發酵製備氧化物的方法
2023-05-17 09:50:41 1
專利名稱：發酵製備氧化物的方法
技術領域：
本發明涉及製備氧化物的方法，所述方法包括培養選自葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬的微生物，從而氧化培養基中的底物。
更具體地說，本發明涉及製備氧化物的方法，所述方法包括培養葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬的微生物菌株以氧化培養基中的底物，其特徵在於在所述培養基中加入可同化的碳源，例如多元醇(例如糖、糖醇、或甘油)，本發明還涉及通過實施上述方法得到的培養基，以及純化所述培養基得到的氧化物。
背景技術：
葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬微生物的很多菌株具有部分氧化各種底物的能力，所述底物如葡萄糖、果糖、核糖、山梨糖等單糖，麥芽糖、蔗糖等寡糖，山梨醇、甘露醇、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇等糖醇，或者如甘油和乙醇等醇類，並且它們已經被用於製備有用的氧化物，例如山梨糖、2-酮-L-古洛糖酸、乙酸等。關於這項由底物製備氧化物的微生物學技術，為改善轉化量已進行了很多研究。為實現這一目的，已經進行了很多嘗試，例如改良微生物(日本公開特許S62-275692，WO95/23220)和改良培養方法(日本公開特許H7-227292)。
在目前已知的開發葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬微生物以氧化底物的方法中，添加微生物生長必要的碳源的常規方法包括在開始培養時單獨添加底物，或者與底物一起添加不同於底物的碳源。單獨添加底物的實施方式存在缺點，即微生物的生長速率低，並且該趨勢在底物轉化效能顯著增強的微生物菌株中表現特別明顯。為克服上述缺點，在開始培養時與碳源一起加入另一種不同的碳源有助於改善生長速率，但是導致底物化合物轉化的特異性降低，更談不上增加副產品形成的問題。本發明的目的在於提供一種提高培養基中促進微生物生長的底物化合物的氧化速度，從而降低發酵時間，增加發酵產量，以及降低副產物形成速率的方法。
發明內容
本發明的發明人在深入研究本領域上述現狀之後發現，在培養基中培養葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬微生物以氧化加入所述培養基的底物，從而得到目的氧化物，除底物之外還在培養基中加入所述微生物的可同化碳源，例如多元醇(例如糖、糖醇、或者甘油)，可以提高底物氧化速率、降低發酵時間、以及提高發酵產量。本發明在上述發現的基礎上得以發展。
因此，本發明涉及製備氧化物的方法，所述方法包括培養選自葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬的微生物以氧化培養基中的底物，其特徵在於培養過程中在所述培養基中加入可同化的碳源。
本發明使用的葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬微生物，可以是能夠氧化底物化合物得到目的氧化物的任何微生物菌株，但是優選在底物氧化為目的氧化物時具有高轉化效能的微生物菌株。這類具有高轉化效能的微生物涉及大量產生相關轉化酶系統的菌株，能夠合成高轉化效能酶系統的菌株，目的氧化物分解活性有缺陷的菌株，將底物同化為單一碳源的能力減弱的菌株。例如，當山梨醇用作製備目的氧化物山梨糖或2-酮-L-古洛糖酸的底物時，或者當山梨糖用作製備目的氧化物2-酮-L-古洛糖酸的底物時，優選使用葡糖桿菌屬或假葡糖桿菌屬微生物將具有優勢，特別優選的是葡糖桿菌屬微生物。這類微生物菌株的例子包括屬於氧化葡糖桿菌的氧化葡糖桿菌GA-1(FERM BP-4522)，氧化葡糖桿菌N952(FERM BP-4580)(二者均參見WO95/23220)，氧化葡糖桿菌GO-10(FERM BP-1169)，氧化葡糖桿菌GO-14(FERMBP-1170)(二者均參見日本公開特許S62-275692)，氧化葡糖桿菌UV-10(FERM P-8422)，氧化葡糖桿菌E-1(FERM P-8353)，以及屬於假葡糖桿菌屬的假葡糖桿菌K591s(FERM BP-1130)，假葡糖桿菌12-5(FERM BP-1129)，假葡糖桿菌TH14-86(FERM BP-1128)，假葡糖桿菌12-15(FERM BP-1132)，假葡糖桿菌12-4(FERM BP-1131)，和假葡糖桿菌22-3(FERM BP-1133)。
本發明實施過程中使用的培養方法可以按照微生物菌株、底物化合物、以及目的化合物，以及其它因素適當地選擇，可以使用已知的培養方法，例如振蕩培養或浸沒通氣培養。
本發明方法中可以使用的底物包括單糖例如葡萄糖、果糖、核糖、山梨糖等，寡糖例如麥芽糖、蔗糖等，糖醇例如山梨醇、甘露醇、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇等，以及醇類例如甘油和乙醇。底物的加入量隨微生物菌株的種類、培養方法、底物的種類而改變，但是通常加入量為培養基的1-50％，優選3-20％。
