利用rt-lamp方法快速檢測植株中南方水稻黑條矮縮病毒的製作方法

2023-05-17 14:06:41 1

專利名稱：利用rt-lamp方法快速檢測植株中南方水稻黑條矮縮病毒的製作方法
利用RT-LAMP方法快速檢測植株中南方水稻黑條矮縮病毒本發明涉及水稻和玉米等植株上南方水稻黑條矮縮病毒的快速檢測技術及其在病害診斷和測報上的應用，屬於農業科學技術領域。
背景技術：
水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streaked dwarf virus, RBSDV)，是水稻上一種危害嚴重的病毒病，隸屬於植物呼腸孤病毒科斐濟病毒屬(Fijivirus)，病毒粒體球狀，主要由灰飛蝨傳播，田間症狀前期主要表現為植株矮縮，葉片濃綠，後期在葉片、葉鞘及莖杆上出現蠟滴狀突起，而後形成黑條，對水稻的產量影響很大，重病田甚至可導致無產量。近年來該病在江浙地區蔓延發生，且呈日漸嚴重的趨勢，2008年僅江蘇省發病面積就達400 萬畝，致使當地的水稻生產損失嚴重。2007年以來在廣東和海南等省新發生一種水稻病毒病，田間症狀與水稻黑條矮縮病毒極其相似，對其基因組序列進行測定後發現其與水稻黑條矮縮病毒存在較大差異(兩者的S9和SlO片段的同源性僅僅為75%和80% )，定名為南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)，該病毒也屬於植物呼腸孤病毒科斐濟病毒屬(Fijivirus)，病毒粒體球狀，基因組由10條雙鏈RNA 組成，傳播介體主要為白背飛蝨，灰飛蝨也可傳播，田間症狀表現為植株矮縮、葉色深綠、葉背及莖稈出現條狀乳白色或深褐色小突起，寄主除水稻外還包括玉米及多種雜草。近年來該病在長江下遊地區蔓延發生，且呈日漸嚴重的趨勢，2009年南方水稻黑條矮縮病毒全國發生面積達300萬畝，2010年迅速上升至1900萬畝，僅湖南省就發生近1000萬畝，絕收面積8萬畝，給水稻生產帶來了巨大的損失。由於兩種病毒在症狀、粒體形狀、傳播介體及寄主等方面非常相似，由此也給其診斷及鑑定造成了困難。目前在植物病毒鑑定識別上常採用的方法有生物學接種實驗，血清學檢測，電鏡觀察及分子生物學檢測。由於這兩種病毒在很多方面都具有非常接近的特性， 因此傳統的植物病毒檢測方法，如電鏡觀察(病毒粒子大小形狀相近)、傳統的生物學接種鑑定(症狀、介體、寄主範圍相近)、血清學檢測(序列仍有較高的同源性)等方法都很難區分。環介導恆溫核酸擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是由Notomi T等在2000年發明的一種新穎的恆溫核酸擴增方法，它是一種高靈敏的鏈置換技術，一種新型的PCR替代技術。LAMP特點是針對靶基因的6個區域設計了 4條特異引物，
利用一種鏈置換 DNA 聚合酶-Bst (Bacilluss tearothermophilus) DNA polymerase 在
恆溫(65°C)的條件下反應1小時即可完成核酸擴增反應，通過螢光染色直接目測比色就可以得到清晰的反應結果。不需要長時間的溫度循環，不需要PCR等昂貴的儀器，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。目前已廣泛應用於人類和動植物各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷。

發明內容
本發明提供了一種快速檢測植株體內南方水稻黑條矮縮病毒的方法，通過該方法可以快速診斷出植株是否攜帶南方水稻黑條矮縮病毒。本發明所提供的一種快速檢測植株體內南方水稻黑條矮縮病毒的方法，是通過以下方法獲得的1)根據NCBI已報導的南方水稻黑條矮縮病毒S9核苷酸序列，通過軟體DNAstar 分析後選擇相對保守區域311-770bp，利用ETO23359. 1上的對應區域通過在線引物設計軟體 primerExplorer V4 (http //primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index, html)設計弓I 物，其中包括2條外引物F3/B3和2條內引物FIP/BIP。；2) Trizol reagent 法提取植株總 RNA ；3)設置不同內外引物濃度比例、Mg2+濃度，確定最佳反應體系；分別改變反應時間和溫度進行RT-LAMP擴增反應，確定最佳反應條件。4)在最佳反應體系、條件下，以水稻黑條矮縮病毒為對照驗證這一方法的特異性；5)與RT-PCR方法進行比較，驗證RT-LAMP的可靠性；6)通過肉眼判斷和STOR GreenI染色對RT-LAMP產物進行可視化處理。本發明提供的引物序列如下F3 GCTAACTACGTTCGACAACCB3 ACAGAGGAAGCAAAGACATTFIP GCTTTCAACGACAATTTTCAAAACG-GAACATCAGCATTAAATCTCCTBIP AAGATGATGAATCACAGAGACCCA-ACAAACTTCTTTTCTTGCTCAT。RT-LAMP的反應溫度為60_63°C，反應時間為40-120min。利用電泳檢測或螢光染料方法可以排除水稻黑條矮縮病的幹擾，鑑定出南方水稻黑條矮縮病毒植株樣品。一種檢測植株上南方水稻黑條矮縮病毒方法的應用包括在水稻和玉米等疑似病植株的快速診斷與鑑別。利用這一方法可以排除水稻黑條矮縮病的幹擾，快速鑑定出南方水稻黑條矮縮病毒植株樣品，進而採取針對性的防治策略，減少病害帶來的損失。


