用於黏膜施用的過敏症疫苗組合物的製作方法

2023-05-17 07:24:36

專利名稱：用於黏膜施用的過敏症疫苗組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及包括半胱氨酸蛋白酶變應原用於黏膜施用的過敏症疫苗組合物。
背景技術：
過敏症是全世界的主要健康問題。特應性疾病例如變應性鼻炎、哮喘和特應性溼 疹已成為慢性健康不良的主因之一。目前，術語『過敏症』通常與IgE介導的疾病相聯繫。 每個人每天都遭受可能的變應原。許多變應原是在乾燥顆粒例如貓毛屑、房塵蟎的糞便或 花粉粒上攜帶的小的高可溶蛋白質。當我們呼吸時，這些顆粒遭遇氣道粘液。某些人具有關於產生針對變應原的速髮型超敏反應的遺傳傾向。這稱為特應性， 並且特應性個體具有在其循環中比非特應性個體更高水平的嗜酸性粒細胞和更高的IgE 總水平。它們還通常具有超過一種特應性疾病。暴露於變應原可以導致稱為變態反應或超敏反應的免疫系統過度反應。超敏反應 分成4個類別1型超敏性是由IgE介導的速髮型超敏反應，並且主要是變應性鼻炎、哮喘 和全身性過敏反應的原因。當暴露於變應原時，非特應性個體將僅發動弱免疫應答，產生變 應原特異性IgGl和IgG4抗體(Thl應答)。然而，當它是病原體時，特應性個體對變應原有 反應。B細胞因此受刺激產生IgE而不是產生IgG (Th2應答)。IgE隨後通過高親和力IgE 受體Fc ε RI與肥大細胞結合。個體第二次遇到相同變應原時，它導致超敏反應。2個肥大 細胞結合的IgE分子與單個變應原交聯，刺激毒性介質例如組胺和肝素、細胞因子和酶從 肥大細胞的顆粒中的釋放。組胺的釋放導致增加的血管通透性、血管舒張(局部血管膨脹) 和平滑肌收縮。所有這些因素相組合導致變態反應。對氣道的作用是哮鳴、咳嗽和噴嚏，並 且在胃腸道中，它通常將引起腹瀉與嘔吐。由來自房塵蟎的變應原介導的變應性應答是I型超敏性。在全世界的潮溼區 域中，塵蟎到處都是。已鑑定了在室塵中生活的高達13個不同物種，並且80%的所有這 些蟎由3個最常見HDM物種代表屋塵蟎(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉塵蟎 (Dermatophagoidesfarinae)和宇塵蟎(Euroglyphus maynei)。在這些暖溼地理區域中， 塵蟎物種佔大約30%的人口中的陽性皮膚測試反應。HDMs被視為過敏症的主要原因之一。蟎糞便和蟎屍體是引發變應性應答的變應原來源。蟎糞便團塊的大小是 10-20 μ m，這使得它易於空氣傳播。迄今為止，鑑定了來自屋塵蟎也稱為歐洲房塵蟎的14 個不同變應原組。在蟎變應性個體組中，Der pi和Der p2將在超過60%的個體中與來自血清的IgE 結合。它們因此被視為主要變應原。Per piDer pi是主要房塵蟎變應原，並且當提及塵蟎特異性IgE介導的超敏性時，被視 為主要免疫顯性變應原之一。它是25371Da半胱氨酸蛋白酶，並且屬於異種集團(clan) CA——木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶。它作為320個胺基酸的失活前體合成。為了使蛋白 質變得成熟，前肽的切割是必需的，變成長222個胺基酸的蛋白質。Der pi僅在屋塵蟎糞便 顆粒中以其成熟形式發現，並且因此它是組成變應原的成熟蛋白質。
木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶的催化活性依賴於稱為催化三聯體的3個殘基。它 們是半胱氨酸、組氨酸和天冬醯胺。催化半胱氨酸必須還原以便使酶活化。半胱氨酸蛋白 酶可以由E64(L-反式環氧丁二醯基-亮氨醯氨(4-胍基)丁烷)不可逆地抑制。人體外研究已顯示Der pi可以切割許多蛋白質，導致增強的Th2應答。此外，在 小鼠中的體內研究已顯示，當致敏小鼠鼻內暴露於蛋白水解活性的Der pi時，循環中的總 IgE水平變得明顯更高，與暴露於由E64不可逆地滅活的Der pi的小鼠相反。此外，肺炎症 對於暴露於蛋白水解活性的Der pi的小鼠顯著更高。這些研究指出Der pi蛋白水解活性可能在引發變應性應答中起作用。先前出版物Wan 等人(The Journal of Clinical Investigation，1999 年 7 月，第 104 卷， Number 1，123-133)公開了 Der pi在經上皮遞送中的作用的體外研究，並且發現Der pi引 起細胞間緊密連接的斷裂，所述細胞間緊密連接是上皮細胞旁通透性屏障的主組分。特別 地，發現Der pi導致在匯合氣道上皮細胞中緊密連接粘著蛋白質咬合的切割。緊密連接破 壞非特異性增加的上皮通透性，允許Der pi跨越上皮屏障並且到達樹突狀抗原呈遞細胞。 推測Der pi的作用可能是哮喘發展中的第一步。Kauffman等人(Clinical and Molecular Allergy 2006,4 5)公開了與上述Wan 等人相同的發現。它進一步提及用gluthathione (穀胱甘肽)還原天然Der pi產生其最 活躍的還原形式。Takai 等人(Int Arch Allergy Immunol 2005 ；137 194-200)公開了製備正確折 疊的活性重組Der pi和Der fl的系統，及其蛋白水解活性研究，這指出在過敏症的發病機 理中具有重要性。它提及所製備的重組分子由還原劑例如DTT和L-半胱氨酸活化。提及 較早研究，其中推測天然Der pi的半胱氨酸蛋白酶活性可以由穀胱甘肽在體內活化。本發明的目的是提供改良的過敏症疫苗組合物。發明概述本發明的第一個方面涉及包括處於還原活性狀態的半胱氨酸蛋白酶變應原用於 黏膜施用的過敏症疫苗組合物。本發明的第一個方面還涉及包括處於氧化無活性狀態的半 胱氨酸蛋白酶變應原用於黏膜施用的過敏症疫苗組合物。在第一個方面，本發明基於下述認識1)在半胱氨酸蛋白酶變應原作為用於黏膜 施用的變應原疫苗中的活性物質的用途中，半胱氨酸蛋白酶變應原是處於其還原活性還是 處於其氧化無活性狀態的問題是重要問題，因為活性半胱氨酸蛋白酶在與黏膜施用結合中 具有增強的免疫活性並且因此增強的效力，和2)控制用於黏膜施用的變應原疫苗中半胱 氨酸蛋白酶的還原/氧化狀態事實上是可能且有利的。因此，通過控制半胱氨酸蛋白酶的 還原/氧化狀態，可以更精確地控制疫苗的免疫活性並且因此控制效力。在常規過敏症疫 苗中，半胱氨酸蛋白酶的還原/氧化狀態不受控制，並且因此存在疫苗的還原/氧化狀態和 因此效力可能改變的危險。特別地，本發明已提供了通過使用活性半胱氨酸蛋白酶製備具 有增強的免疫活性和效力用於黏膜施用的過敏症疫苗的可能性。需要時，可以使用無活性 半胱氨酸蛋白酶，這可能是某些應用例如對於非常有效的變應原希望的，或為了減少與粘 膜施用結合的副作用例如搔癢的危險。本發明的第一個方面進一步基於下述認識給過敏症疫苗組合物添加穀胱甘肽將導致疫苗的免疫活性和效力的增強，因為它將刺激氧化的無活性半胱氨酸蛋白酶轉化成活 性的還原半胱氨酸蛋白酶，或確保還原的活性半胱氨酸蛋白酶不轉化成氧化的無活性半胱 氨酸蛋白酶。因此，半胱氨酸蛋白酶分子在體內的氧化/還原狀態由分子微環境的氧化/ 還原狀態決定。