可同化碳源的種類沒有特別限制，只要微生物能夠同化所述底物即可。如果，例如，微生物菌株是能夠作用於山梨醇或山梨糖以製備山梨糖或2-酮-L-古洛糖酸的菌株，所述碳源可以選自糖(例如蔗糖、麥芽糖等寡糖和葡萄糖、果糖等單糖)，糖醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇等)，和多元醇例如甘油。在這類多元醇中，特別優選甘油，因為它對於提高轉化效能和轉化速率，以及降低不完全代謝產物量能夠發揮很大作用。
所述碳源的量隨微生物菌株的種類、培養方法、碳源、底物化合物、和底物化合物的量而改變，但是範圍可以為底物量的1到100％，優選10-50％。
添加所述碳源的方式隨微生物菌株的種類、培養方法、碳源和底物而改變，但是它可以在培養過程中添加。更具體地說，添加所述碳源的時間可以在培養開始後的一段時間，連續地或間歇地添加預定量或按照發酵進程添加所述碳源。
本發明可以通過以下方式有效地進行，添加例如酵母提取物、乾酵母、玉米浸提液等天然有機營養物作為除所述底物和碳源之外的輔助營養物，以便加速微生物的生長，並維持足夠的轉化活性。
通過實施本發明製備的目的氧化物，可以按照氧化物的種類採用本領域普通技術人員已知的方法收穫和純化。它也可以以鹽(例如鈉鹽或鈣鹽)的形式分離。分離可以採用，例如加入或不加活性炭過濾或離心培養基以除去細胞，然後將液體部分濃縮結晶，吸附於樹脂上，層析分離，脫鹽等，所述方法可單次使用，適當組合使用或重複使用。
本發明提供了一種經濟有效地工業化生產氧化物的方法，包括在培養基中培養葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬的微生物，以氧化培養基中的底物，該方法能夠加快氧化速率，降低發酵時間，並且提高發酵產量。
實施例1將0.5ml液氮保存的氧化葡糖桿菌N952(FERM BP-4580)，氧化葡糖桿菌的轉化體(WO95/23220)接種到裝有50ml培養基的500ml搖瓶中，所述培養基含有0.5％葡萄糖、5％山梨糖醇、1.5％玉米浸提液、和0.15％硫酸鎂，於30℃培養24小時。將部分該培養物(17ml)轉移到裝有與上述組成相同的17L無菌培養基的30L發酵罐中，30℃培養20小時。將2L該種子培養物轉移到含17L培養基(含有15％山梨糖醇、2％玉米浸提液、0.3％酵母提取物、0.5％硫酸鎂、和0.5％碳酸鈣)的30L發酵罐中，32℃培養70小時。培養過程中，前24小時培養基pH值控制在5.5，然後加入氫氧化鈉水溶液，控制培養基pH值為6.5直到完成發酵，通過噴霧攪拌使溶解氧維持在10％或更高。由此獲得的培養肉湯作為對照。同時，培養同樣的微生物菌株，在開始培養後13.5小時起連續添加相當於終培養基6％的甘油直到完成發酵(培養開始後70小時)，其餘培養條件相同。添加甘油的實驗中，在開始培養後70小時山梨糖醇轉化為2-酮-L-古洛糖酸的效能為41.3％，與未添加甘油的對照實驗(24.8％)相比，證明有顯著效果。實施例2用氧化葡糖桿菌HS17[亞硝基胍誘導氧化葡糖桿菌NB6939-pSDH-tufB1(WO95/23220)突變，以增強山梨糖醇轉化為2-酮-L-古洛糖酸的效能]代替氧化葡糖桿菌N952，其餘重複實施例1的培養條件。從培養開始後13小時，開始添加相當於終培養基6％的甘油，直到培養開始後72小時。在對照實驗中，培養開始前一次性加入相當於終培養基6％的甘油。測定山梨糖醇轉化為2-酮-L-古洛糖酸的效能，並分別比較培養開始後24、48、56、72小時實驗組與對照培養基的轉化效能。結果如表1所示。
表1
*ND未測量
權利要求
1.製備氧化物的方法，所述方法包括培養選自葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬的微生物，以氧化培養基中的底物，其特徵在於在所述培養基中加入可同化碳源。
2.按照權利要求1的製備氧化物的方法，其中可同化碳源為多元醇。
3.按照權利要求1的製備氧化物的方法，其中可同化碳源選自甘油、單糖和糖醇。
4.按照權利要求1的製備氧化物的方法，其中可同化碳源為甘油。
5.按照權利要求1到4的任一項製備氧化物的方法，其中培養基中的底物為山梨醇或山梨糖。
6.按照權利要求1至5的任一項製備氧化物的方法，其中氧化物為2-酮-L-古洛糖酸。
7.按照權利要求1至6的任一項製備氧化物的方法，其中微生物為氧化葡糖桿菌。
8.由權利要求1至7的任一項方法得到的培養基。
9.純化權利要求8的培養基得到的氧化物。
全文摘要
製備氧化物的方法,所述方法包括培養葡糖桿菌屬、醋桿菌屬、假葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、或歐文氏桿菌屬的微生物菌株以氧化培養基中的底物,培養基中同時加入非底物的可同化碳源。上述方法有利於增加培養基中底物的氧化速率,減少發酵時間,提高發酵產量,降低副產物的百分率。
文檔編號C12P19/00GK1246145SQ98802138
公開日2000年3月1日 申請日期1998年1月26日 優先權日1997年1月31日
發明者吉田勝, 添田慎介, 林勝義, 南院秀光, 野口祐嗣, 齋藤善正 申請人:藤澤藥品工業株式會社