTG AAG AAG AAT TAC TGT CGT AAC472Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn125 130 135CCC GAT AGG GAG CTG CGG CCT TGG TGT TTC ACC ACC GAC CCC AAC AAG520Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys140 145 150 155CGC TGG GAA CTT TGC GAC ATC CCC CGC TGC ACA ACA CCT CCA CCA TCT568Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser160 165 170TCT GGT CCC ACC TAC CAG TGT CTG AAG GGA ACA GGT GAA AAC TAT CGC616Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg175 180 185GGG AAT GTG GCT GTT ACC GTT TCC GGG CAC ACC TGT CAG CAC TGG AGT664Gly Asn Val Ala Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser190 195 200GCA CAG ACC CCT CAC ACA CAT AAC AGG ACA CCA GAA AAC TTC CCC TGC712Ala Gln Thr Pro His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys205 210 215AAA AAT TTG GAT GAA AAC TAC TGC CGC AAT CCT GAC GGA AAA AGG GCC760Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala220 225 230 235CCA TGG TGC CAT ACA ACC AAC AGC CAA GTG CGG TGG GAG TAC TGT AAG808Pro Trp Cys His Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys240 245 250ATA CCG TCC TGT GAC TCC TCC CCA GTA TCC ACG GAA CAA TTG GCT CCC856lle Pro Ser Cys Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro255 260 265ACA GCA CCA CCT GAG CTA ACC CCT GTG GTC CAG GAC TGC TAC CAT GGT904Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly270 275 280GAT GGA CAG AGC TAC CGA GGC ACA TCC TCC ACC ACC ACC ACA GGA AAG952Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys285 290 295AAG TGT CAG TCT TGG TCA TCT ATG ACA CCA CAC CGG CAC CAG AAG ACC 1000Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gin Lys Thr300 305 310 315CCA GAA AAC TAC CCA AAT GCT GGC CTG ACA ATG AAC TAC TGC AGG AAT 1048Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn320 325 330CCA GAT GCC GAT AAA GGC CCC TGG TGT TTT ACC ACA GAC TAG 1090Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp335340GATCCAAGCT TGGG 110權利要求
1．人血管生成抑制素基因，其特徵是它是以人纖溶酶原cDNA為模板，經PCR方法擴增而得到的來源於人纖溶酶原cDNA的Kringle1-4或Kringle1-3結構域所對應的基因片段。
2．按照權利要求1所述的來源於人纖溶酶原eDNA Kringle1-4結構域所對應的基因片段的人血管生成抑制素基因，其特徵是它是人纖溶酶原cDNA上292bp至1320bp(相當於第98位胺基酸至440位胺基酸)的片段，其核苷酸序列及其所編碼的胺基酸序列如下CCGTCGACGA ATTCA ATG TAT CTC TCA GAG TGC AAG ACT GGG AAT GGA48Met Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly1 5 10AAG AAC TAC AGA GGG ACG ATG TCC AAA ACA AAA AAT GGC ATC ACC TGT96Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys15 20 25CAA AAA TGG AGT TCC ACT TCT CCC CAC AGA CCT AGA TTC TCA CCT GCT144Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala30 35 40ACA CAC CCC TCA GAG GGA CTG GAG GAG AAC TAC TGC AGG AAT CCA GAC192Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp45 50 55AAC GAT CCG CAG GGG CCC TGG TGC TAT ACT ACT GAT CCA GAA AAG AGA240Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg60 65 70 75TAT GAC TAC TGC GAC ATT CTT GAG TGT GAA GAG GGA TGT ATG CAT TGC288Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys80 85 90AGT GGA GAA AAC TAT GAC GGC AAA ATT TCC AAG ACC ATG TCT GGA CTG336Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu95 100 105GAA TGC CAG GCC TGG GAC TCT CAG AGC CCA CAC GCT CAT GGA TAC ATT384Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile110 