因此，當疫苗施用於患者的黏膜時，半胱氨酸蛋白酶可能充分暴露於氧化微 環境，並且此類氧化微環境的作用可能通過穀胱甘肽的局部存在得到阻止或減少，所述谷 胱甘肽具有還原作用。另外，本發明的第一個方面基於下述實驗發現穀胱甘肽S-轉移酶對於穀胱甘肽 對半胱氨酸蛋白酶的還原活性具有出乎意料的強催化作用。此外，它基於下述認識如對於 穀胱甘肽的添加，參見上文，給過敏症疫苗組合物添加穀胱甘肽S-轉移酶將導致疫苗的免 疫活性和效力的增強，因為它將刺激氧化的無活性半胱氨酸蛋白酶轉化成活性的還原半胱 氨酸蛋白酶，或確保還原的活性半胱氨酸蛋白酶不轉化成氧化的無活性半胱氨酸蛋白酶。本發明的第二個方面涉及用於在包括半胱氨酸蛋白酶用於黏膜施用的疫苗中使 用的佐劑系統。本發明的第二個方面進一步涉及根據包括本發明的抗原和佐劑系統用於粘 膜施用的抗原疫苗組合物。本發明的第二個方面基於下述認識半胱氨酸蛋白酶可以用作疫苗組合物中的佐 劑，因為如上所述的半胱氨酸蛋白酶被認為在藉助於其蛋白水解活性引發免疫應答中起作 用。此外，本發明的這個方面基於半胱氨酸蛋白酶作為佐劑的用途可以通過包括單獨或與 穀胱甘肽S-轉移酶相組合的穀胱甘肽得到增強，以便最佳化處於其還原狀態的半胱氨酸 蛋白酶的體內濃度。附圖簡述

圖1 在半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64的存在或不存在下，在庫1和2中經純化的 nDer pi的蛋白水解活性。評估了 Der ρ提取物以及對照的活性。圖2 通過GSH的nDer pi活化。該圖顯示通過增加濃度的GSH的nDer pi活化 的時間過程。圖3:圖2的特寫。圖4 通過GSH的nDer pi活化mDer pi活性的發展曲線的初速率針對用於活化 的GSH濃度進行標繪。圖5 :nDer p8催化通過GSH的Der pi活化的能力。活性用0. ImM GSH和不同濃 度的nDer p8進行測試。圖6 通過Der p8和GSH的Der pi活化。發展曲線的初速率針對nDer p8濃度 進行標繪。發明詳述半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶是蛋白酶，其中親核基團是Cys殘基的硫氫基。第一個明確識別 出的半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶。已測定了木瓜蛋白酶和某些緊密相關的半胱氨酸蛋白 酶的晶體結構。類似木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶被稱為木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶。 認為木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶共享催化位點的Cys，His 二聯體。木瓜蛋白酶樣半胱 氨酸蛋白酶分類在CA異種集團和CC異種集團(病毒木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶)中， 其中CA異種集團包括家族C1、C2、C10、C12和C19，並且其中異種集團CC包括家族C6、C7、
6C8、C9、C16、C21、C23、C27、C28、C29、C31、C32、C33、C34、C35、C36、C41、C42 和 C43。特異的 木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶在例如所參考的由Alan J.Barrett等人，Academic Press、 1998編輯的Handbook ofProteolytic Enzymes中列出。本發明的疫苗組合物的半胱氨酸 蛋白酶是異種集團CA或異種集團CC的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶。前Der pi的三維結構與成熟Der pi的三維結構緊密對應。這個事實例如通過 各種半胱氨酸蛋白酶的前體形式和成熟形式結構的比較得到證明。2種同源半胱氨酸蛋白 酶caricain和組織蛋白酶K的晶體結構對於這些蛋白質的前體和成熟形式已得到測定。 在2種情況下，在前體形式內成熟區域的結構與成熟形式的那種基本上等同(Groves等人， Structure, 1996，第 4 卷，第 1193 頁和 LaLonde 等人，Biochemistry，1999，第 38 卷，第 862 頁)。半胱氨酸蛋白酶變應原根據本發明的半胱氨酸蛋白酶變應原是如本說明書其他地方定義的半胱氨酸蛋 白酶，它也是如本說明書其他地方定義的變應原。變應原可以是吸入性變應原，即空氣傳播 變應原，這可以與個體的氣道系統的黏膜相接觸。變應原也可以是食物變應原，這可以與個 體的消化系統的黏膜相接觸。在本發明的一個具體實施方案中，半胱氨酸蛋白酶變應原選自Ale oU Aca si、 Blo tl、Der f1> Der pi、Der ml、Der si、Eur ml、Gly dl、Lep dl、Pso ol、Sui ml 禾口 Tyr Pl，特別是Der pi。在本發明的一個實施方案中，用於黏膜施用的過敏症疫苗組合物包括處於還原活 性狀態的半胱氨酸蛋白酶變應原。認為處於還原活性狀態的半胱氨酸蛋白酶變應原在粘 膜施用中具有增強的免疫活性和效力，因為變應原的蛋白水解活性切割黏膜組織的緊密連 接，允許變應原跨越黏膜且接觸樹突狀抗原呈遞細胞。此類增強的免疫活性和效力將潛在 增強過敏症疫苗的療效。疫苗的此類增強的療效可以用於減少疫苗中的變應原劑量，並且 因此減少任何不希望有的副作用例如對於舌下疫苗的搔癢，或增加疫苗的療效。 在本發明的一個具體實施方案中，70 %的半胱氨酸蛋白酶變應原、優選80 %、更優 選90 %、更優選95 %、更優選98 %處於還原活性狀態。在本發明的另一個實施方案中，用於黏膜施用的過敏症疫苗組合物包括處於氧化 無活性狀態的半胱氨酸蛋白酶變應原。對於某些疫苗製劑、施用途徑和變應原類型，優選使 用處於氧化無活性狀態的半胱氨酸蛋白酶變應原，以緩和免疫活性和效力水平，目的在於 控制副作用水平。在本發明的一個具體實施方案中，70 %的半胱氨酸蛋白酶變應原、優選80 %、更優 選90 %、更優選95 %、更優選98 %處於氧化無活性狀態。本發明的疫苗組合物的半胱氨酸蛋白酶可以通過任何常規方法獲得，包括重組技 術和從生物材料中純化。本發明的半胱氨酸蛋白酶變應原可以以變應原提取物、變應原提 取物的純化餾分、經修飾的變應原、重組變應原或具有至少某些蛋白水解活性的重組變應 原的突變體的形式。變應原提取物可以天然包含相同變應原的一個或多個同種型，而重組 變應原一般僅代表變應原的一個同種型。突變型變應原可以是低I gE結合突變體，例如根 據WO 99/47680,WO 02/40676或W003/096869A2的低IgE結合變應原。在本發明的一個優 選實施方案中，變應原組合物是變應原提取物、變應原提取物的純化餾分或重組變應原。