圖1為不同反應溫度條件下RT-LAMP結果的電泳圖(M為標準分子量；1為60°C ； 2 為 61°C ;3 為 62°C ；4 為 63°C ；5 為 64°C ；6 為 65°C ；7 為陰性對照)。圖2為不同反應時間條件下RT-LAMP結果的電泳圖(M為標準分子量；1為30min ； 2 為 40min ；3 為 60min ；4 為 80min ；5 為 90min ；6 為 120min)。圖3為RT-LAMP與RT-PCR靈敏性比較圖及螢光染料方法檢測RT-LAMP擴增產物圖(A為RT-LAMP反應結果圖；B為RT-PCR反應結果圖；C為STOR GreenI螢光染料方法檢測結果圖；1 為 0. 6496 μ g/ μ 1 ；2 為 0. 6496 X KT1 μ g/μ 1 ；3 為 0. 6496 X 1(Γ2 μ g/μ 1 ； 4 為 0. 6496 X 1(Γ3 μ g/μ 1 ；5 為 0. 6496 X 1(Γ4 μ g/μ 1 ；6 為 0. 6496 X 1(Γ5 μ g/μ 1 ；7 為 0. 6496 X 1(Γ5 μ g/ μ 1 ;8 為 0. 6496 X 1(Γ7 μ g/ μ 1 ;9 為 0. 6496 X 1(Γ8 μ g/μ 1 總 RNA ； 10 為陰性對照)。具體實施方法實施例1，南方水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP反應條件的優化①南方水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP引物的設計。根據NCBI上已報導的南方水稻黑條矮縮病毒S9核苷酸序列(ETO23359. 1，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/183229399 ；EU784843. 1, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/209867306)設計引物。以該病毒相對保守的一段序列(311_770bp)作為模板，使用在線 LAMP 引物設計軟體 primerExplorer V4(http//primerexplorer. jp/ elamp4. 0. 0/index. html)來設計引物。將模板序列上傳後，由系統軟體計算獲得初步的 LAMP引物組合(F3，B3，FIP，BIP)，再通過軟體提供的引物相應的3』端或5』端穩定性及引物二聚體等參數對設計出的多對引物進行比較選擇，最終選取一組最合適的引物，序列如下F3 GCTAACTACGTTCGACAACCB3 ACAGAGGAAGCAAAGACATTFIP GCTTTCAACGACAATTTTCAAAACG-GAACATCAGCATTAAATCTCCTBIP AAGATGATGAATCACAGAGACCCA-ACAAACTTCTTTTCTTGCTCAT。②南方水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP的溫度梯度實驗從安徽、湖南等地採集病株，參照季英華等的方法採用RT-PCR篩選出南方水稻黑條矮縮病毒樣品用於RT-LAMP檢測試驗(季英華等，《中國水稻科學》，2011)。參照 TRIzol Reagents(康為世紀)使用說明，提取樣品總RNA。雖然Bst DNA polymerase 的最適反應溫度為65. 8°C，但許多報導已經證實RT-LAMP適宜反應溫度在60°C _65°C之間，同時由於不同引物在設計時不可能保證所有引物的Tm值完全一致，而且RT-LAMP還要考慮到反轉錄酶的適宜反應溫度，有鑑於此，本發明對RT-LAMP反應溫度進行優化試驗。 RT-LAMP體系為外引物F3禾口 B3各0. 2 μ M，內弓丨物FIP和BIP各1. 6 μ M，dNTP混合物(IOmM each) 2. 5 μ l,20mM Tris-HCl (pH 8· 8，25°C )，IOmM KCl，IOmM(NH4)2S04，8mM MgSO4,0. 1% TritonX-100, Bst DNA 聚合酶，大片段 8U，M-MuLV 反轉錄酶 100U，RNase Inhibitor 20U, 0. 8M甜菜鹼，2 μ 1總RNA模板，補充DEPC水至25 μ 1。混勻反應物在60°C，61 °C，62°C，63°C， 640C，65°C六種條件下恆溫反應lh，80°C反應5min終止RT-LAMP反應，取2 μ L擴增產物上樣，在1. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結果EB染色。結果顯示在同樣反應體系條件下， 在60°C，61°C，62°C，630C恆溫反應Ih後有階梯狀擴增條帶，60°C，61°C，62°C恆溫反應Ih後的擴增產物的電泳條帶亮度幾乎相同，63°C恆溫反應Ih後擴增產物的條帶亮度略微有些減弱，而64°C、65°C恆溫反應Ih及陰性對照無階梯狀擴增帶(圖1)。因此本發明RT-LAMP 的反應溫度應為60-63 °C③南方水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP的反應時間梯度實驗許多報導已經證實了 RT-LAMP反應時間少於Ih也能檢測到擴增產物。按照②中已經優化好的RT-LAMP體系加樣後置於62°C恆溫條件下反應，分別設置恆溫反應30min， 40min, 60min, 80min, 90min, 120min六種處理，按②中完成反應後電泳檢測。結果顯示當反應時間為30min時已經有擴增產物，但產物較少，但是當反應時間為40mi η時，RT-LAMP擴增產物開始增多，此後當繼續增加反應時間時，擴增產物的量幾乎不發生改變(圖幻。因此本發明確定的RT-LAMP的反應時間為40-120min。④RT-LAMP與RT-PCR靈敏性比較為了確定RT-LAMP和RT-PCR兩種檢測方法的靈敏度，將提取的總RNA用分光光度計測定濃度(0.6496yg/yl)後用DEPC水進行10倍比稀釋，-70°C保存作為模板。分別取總RNA倍比稀釋液2 μ L作為模板，採用所設引物用②中RT-LAMP反應體系進行反應(反應時間為Ih)。取2 μ L擴增產物上樣，在1. 5 %瓊脂糖凝膠上電泳。同時，以RT-LAMP相同的 2 μ L總RNA倍比稀釋液為模板，Β3為反轉錄引物，參照M-MuLV反轉錄酶使用說明進行反轉錄合成cDNA第一鏈。以RT合成的cDNA為模板，以F3和B3為引物進行PCR擴增，使用常規PCR反應體系。取2 μ L擴增產物上樣，在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結果EB染色。 結果顯示用RT-LAMP方法可以檢測到濃度是0. 6496 X 10_6 μ g/ μ 1的SRBSDV的總RNA，而 RT-PCR 只能檢測到濃度是 0. 6496 X 1(Γ5 μ g/ μ 1 的 SRBSDV 的總 RNA，即 RT-LAMP 比 RT-PCR 靈敏性高出10倍(圖3)。⑤螢光染料方法檢測RT-LAMP擴增產物按④中RT-LAMP反應產物電泳檢測後，向PCR管中加入SYBR GreenKl 1000) 2 μ 1，l-5min後察結果。結果顯示陽性擴增產物迅速變成綠色，而無擴增產物及陰性對照保持染料的橙色(圖3)。實施例2，南方水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP反應的特異性試驗為了驗證RT-LAMP方法的特異性，選擇與SRBSDV同一屬的水稻黑條矮縮病毒 (RBSDV)作為對照。分別以SRBSDV和RBSDV的總RNA為模板，用②中的RT-LAMP反應體系進行反應。結果顯示用本實驗的RT-LAMP引物去擴增感染RBSDV水稻病株總RNA時，沒有擴增產物；而擴增感染SRBSDV水稻病株總RNA時能夠擴增出目的產物，這與預期結果吻合， 表明本發明建立的RT-LAMP檢測方法具有很好的特異性。一種檢測植株上南方水稻黑條矮縮病毒方法的應用包括在水稻和玉米等疑似病植株的快速診斷與鑑別。上述實施不以任何形式限定本發明。
權利要求
1.一種快速檢測植株上南方水稻黑條矮縮病毒的方法，其特徵在於利用RT-LAMP反應的特異性引物，在60-63°C條件下恆溫反應40-120min，利用電泳檢測或螢光染料方法可以排除水稻黑條矮縮病的幹擾，鑑定出南方水稻黑條矮縮病毒植株樣品。
2.1中所述「RT-LAMP反應的特異性引物」是指以下4條引物 F3 GCTAACTACGTTCGACAACCB3 ACAGAGGAAGCAAAGACATTFIP GCTTTCAACGACAATTTTCAAAACG-GAACATCAGCATTAAATCTCCT BIP AAGATGATGAATCACAGAGACCCA-ACAAACTTCTTTTCTTGCTCAT。
全文摘要
本發明提供了一種水稻和玉米等植株上南方水稻黑條矮縮病毒的快速檢測技術及其在病害診斷上的應用方法。利用這一方法可以排除水稻黑條矮縮病的幹擾，快速鑑定出南方水稻黑條矮縮病毒植株樣品，進而採取針對性的防治策略，減少病害帶來的損失。
文檔編號C12N15/11GK102286634SQ20111007192
公開日2011年12月21日 申請日期2011年3月24日 優先權日2011年3月24日
發明者蘭瑩, 周彤, 周益軍, 孫楓, 徐秋芳, 杜琳琳, 程兆榜 申請人:江蘇省農業科學院