115 120CCT TCC AAA TTT CCA AAC AAG AAC CTG AAG AAG AAT TAC TGT CGT AAC432Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Ash Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn125 130 135CCC GAT AGG GAG CTG CGG CCT TGG TGT TTC ACC ACC GAC CCC AAC AAG 480Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys140 145 150 155CGC TGG GAA CTT TGC GAC ATC CCC CGC TGC ACA ACA CCT CCA CCA TCT 528Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser160 165 170TCT GGT CCC ACC TAC CAG TGT CTG AAG GGA ACA GGT GAA AAC TAT CGC 576Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg175 180 185GGG AAT GTG GCT GTT ACC GTT TCC GGG CAC ACC TGT CAG CAC TGG AGT 624Gly Asn Val Ala Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser190 195 200GCA CAG ACC CCT CAC ACA CAT AAC AGG ACA CCA GAA AAC TTC CCC TGC 672Ala Gln Thr Pro His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys205 210 215AAA AAT TTG GAT GAA AAC TAC TGC CGC AAT CCT GAC GGA AAA AGG GCC 720Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala220 225 230 235CCA TGG TGC CAT ACA ACC AAC AGC CAA GTG CGG TGG GAG TAC TGT AAG 768Pro Trp Cys His Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys240 245 250ATA CCG TCC TGT GAC TCC TCC CCA GTA TCC ACG GAA CAA TTG GCT CCC 816Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro255 260 265ACA GCA CCA CCT GAG CTA ACC CCT GTG GTC CAG GAC TGC TAC CAT GGT 864Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly270 275 280GAT GGA CAG AGC TAC CGA GGC ACA TCC TCC ACC ACC ACC ACA GGA AAG 912Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys285 290 295AAG TGT CAG TCT TGG TCA TCT ATG ACA CCA CAC CGG CAC CAG AAG ACC 960Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr300 305 310 315CCA GAA AAC TAC CCA AAT GCT GGC CTG ACA ATG AAC TAC TGC AGG AAT 1008Pro Glu Asn Tyr Pro Ash Ala Gly Leu Thr Met Ash Tyr Cys Arg Asn320 325 330CCA GAT GCC GAT AAA GGC CCC TGG TGT TTT ACC ACA GAC TAG 1050Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp335 340GATCCAAGCT TGGG 1064
3．一種載體，其特徵是該載體含有權利要求1或2所述的人血管生成抑制素基因。
4．按照權利要求3所述的載體，其特徵是該載體為大腸桿菌表達載體。
5．按照權利要求4所述的載體，其特徵是該載體為pBVA2。
6．按照權利要求3所述的載體，其特徵是該載體為枯草桿菌、假絲酵母或漢生酵母表達載體。
7．由權利要求4或5所述的表達載體轉化的能表達人血管生成抑制素的大腸桿菌。
8．按照權利要求7所述的大腸桿菌，其特徵是它是由權利要求6的表達載體pBVA2轉入大腸桿菌DH5α中所形成的大腸桿菌重組株E.coli DH5α(pBVA2)即CCTCC M98014。
9．由權利要求6所述載體轉化的能表達人血管生成抑制素的枯草桿菌、假絲酵母或漢生酵母。
10．利用權利要求7的大腸桿菌生產人血管生成抑制素的方法，先將菌株培養發酵並經熱誘導使其高效表達人血管生成抑制素重組蛋白，再收集菌體經分離純化得到重組人血管生成抑制素產品。
11．按照權利要求10所述的方法，其特徵是所用的大腸桿菌為CCTCC M98014。
12．按照權利要求11所述的方法，其特徵是具體步驟為(1)菌種的培養發酵將菌種接種在含有氨苄青黴素的LB液體培養基中，30-37℃，150-200轉/分培養過夜，次日轉種於相同培養基中，30-37℃，150-200轉/分培養2-4小時，升溫至42℃繼續振蕩培養3-4小時後收菌；(2)表達產物的純化收集上述培養的菌體，將細胞破碎後離心收集包含體沉澱，用含TritonX100和2M尿素的TE溶液反覆洗滌沉澱，然後將沉澱溶於8M尿素中，用復性液復性並經Sephadex G-100凝膠過濾層析，對水透析，經凍幹即為純化的重組人血管生成抑制素。
13．按照權利要求12所述的方法，其特徵是其中的菌種培養發酵是採用15升發酵罐進行高密度發酵。
14．將按照權利要求10至13之一所述的方法獲得的重組人血管生成抑制素用於製備抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發明屬於基因工程技術領域。本發明以人纖溶酶原cDNA為模板,經PCR方法合成人血管生成抑制素基因,並構建了含有該基因的載體和重組菌株。特別是含有該基因的大腸桿菌表達載體pBVA2及其轉化的大腸桿菌重組株DH5α(pHVA2),和利用該菌株生產重組人血管生成抑制素的方法。該菌株具有表達量高,表達產物易純化等優點。本發明將為獲得來源穩定價格便宜的重組人血管生成抑制素並用其製備新一代抗癌藥物提供一條切實可行的途徑。
文檔編號C12P21/00GK1224758SQ98113368
公開日1999年8月4日 申請日期1998年9月25日 優先權日1998年9月25日
發明者羅進賢 申請人:中山大學