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本發明的疫苗組合物的還原半胱氨酸蛋白酶可以通過用任何合適的還原劑處理 半胱氨酸蛋白酶來獲得，所述還原劑包括無機、有機和生物還原劑。優選使用藥學上可接 受的還原劑，例如半胱氨酸、穀胱甘肽、穀胱甘肽和穀胱甘肽S-轉移酶的組合、二硫蘇糖醇 (DTT)、半胱胺、硫氧還蛋白、N-乙醯-L-半胱氨酸(NAC)、α -硫辛酸、2_巰基乙醇、2-巰基 乙磺酸、巰基-propionyglycine 或三(2-羧乙基)phophine (膦)(TCEP)。本發明的疫苗組合物的氧化半胱氨酸蛋白酶可以通過用任何合適的氧化劑處理 半胱氨酸蛋白酶來獲得，所述氧化劑包括無機、有機和生物氧化劑。優選使用藥學上可接受 的氧化劑，例如穀胱甘肽二硫化物(GSSG)、胱氨酸或胱胺。穀胱甘肽(GSH)穀胱甘肽是三肽(C10H17N306S，CAS NO. 70-18-8)，它由L-半胱氨酸、L-穀氨酸 鹽(酯)和甘氨酸形成。穀胱甘肽在許多動物中發現，其中它主要以還原形式存在。在健 康細胞和組織中，超過90%的總穀胱甘肽poll是還原形式(GSH)，並且小於10%以活性形 式(GSSG)存在。穀胱甘肽以100-500mM的細胞外濃度存在於人氣道系統的肺液體中。還 原的穀胱甘肽充當抗氧化劑。大多數真核生物和某些細菌能夠合成穀胱甘肽。在還原狀態 中，半胱氨酸的硫醇基能夠將電子(H+)貢獻給其他不穩定的分子，例如活性氧種類。在貢 獻電子中，穀胱甘肽其自身變得是反應型的，但容易與另一個反應型穀胱甘肽反應，以形成 穀胱甘肽二硫化物(GSSG)。GSH可以通過穀胱甘肽還原酶由GSSG再生。本發明的疫苗組合物的穀胱甘肽可以是穀胱甘肽或其對半胱氨酸蛋白酶具有相 同還原活性的衍生物。本發明的疫苗的穀胱甘肽可以通過可獲得穀胱甘肽的任何常規方法進行製備，包 括化學合成、酶促合成和從生物材料中純化。本發明的疫苗的穀胱甘肽處於與還原的半胱 氨酸蛋白酶相組合的還原形式(GSH)。當包括還原的半胱氨酸蛋白酶和還原的穀胱甘肽的 組合的疫苗組合物施用於個體時，疫苗組合物中還原的穀胱甘肽的包括將確保還原的半胱 氨酸蛋白酶周圍的微環境中的還原的穀胱甘肽水平很高，並且因此還原的半胱氨酸蛋白酶 將以其還原狀態逗留。在不存在穀胱甘肽的情況下，半胱氨酸蛋白酶的部分將遭受氧化環 境，並且因此轉化成氧化的半胱氨酸蛋白酶。藥學上可接警的還原劑儘管本發明在本說明書的其他地方就穀胱甘肽而言進行描述，但使用任何其他藥 學上可接受的還原劑代替穀胱甘肽或除穀胱甘肽外還使用任何其他藥學上可接受的還原 劑在本發明的範圍內，所述藥學上可接受的還原劑能夠獲得處於還原活性狀態的半胱氨酸 蛋白酶或使半胱氨酸蛋白酶維持在其還原活性狀態中。在本發明的一個優選實施方案中， 藥學上可接受的還原劑選自半胱氨酸、穀胱甘肽、穀胱甘肽和穀胱甘肽S-轉移酶的組合、 二硫蘇糖醇(DTT)、半胱胺、硫氧還蛋白、N-乙醯-L-半胱氨酸(NAC)、α-硫辛酸、2-巰基 乙醇、2-巰基乙磺酸、巰基-propionyglycine、三(2-羧乙基)phophine (膦)(TCEP)及其 組合。穀胱甘肽S-轉移酶(GST)穀胱甘肽S-轉移酶是包括細胞溶質、線粒體和微粒體蛋白質的長列表的酶家族， 其能夠與大量內源和外來的substractes (底物)多重反應。穀胱甘肽S-轉移酶催化還原 的穀胱甘肽(GSH)經由硫氫基與廣泛多樣底物上的親電子中心的綴合。在這個過程中，GSH轉變成氧化的穀胱甘肽(GSSG)。本發明的疫苗組合物的穀胱甘肽S-轉移酶可以是任何已知的天然存在的穀胱甘 肽S-轉移酶或其具有相同酶促活性的突變體。天然存在的穀胱甘肽S-轉移酶可以源自包 含此類酶的任何生物學生物體。穀胱甘肽S-轉移酶存在於大量生物學生物體中，包括一 般而言的哺乳動物、魚類、昆蟲、植物等。此類生物體的特別例子是房塵蟎Dermaphagoides pteronyssinus (Der ρ)禾口人類。因此，本發明的疫苗組合物的穀胱甘肽S-轉移酶可以通過任何常規方法獲得，包 括重組技術和從生物材料中純化。本發明的穀胱甘肽S-轉移酶可以以提取物、提取物的純 化餾分、經修飾的蛋白質、重組蛋白質或具有至少某些保留酶促活性水平的重組蛋白質的 突變體的形式。在本發明的一個優選實施方案中，穀胱甘肽S-轉移酶以提取物、提取物的 純化餾分或重組蛋白質的形式。穀胱甘肽S-轉移酶的特別例子是來自Dermaphagoidespteronyssinus的穀胱 甘肽S-轉移酶，Der ρ8。如同Der pl，它在來自Der ρ的糞便團塊中發現。Der ρ8具有 25589Da的分子量，並且是219個胺基酸的蛋白質。因為特定水平的穀胱甘肽在人中發現，所以儘管疫苗組合物不包含任何穀胱甘 肽，但在疫苗組合物中包括穀胱甘肽轉移酶將具有作用。同樣地，因為特定水平的穀胱甘肽 S-轉移酶在人中發現，所以儘管疫苗組合物不包含任何穀胱甘肽S-轉移酶，但在疫苗組合 物中包括穀胱甘肽將具有作用。處千氧概■賊醉胱氡廁a ft當在本發明的疫苗組合物中使用的半胱氨酸蛋白酶處於氧化無活性形式時，疫苗 組合物可以進一步包括任何藥學上可接受的氧化劑，其能夠獲得處於氧化無活性狀態的半 胱氨酸蛋白酶或使半胱氨酸蛋白酶維持在其氧化無活性狀態中。在本發明的一個優選實施 方案中，藥學上可接受的氧化劑選自穀胱甘肽二硫化物(GSSG)、胱氨酸和胱胺。黏膜施用過敏症疫苗組合物施用於其的黏膜可以是任何合適的黏膜，並且施用包括經口 (經由消化系統的黏膜)、鼻、陰道、舌下、目艮睛、直腸、尿道、乳房內、肺、Otolar (即經由耳) 和頰部施用，優選頰部或舌下施用(口腔黏膜(oromucosal)施用)。過敏症疫苗組合物可 以以噴霧劑、氣溶膠、混合物、懸浮液、分散系、乳劑、凝膠劑、糊劑、糖漿劑、乳膏、軟膏、埋植 劑(耳、眼、皮膚、鼻、直腸和陰道)、乳房內製劑、vagitories、栓劑或uteritories的形式。已推測執行疫苗經由黏膜的黏膜施用是優選的，這實施對變應原的天然暴露。因 此，對於針對空氣傳播的黏膜抗原因子的變態反應，優選使用經由呼吸系統的施用，優選口 腔黏膜施用。在本發明的一個實施方案中，對受試者實施包括疫苗的每天施用的疫苗接種方 案。在本發明的另一個實施方案中，疫苗接種方案包括每第二天、每第三天或每第四天的疫 苗施用。例如，疫苗接種方案包括超過4周、優選超過8周、更優選超過12周、更優選超過 16周、更優選超過20周、更優選超過24周、更優選超過30周且最優選超過36周時間段的 疫苗施用。施用時期可以是連續時期。備選地，施用時期是由一個或多個非施用時期間斷的 不連續時期。優選地，非施用(總)時期短於施用(總)時期。
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在本發明的一個進一步實施方案中，疫苗每天施用於患者一次。備選地，疫苗每天 施用於患者2次。疫苗可以是單劑量疫苗。口腔黏膜施用口腔黏膜施用可以使用任何可用的口腔黏膜施用製劑來執行，包括溶液、懸浮液、 快速分配劑型、滴劑和錠劑。在本發明的一個優選實施方案中，使用舌下免疫療法(SLIT)，在這種情況下快速 分配劑型、滴劑和錠劑是優選製劑。快速分配劑型的例子是在US-A-5, 648，093、WO 00/51568、W002/13858、 W099/21579.W0 00/44351、US_A_4，371，516 和 EP-278877，以及以 ALK-AbelΙ Α/S 的代理名 提交的WO 2004/047794和W02004/075875中公開的那些。優選的快速分配劑型是通過冷
凍乾燥產生的那些。優選的基質成形試劑是魚明膠和變性澱粉。以水溶液或快速分配片劑形式的過敏症疫苗，參照WO 04/047794，特別合適於頰 部和舌下施用。其中疫苗組合物中的變應原劑量增加至特定最大值的常規遞增劑量脫敏作用可 以在本發明中使用。疫苗組合物的單位劑量的優選效力是150-1000000SQ-U，更優選地效力 是 500-500000SQ-U，並且更優選地效力是 1000-250000SQ-U，更加優選 1500-125000SQ-U, 最優選 1500-75000SQ-U。在本發明的另一個實施方案中，疫苗組合物是反覆的單劑量，優選在 1500-125000SQ-U 範圍內，更優選 1500-75000SQ-U。與給定效力水平相對應的變應原的量強烈依賴於變應原種類而改變。在本發明 的一個進一步實施方案中，預期用於每天施用的單劑量中的主要變應原濃度是0. 05至 50 μ g,更優選0. 05至30 μ g,更優選0. 06至25 μ g,更優選0. 07至20 μ g,更優選0. 08至 15 μ g,更優選0. 09至10 μ g且最優選0. 1至7 μ g。在本發明的方法中使用的過敏症疫苗組合物可以是適合於施用於黏膜表面的任 何製劑的形式，包括噴霧劑、氣溶膠、混合物、片劑(腸包衣和非腸包衣的)、膠囊(硬和軟 的、腸包衣和非腸包衣的)、懸浮液、分散系、粒劑、粉劑、溶液、乳劑、咀嚼片、滴劑、凝膠劑、 糊劑、糖漿劑、乳膏、錠劑(粉劑、粒劑、片劑)、快速分配片劑、灌注液、氣體、蒸汽、軟膏、棒、 埋植劑(耳、眼、皮膚、鼻、直腸和陰道)、乳房內製劑、vagitories、栓劑或uteritories。應當理解本發明的疫苗可以進一步包括適合於此類類型製劑的另外佐劑和其他 賦形劑。此類另外的佐劑和賦形劑是本領域技術人員眾所周知的，並且包括溶劑、乳化劑、 溼潤劑、成形劑、染料、填充劑、防腐劑、粘度調整劑、緩衝劑、黏膜粘著物質等等。配製策略 的例子是本領域技術人員眾所周知的。在本發明的一個優選實施方案中，穀胱甘肽S-轉移酶以這樣的量包括在疫苗組 合物中，使得穀胱甘肽S-轉移酶與半胱氨酸蛋白酶的摩爾比是0. 001至1000、優選0. 01至 100、更優選0. 02至50、更優選0. 05至20、更優選0. 1至10且最優選0. 2至5。在本發明的一個優選實施方案中，穀胱甘肽以這樣的量包括在疫苗組合物中，使 得穀胱甘肽與穀胱甘肽S-轉移酶的摩爾比是0. 1至100000、優選1至10000、更優選2至 5000、更優選5至2000、更優選10至1000且最優選20至500。佐劑
過敏症疫苗組合物可以包括佐劑，這可以是任何常規佐劑，包括含氧金屬鹽、不 耐熱腸毒素(LT)、霍亂毒素(CT)、霍亂毒素B亞單位(CTB)、聚合脂質體、突變型毒素例如 LTK63 和 LTR72、微膠囊、白介素(例如 IL-I β、IL-2、IL-7、IL-12、INF γ )、GM-CSF, MDF 衍
生物、CpG 寡核苷酸、LPS、MPL、phosphophazenes (磷腈)、Adju- Ph0S 、葡聚糖、抗原制 劑、脂質體、DDE、DHEA、DMPC、DMPG、D0C/鋁複合物、弗氏不完全佐劑、ISC0Ms 、LT經口佐 劑、胞壁醯二肽、單磷醯脂質A、胞壁醯三肽和phospatidylethanolamind磷脂醯乙醇胺)。含氧金屬鹽可以是提供所需效應的任何含氧金屬鹽。在一個優選實施方案中，含 氧金屬鹽的陽離子選自 Al、K、Ca、Mg、Zn、Ba、Na、Li、B、Be、Fe、Si、Co、Cu、Ni、Ag、Au 和 Cr。在一個優選實施方案中，含氧金屬鹽的陰離子選自硫酸鹽、羥化物、磷酸鹽、硝酸鹽、碘 酸鹽、溴酸鹽、碳酸鹽、水合物、乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽和酒石酸鹽及其混合形式。例子是 氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁、硫酸鋁鉀、磷酸鈣、Maalox (氫氧化鋁和氫氧化鎂的混合物)、氫 氧化鈹、氫氧化鋅、碳酸鋅、氯化鋅和硫酸鋇。疫苗佐劑系統本發明進一步涉及用於在包括半胱氨酸蛋白酶用於黏膜施用的疫苗中使用的佐 劑系統。在根據本發明的佐劑系統的一個實施方案中，半胱氨酸蛋白酶處於還原活性狀 態。在本發明的一個具體實施方案中，佐劑系統進一步包括還原的穀胱甘肽。在本發明的 一個進一步具體實施方案中，佐劑系統進一步包括穀胱甘肽S-轉移酶。特別地，穀胱甘肽 S-轉移酶是Der p8。在本發明的第二個實施方案中，半胱氨酸蛋白酶處於氧化無活性狀態。本發明的佐劑系統的半胱氨酸蛋白酶可以是如本發明其他地方定義且描述的任 何半胱氨酸蛋白酶。在本發明的一個特別實施方案中，半胱氨酸蛋白酶選自Aca si、Blo tUDer fl、Der pi、Eur ml、Gly dl、L印 dl、Pso ο 1 禾口 Tye pi。特別地，半胱氨酸蛋白酶 變應原是Der pi。抗原疫苗組合物本發明進一步涉及包括根據本發明的抗原和佐劑系統用於黏膜施用的抗原疫苗 組合物。本發明的抗原疫苗組合物適合於針對由組合物的抗原引起的任何疾病的疫苗接 種。^M變應原在本發明的一個實施方案中，抗原疫苗組合物的抗原是變應原。在本發明的一個實施方案中，變應原是變應原，其與受試者的黏膜相接觸，包括呼 吸系統的黏膜、消化系統的黏膜、直腸黏膜和生殖器黏膜。根據本發明的變應原可以是任何天然存在的蛋白質，其已被報導在其反覆暴露於 個體後誘導變應性、即IgE介導的反應。天然存在的變應原的例子包括花粉變應原(喬木、 草本植物、雜草和草花粉變應原)、昆蟲變應原(吸入劑、唾液和毒液變應原，例如蟎變應 原、蟑螂和蠓變應原、hymenopthera(膜翅目)毒液變應原)、動物毛髮和頭皮屑變應原(來 自例如犬、貓、馬、大鼠、小鼠等)和食物變應原。來自喬木、草和草本植物的重要花粉變應 原是源自山毛櫸目(Fagales)、木犀目(Oleales)、松目(Pinales)和懸鈴木科的分類學目的那些，包括樺樹(樺木屬(Betula)、榿木(榿木屬(Alnus))、榛(榛屬(Corylus))、角樹 (鵝耳櫪(Carpinus))和橄欖(木犀欖屬(Olea))、雪松(柳杉屬(Cryptomeria)和刺柏屬 (Juniperus))、懸鈴樹(懸鈴木屬(Platanus))，禾本目(Poales)包括黑麥草屬(Lolium)、 梯牧草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)、絨毛草屬 (Holcus)、薦草屬(Phalaris)、黑麥屬(Secale)和高粱屬(Sorghum)，菊目(Asterales)和 蕁麻目(Urticales)包括豚草屬(Ambrosia)、蒿屬(Artemisia)和牆草屬(Parietaria) 的草本植物。其他重要的吸入性變應原是來自表皮蟎屬(Dermatophagoides)和嗜 黴蟎屬(Euroglyphus)的房塵蟎，儲藏蟎例如L印idoglyphys (害嗜鱗蟎)、食甜蟎 屬(Glycyphagus)和食酪蟎屬(Tyrophagus)，來自蟑螂、蠓和蚤的那些，例如小蠊屬 (Blatella) > ^ftM (Periplaneta)(Chironomus)禾口 CtenocepphaIides (木節 +δ
屬)，以及來自哺乳動物例如貓、犬和馬的那些，毒液變應原包括源自蟄刺或叮咬昆蟲的那 些，例如來自膜翅目(Hymenoptera)的分類學目的那些，包括蜜蜂(總科蜜蜂科(Apidae))、 黃蜂(總科Vespidea(胡蜂科))和螞蟻(總科Formicoidae (蟻科))。來自真菌的重要吸 入性變應原是源自鏈格孢屬(Alternaria)和枝孢屬(Cladosporium)的那些。在本發明的一個具體實施方案中，變應原是Bet vl、Aln gl、Cor al和Car bl、 Que al>Cry j1>Cry j2>Cup al>Cup s1>Jun al>Jun a2>jun a3>01e el>Lig vl>Pla 11、 Plaa2、Amb al、Amb a2、Amb t5、Art vUArt v2 Par j 1 >Par j2、Par j3、Sal kUAve el、 Cyn dU Cyn d7、Dac gl、Fes pi、Hol 11、Lol pi 禾口 5、Pha al、Pas nl、Phl ρ、Phl p5、 Phl p6> Poa pi、Poa p5> Sec cl> Sec c5> Sor hi、Der f1> Der f2> Der pi、Der p2>> Der p7、Der ml>Eur m2>Gly dl、Lep d2、Blo tl>Tyr p2、Bla gl、Bla g2、Per al、Fel dl>Can f1> Can f2> Bos d2、Equ cl、Equ c2、Equ c3、Mus ml、Rat nl、Apis ml、Api m2> Ves vl、 Ves v2>Ves v5、Dol ml、Dil m2、Dol m5、Pol aUPol a2>Pol a5>Sol iUSol i2>Sol i3 和 Sol i4、Alt al, ClahU Asp f U Bos d4、Mal dl、Gly ml、Gly m2、Gly m3、Ara hi、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5或來自這些中的任何的分子育種的shufflant雜種。在本發明的一個優選實施方案中，變應原是草花粉變應原或塵蟎變應原或豚草變 應原或雪松花粉或貓變應原或樺樹變應原。在本發明的另外一個實施方案中，變應原是源自相同變應原來源或源自不同變應 原來源的至少2個不同類型的變應原的組合，例如分別來自不同蟎和草物種的草組1和草 組5變應原或蟎組1和組2變應原，雜草抗原如短和巨豚草變應原，不同真菌變應原如鏈格 孢屬和枝孢屬、喬木變應原如樺樹、榛、角樹、橡樹和榿木變應原，食物變應原如花生、大豆 和乳變應原。摻入本發明的抗原疫苗組合物內的變應原可以以提取物、經純化的變應原、經修 飾的變應原、重組變應原或重組變應原的突變體的形式。變應原提取物可以天然包含相同 變應原的一個或多個同種型，而重組變應原一般僅代表變應原的一個同種型。在一個優選 實施方案中，變應原以提取物的形式。在另一個優選實施方案中，變應原是重組變應原。在 一個進一步優選的實施方案中，變應原是天然存在的IgE結合突變體或重組低IgE結合突 變體。變應原可以以等摩爾量存在，或存在的變應原比可以改變，優選高達1 20。感染
在本發明的第二個實施方案中，抗原疫苗組合物的抗原是微生物抗原。微生物抗原可以是這樣的抗原，其與受試者的黏膜相接觸，包括呼吸系統的黏膜、 消化系統的黏膜、直腸黏膜和生殖器黏膜。在一個具體實施方案中，微生物抗原是病毒、細菌、真菌、寄生蟲或其任何部分。微生物抗原的例子是弧菌屬(Vibrio)物種、沙門氏菌屬(Salmonella)物種、博 德特菌屬(Bordetella)物種、嗜血菌屬(Haemophilus)物種、鼠弓形蟲(Toxoplasmosis gondii)、巨細胞病毒、衣原體屬(Chlamydia)物種、鏈球菌屬(Sti^ptococcal)物種、諾 瓦克病毒、大腸埃希桿菌(Escherischia coli)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、貓 胃螺桿菌(Helicobacter felis)、輪狀病毒屬(Rotavirus)、Neisseria gonorrhae (淋 病奈瑟球菌)、Neisseria meningiditis (腦膜炎奈瑟球菌)、腺病毒、EB病毒、日本腦炎 病毒、Pneumocystis carini (卡氏肺囊蟲)、單純皰疹、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia) 物種、呼吸道合胞病毒、Klebsiella(克雷伯氏菌屬)物種、志賀氏菌屬(Shigella)物 禾中、tM M fi Hfi (Pseudomonas aeruginosa)、_/]、__ M (Parvovirus)、胃曲木幹胃 屬(Campylobacter)物種、立克次氏體屬(Rickettsia)物種、水痘帶狀皰疹、耶爾森氏 菌(Yersinia)物種、羅斯河病毒、J. C.病毒、馬紅球菌(Rhodococcus equi)、黏膜炎莫 拉菌(Moraxellacatarrhalis)、■{白氏疏電累旋體(Borrelia burgdorferi)、溶血巴斯德菌 (Pasteurella haemolytica)、脊髓灰質炎病毒、流感病毒、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和 腸炎沙門氏菌亞屬傷寒血清變型(Salmonella enterica serovar Typhi) 微生物抗原的進一步例子是阻止或減少下述疾病的症狀的那些流感，肺結核，結 核性腦膜炎，肝炎，百日咳，脊髓灰質炎，破傷風，白喉，瘧疾，霍舌L皰疹，傷寒，HIV，AIDS，麻 疹，萊姆病，旅行者腹瀉，甲型、乙型和C型肝炎，中耳炎，登革熱，狂犬病，副流感，風疹，黃 熱病，痢疾，軍團菌病，弓形體病，Q型熱，出血熱，阿根廷出血熱，骨疽，美洲錐蟲病，由大腸 桿菌(E. coli)引起的尿道感染，Pneumoccoccal (肺炎球菌)病，腮腺炎和Chikungunya。定義與本發明結合使用下述術語和表達表述「異種集團CA或異種集團CC的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶」意指在由Alan J. Barrett 等人，Academic Press、1998 編輯的 Handbook of Proteolytic Enzymes 中作為 屬於異種集團CA和CC定義且列出的蛋白酶，以及屬於CA和CC異種集團的目前未知的蛋 白酶。術語「變應原」意指能夠引發如下定義的過敏症的任何化合物。術語「過敏症」意指由免疫機制介導的針對環境變應原的任何類型的超敏反應，包 括I-IV型超敏反應，包括變應性鼻炎、哮喘和特應性皮炎。術語「過敏症疫苗組合物」意指用於治療或預防過敏症的疫苗組合物。術語「治療」意指部分或完全治癒或減輕症狀，或抑制症狀的原因。術語「預防」意指任何類型的預防處理，包括部分或完全預防或抑制症狀的發展或 症狀的原因的發展。術語「 口腔黏膜施用，，指其中劑型放置在舌下或口腔中的其他任何地方(頰部施 用)的施用途徑，以允許活性成分與患者口腔或喉的黏膜相接觸，以便獲得活性成分的局 部或全身效應。口腔黏膜施用途徑的例子是舌下施用。
術語「舌下施用」指其中劑型放置在舌下以便獲得活性成分的局部或全身效應的 施用途徑。術語「SQ-u」意指SQ-單位SQ_單位依照ALK-AbelΙ Α/S' s "SQ生物效力」-標 準化方法進行測定，其中100，000SQ單位等於標準皮下維持劑量。通常Img提取物包含 100, 000-1，000，000SQ-單位，依賴於它們源自於其的變應原來源和所使用的製造過程。精 確的變應原量可以藉助於免疫測定法即主要變應原總含量和變應原總活性進行測定。
實施例材料與方法nDer pi 的純化nDer pi的純化在2個連續親和色譜法步驟中完成。使534mg 屋塵蟎 (D. pteronyssinus)溶解於約9. 5ml結合緩衝液(PBS、pH 7. 2)中，並且通過0. 45 μ m截止 濾器(Mi 1 lex -HV, MILLIP0RE)過濾，以去除不可溶化合物。使用包含具有針對Der pi的單克隆抗體(4C1、IndoorBiotechnologies)的瓊脂 糖的7ml柱。使柱與人1^4 1^1^仏111吐吐膽 11虹111￡1(^￡1生物技術產品)相連接。在將樣品 裝載到環內且將其注射到柱內之前，使柱在結合緩衝液中平衡。在施加整個樣品後，用3柱體積結合緩衝液充分洗滌柱。隨後通過將線性NaCl/ 甘氨酸梯度施加到洗脫緩衝液(0. IM甘氨酸pH ll、0.5NaCl)使蛋白質洗脫5分鐘，這引起 Der pi從抗體中釋放。將洗脫物收集到Iml餾分中。為了中和鹼性洗脫物，將200μ IlM NaAcetat (pH 5.0)加入所有收集管。蛋白質洗脫隨後為監控洗脫餾分在280nm(A280)處的吸收。隨後 合併包含洗脫峰的餾分。隨後，使用5kDa截止旋轉濾器(MILLIPORE，AmicOIl Ultra， Centrifugal Filter Devices)使包含 Der pi 的庫濃縮至 2ml。先前研究已顯示絲氨酸蛋白酶Der p3與Der pi—起從4C1-瓊脂糖柱中共 洗脫。因此，對包含洗脫峰的樣品實施在包含SBTI (大豆胰蛋白酶抑制劑-瓊脂糖、 SIGMA-ALDRICH)的瓊脂糖柱上的新親和色譜。SBTI是絲氨酸蛋白酶的抑制劑。用於這的緩衝液與用於4C1-瓊脂糖柱的相同。預期Der pi在流出物中，因為該 柱僅結合Der p3。通過測量A280鑑定包含非結合蛋白質的餾分且合併。在色譜法過程中，柱和所有緩衝液一直維持在4°C。nDer p8 的純化nDer p8的純化在一個親和色譜法步驟中完成，使用GSTrap HPUml Hi Trap親和 柱(Amersham Biosciences)。遵循製造商的指導。使來自屋塵蟎(D. pteronyssinus)的486mg提取物溶解於9. 6ml結合緩衝液 (PBS，pH 7.2)中，並且經過 0.45 μ m 截止濾器(Mi 1 lex _HV，MILLIP0RE)。柱保留 nDer p8，這隨後洗脫(洗脫緩衝液50mMTris-HCl、10mM還原的穀胱甘肽，pH 8.0)。蛋白質洗脫 之後為測量餾分的A280，並且合併包含洗脫峰的那些。通過透析(參見下文的進一步操作)去除GSH，並且將樣品分成等分試樣且維持 在-20 0C οUV/VIS吸收光譜
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在蛋白質nDer pi和Der p8的純化過程中反覆測量在280nm處的吸光度，以便鑑 定哪個餾分包含蛋白質。記錄經純化的nDer pi或nDer p8的最終製劑在220nm和350nm 之間的UV/VIS吸收光譜，以便計算蛋白質濃度，使用朗伯_比爾(Lambert-Beers)定律。測量用PerkinElmer 儀器(型號Lambda 800UV/VISSpectrometer)來完成，並 且所使用的比色皿具有Icm的徑長(Hel 1 ma 、石英杯比色皿)。在讀數前，使分光光度計針對空白樣品調零。當測量nDer pi的吸光度時，洗脫緩 衝液用作參考。對於nDer p8，參考是不包含蛋白質的洗脫餾分之一。在每次讀數之間，用 2% Helmax (helmanex)溶液和milliQ水充分清洗比色皿，並且用高氣壓進行乾燥。nDer p8 的誘析為了研究Der pi的活性是否依賴於GSH，並且nDer p8是否能夠催化該過程，從 nDer p8 庫中去除 GSH。這通過應用透析盒(Slide-A-Lyser Dialysis 10K, PIERCE 產 品)來完成。通過將盒放置在浮筒中並且隨後將其放置在milliQ水中30秒而使膜水合。隨 後通過注射器來注射Der p8製劑，去除過量空氣。然後，將盒放置在1升透析緩衝液(PBS、 PH 7.2)中，並且放置在磁力攪拌上用於循環。在21/2小時後，將盒放置到另一升透析緩 衝液中。另一個21/2小時後，從盒中去除製劑，並且測量UV/VIS吸收且計算Der p8濃度。 隨後將Der p8庫分成等分試樣且維持在-20°C。SDS-PAGE使13 μ 1目的樣品與5μ 1樣品緩衝液χ 4 (NllP AGE , Invitrogen)相混合。依 賴於SDS-PAGE應在還原還是應在非還原條件下進行，通過應用2μ 1還原劑(NuPAGE ， Invitrogen)相應製備樣品。在非還原條件下，還原劑由2 μ 1 milliQ水替代。隨後使 樣品在70°C下加熱10分鐘並且隨後旋轉10秒。使40ml運行緩衝液χ 20 (NuPAGE , Invitrogen) % 800 μ 1 milliQ水相混合，以製備電泳緩衝液。將凝膠(NuPAGE 10% Bis-Tris 凝膠，Invitrogen)放置到 XCell Surelock 電泳槽(Invitrogen)中，並且將 600ml電泳緩衝液插入外室內。將0.5ml抗氧化劑(NuPAGE ，Invitrogen)加入其餘 200ml電泳緩衝液中，並且將這個溶液傾入內室內。Mf 分子量標記(SeeBlue Plus 2 Pre—Stained Standard, InVitrogen)禾口 15 μ 1 每種樣品裝載到凝膠內後，在200V的恆壓下使電泳運行40分鐘。SDS-PAGE 凝膠染餼在電泳後，根據下述方案用銀染色法使凝膠染色固定溶液30分鐘；溫育溶液 (50ml溫育緩衝液+260 μ 1 25% glutaraldehyd (戊二醛)30分鐘；在milliQ水中洗滌 3X10分鐘；銀溶液(50ml銀溶液+10 μ 1 37%甲醛)40分鐘；在milliQ水中洗滌小於 1分鐘；顯色溶液(50ml顯色溶液+5 μ 1 37%甲醛)直至條帶變得可見；用停止溶液來停 止反應10分鐘；在milliQ水中洗滌；2X 5分鐘；貯藏在貯藏緩衝液中。固定溶液40%乙醇，10%乙酸溫育緩衝液30%乙醇，0，83M乙酸鈉，8mM硫代磷酸鈉銀溶液5.9mM硝酸銀顯色溶液0. 24M碳酸鈉停止溶液39mM EDTA
蛋白質印跡.為了驗證在SDS-PAGE中施加的樣品中的蛋白質特性，對凝膠實施蛋白質印跡。通 過蛋白質印跡將通過電泳在凝膠中分開的蛋白質轉移至PVDF膜。整個過程在室溫下執行。4個印跡墊(Blotting Pads)首先在milliQ水中洗滌，並且隨後浸泡在轉移 緩衝液(轉移緩衝液(20x) (NuPAGE )、96%乙醇(Spiritus Fortis DLS)、抗氧化劑 (NuPAGE )和milli-Q/JO中。將空氣壓出印跡墊，並且將2個放置在XCell II Blot Module中。在其施加在XCell上之前，將濾紙也浸泡在轉移緩衝液中。將來自電泳的凝膠放 置在濾紙頂上。使PVDF膜(Invitrogen)在乙醇中浸泡30秒，隨後在mi 11 iQ水中漂洗，並且 在平放到轉移緩衝液中數分鐘後最後放置在凝膠上。將另一片溼濾紙放置在膜的頂上，並 且隨後加入2個另外的印跡墊。使器械裝配且放置在XCell Surelock電泳槽(Invitrogen) 中。使內室充滿轉移緩衝液，並且使外室充滿milliQ水。印跡在30V下進行1小時。根據下述免疫印跡操作，膜隨後進行處理且染色以揭示Der pi的存在封閉(洗 滌緩衝液+2% Tween):不超過2分鐘；用洗滌緩衝液洗滌5分鐘；一抗(兔α -Der pi, ALK-Abell ) =I1/2小時；用洗滌緩衝液洗滌3Χ5分鐘；二抗(豬α -兔，Dako) :1小時；用 洗滌緩衝液洗滌3X5分鐘；顯現(使1片BCIP/NBT (Sigma)溶解於IOml milliQ水中) 直至條帶變得可見；用miliQ水停止反應；膜在濾紙上乾燥。洗滌緩衝液50mM Tris、150mM氯化鈉蛋白水解活性的測定法使用與螢光基團AMC連接的肽底物Z-LLE評估nDer pi的酶促活性。當與肽連接 時，AMC猝滅，並且僅顯示極少螢光。當加入Der pi時，它切割AMC和肽序列之間的鍵，並 且螢光大量增加。因此，就螢光中的增加而言評估產物形成。所有活性測定法在SpectraMax儀器(GeminiXS MolecularDevises)上在37°C下 進行。使用350nm的激發波長(λ ex)和450nm的發射波長(λ em)測量螢光。Spectra Max 儀器設定為在第一次閱讀前和閱讀之間自動混合。酶促活性以RFU相對螢光單位進行測 量。使用軟體SoftMax PR0 4. 3LS，根據發展曲線的最大斜率評估反應的初速度(VO)。測定緩衝液(50mMTris (Sigma)、5mM EDTA (Fluka))的母液和 IM DTT (Merck)制 備一次且分別維持在+5°C和-20°C。DTT以55 μ 1等分試樣維持，並且需要時，緊在使用前 將DTT加入測定緩衝液中。對於微量滴定板(Corning，96孔非結合黑色聚苯乙烯板)中的每個孔施加的總體 積總計為200 μ 1。反應總是通過添加在測定緩衝液中稀釋的50 μ 1 0. ImM或ImM底物起 始，並且螢光連續測量20-90分鐘。使用在半胱氨酸蛋白酶特異性抑制劑Ε64的存在或不存在下的酶促測定法，以便 驗證經純化的蛋白質作為半胱氨酸蛋白酶的特性。使一個等分試樣的nDer pi在37°C與 溶解於測定緩衝液中的25 μ M Ε64預溫育1小時，而另一個等分試樣則不是。然後加入以 0. ImM濃度的底物。螢光測量20分鐘。測定法中的nDer pi濃度是2，6 μ M。測試穀胱甘肽(GSH)是否能夠活化nDer pl，並且活化是否是劑量依賴性的。在 0. 5mM、l. OmM,5. OmMUO. OmM 和 25. OmM 的不同 GSH 濃度的存在下測定 1，3 μ MnDer pl 的活 性。作為對照，還在5mM DTT的存在下測量活性。螢光測量90分鐘。評估nDer p8作為穀胱甘肽S-轉移酶是否能夠催化nDer pl通過GSH的活化。在
16這個測定法中，nDer pi維持在1，3 μ M，並且GSH濃度維持在100 μ Μ(在氣道中的生理學濃 度)。nDer p8以4個不同濃度加入0，4 μ M、0，6 μ M、0，8 μ M和1，2 μ M。加入孔中的最後 2個組分是GSH緊接著是底物。反應在90分鐘過程中進行監視。結果nDer pi 純化nDer pi在2個親和色譜法步驟中進行純化。在第一個中，使用4C1-瓊脂糖柱。 收集且濃縮洗脫峰中的餾分。在濃縮後，對製劑實施在SBTI-瓊脂糖柱上的第二次色譜法。 nDer pi流出柱而不結合併且在2個峰中出現。將來自每個峰的餾分集合在2個分開庫—— 庫1和庫2中。在SDS-PAGE後分別通過銀染色法或蛋白質印跡評估經純化的蛋白質的純度和特 性，其中使用多克隆單特異性Der pi抗體。2個庫都包含在 25kDa處的主要條帶，這通過抗體識別為Der pi。抗體還識別 較低分子量的一些條帶，這可能是Der pi的降解片段。在SDS-PAGE上在約10_16kDa之間 的汙點不由抗體識別，並且可能由汙染物或起因於nDer pi降解的小片段引起。約55kDa 的高分子量條帶由抗體識別，並且可能代表某些Der pi 二聚體。Der pi的酶促活性在2個庫中在半胱氨酸蛋白酶抑制劑E 64的存在以及不存在 下進行評估，用DTT作為還原劑。第一個庫顯示明確活性，而第二個庫未顯示任何顯著活 性。結果在圖1中描繪。因為Z-LLE-AMC是關於半胱氨酸蛋白酶的特異性底物(WiIlenbrock H和 Sierakowska A，2002，Masther Thesis)，並且因為該活性被半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64完 全抑制，並且Der pi是據報告存在於屋塵蟎(D. pteronyssinus)糞便顆粒中的唯一半胱氨 酸蛋白酶，所以這些數據證實經純化的蛋白質是Der pi。測量2個庫的UV/VIS吸收譜，並且根據在280nm處的吸收計算濃度，其中使用朗 伯_比爾定律，用Icm的光徑長和1. 73的摩爾消光係數。濃度對於庫1是0. 259mg/ml，並 且對於庫2是0. 0943mg/ml。nDer p8 的純化nDer p8在GSTrap HP, Hi Trap親和柱上進行純化。與洗脫峰相對應的餾分的 SDS-PAGE凝膠分析顯示具有約25kDa分子量的唯一一個條帶。在純化後，預期蛋白質製劑具有與洗脫緩衝液相同的GSH濃度；這是IOmM GSH。為 了測試GSH是否能夠以在肺的氣道中發現的相同濃度活化Der pl，並且Der p8是否能夠催 化這個反應，從nDer p8製劑中去除GSH是重要的。這通過透析來完成。然後，使用在280nm 處的消光係數伍°』1%) 1.576(1^/1111)-1011-1，通過而八13吸收光譜法計算110吐p8濃度。最 終 nDer p8 濃度是 0. 121mg/ml。通過GSH的nDer pi活化圖2和3顯示nDer pi可以通過GSH活化，並且活化實際上是劑量依賴性的。因 此，更大的GSH濃度導致更高的活性，並且像這樣當不存在GSH時，沒有活性。看起來好像通 過GSH的活化比通過DTT的活化慢。事實上，通過在氣道中生理學濃度的GSH(0，1-0. 5mM) 的活化具有約30分鐘的滯後時間(檢測酶活性所需的時間)。用5. OmMGSH的濃度，活性 在約8分鐘後進展，而使用10. OmM GSH,活性在6分鐘後加強。在最高的GSG濃度(這是25. OmM)下，活性在僅3分鐘後顯著增加。圖4顯示在活性的初速率和GSH濃度之間存在近似線性相關。用Der p8的酶促活件測定已知nDer pi可以通過GSH活化，測試nDer p8作為穀胱甘肽S-轉移酶是否能夠 催化該過程是恰當的。人類氣道上皮襯裡液中的GSH生理學水平是100 μ Μ-500 μ Μ。nDer p8的效應在 最低水平ΙΟΟμΜ下進行測試。圖5顯示來自活性測定的結果。Der pi單獨不具有活性。即使存在底物，在Der pi通過還原劑例如GSH活化前， 它也不能被切割。當Der pi通過0. ImM GSH活化時，該活性很低並且它在約30分鐘的長 滯後時間後開始。在DerpS的存在下，活性較高並且滯後時間更短。這2種效應都是劑量 依賴性的。反應速率在測定的最終進行測量。圖6顯示速率在更高的nDerpS濃度下如何 顯著增加。結果討論通過親和色譜法純化來自屋塵蟎(D. pteronyssinus)的2種變應原nDer pi和 nDer p8。在第一個純化步驟後，將nDer pi施加於SBTI柱，以去除汙染絲氨酸蛋白酶(Der p3)，產生包含nDer pi的2個庫，如通過蛋白質印跡驗證的。因此，純化產生分別具有 0. 259mg/ml 禾口 0. 094mg/ml 的 nDer pi 濃度的 2 個庫。因為SBTI柱將僅結合Der p3，所以Der pi應運行通過。因此，預期在一個峰中回 收nDer pi。Der pi為何在2個峰中從SBTI瓊脂糖柱中洗脫可能存在不同原因。該柱人工 填充，因此存在在填充柱的過程中產生某些誤差的可能性。如果柱是異質的，那麼nDer pi 分子可能具有通過柱中的更密集區域的困難，並且因此，它們將以不同速率洗脫。另一個可 能的解釋是2個不同類型的nDer pi分子的存在，其中之一不知何故能夠與柱相互作用，導 致其洗脫中的延遲。除驗證經純化的主要蛋白質是nDer pi外，蛋白質印跡還顯示nDer pi的某些降 解片段，以及低分子量的其他次要蛋白質。這些是汙染物，意指不由所使用的多克隆抗-Der Pl抗體識別。因為Der pi是蛋白酶，所以可能它已通過自溶切割其自身，因此，導致具有 16-24kDa分子量的條帶。即使Der pi—直保持冷卻，也可能發生某種程度的自溶。第一種酶促活性測定法顯示在nDer pi庫1中存在活性，並且它被E64完全抑制。 nDer pi庫中的雜質因此不引起對nDer pi活性的任何不希望有的貢獻。庫2未顯示任何 活性。可能低nDer pi濃度不允許活性的任何檢測，或可能庫2包含變性nDer pi。後面這 種可能性也可以證明為何這種nDer pi在與活性nDer pi不同的峰中從SBTI瓊脂糖柱中 洗脫。純化nDer p8，並且這種純化的SDS-PAGE隨後為銀染色法顯示具有正確分子 量-約25kDa的唯一一個條帶。因為經純化的蛋白質顯示所預期的穀胱甘肽S-轉移酶活 性，所以蛋白質非常可能事實上是nDer p8。GSH能夠活化nDer pl，並且nDer pi的活性與GSH濃度的增加相關地增加GSH濃 度越高，nDer pl活性越高，並且產生nDer pl活化的滯後時間越短。已知蛋白質通過GSH的還原是緩慢且無效率的，並且在其中這種還原發生的代謝過程中，該反應由穀胱甘肽S-轉移酶催化。因為Der p8被描述為穀胱甘肽S-轉移酶，所 以檢查nDer p8是否能夠催化通過GSH的nDer pi活化，使得它更有效。因為GSH在人肺 氣道中的生理學水平是100μΜ-500μΜ，所以決定檢查nDer p8對通過0. lmM(100 μ M)的 GSH濃度的nDer pi活化的作用。這個測定法證明Derp8增強通過GSH的nDer pi活化。 在所使用的最低nDer p8濃度(0，4 μ M)下，它經過30分鐘直至活性使其自身與不含nDer P8的測試區分開。用1.2μΜ Der ρ8，活性在約8分鐘後增加並且在整個測量期間自始至 終保持增加，這延長至90分鐘。圖6顯示nDe r pi活化的水平和速率在更高的Der p8濃 度下增加。換言之，nDer p8對nDer pi的GSH活化的作用是劑量依賴性的。
總之，呈現的實驗明確舉例說明nDer pi可以通過在生理學水平下的GSH活化，並 且活性水平和滯後時間是劑量依賴性的。此外，結果已顯示由於其穀胱甘肽S-轉移酶活 性，在屋塵蟎(D.pteronyssinus)糞便團塊中與nDer pi—起旅行的nDer p8能夠催化該 過程。這種催化是劑量依賴性的。此外，呈現的實驗已顯示可以在體外製備還原活性Der pl，並且將包含還原活性Der pi的疫苗組合物在體內施用於黏膜表面，同時使Der pi維持 在其還原活性狀態中。此外，呈現的實驗已顯示在疫苗組合物中包括GSH和穀胱甘肽S-轉 移酶將幫助在施用後使Der pi維持在其還原活性狀態中。
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權利要求
用於黏膜施用的過敏症疫苗組合物，其包括處於還原活性狀態的半胱氨酸蛋白酶變應原。
2.根據權利要求1的組合物，其中70%的所述半胱氨酸蛋白酶變應原、優選80%、更優 選90 %、更優選95 %、更優選98 %處於還原活性狀態。
3.根據權利要求1或2的組合物，其進一步包括藥學上可接受的還原劑。
4.根據權利要求3的組合物，其中所述藥學上可接受的還原劑選自半胱氨酸、穀胱甘 肽、穀胱甘肽和穀胱甘肽S-轉移酶的組合、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱胺、硫氧還蛋白、N-乙 醯-L-半胱氨酸(NAC)、α -硫辛酸、2-巰基乙醇、2_巰基乙磺酸、巰基-propionyglycine 或三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
5.根據權利要求4的組合物，其中所述藥學上可接受的還原劑是還原的穀胱甘肽 (GSH)。
6.根據權利要求1-5中任一項的組合物，其進一步包括穀胱甘肽S-轉移酶(GST)。
7.根據權利要求6的組合物，其中所述穀胱甘肽S-轉移酶是DerpS。
8.用於黏膜施用的過敏症疫苗組合物，其包括處於氧化無活性狀態的半胱氨酸蛋白酶 變應原。
9.根據權利要求8的組合物，其中70%的所述半胱氨酸蛋白酶變應原、優選80%、更優 選90 %、更優選95 %、更優選98 %處於氧化無活性狀態。
10.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述半胱氨酸蛋白酶變應原選自Ale ol、Aca sl、Blo tl、Der fl、Der pi>Der ml>Der sl、Eur ml、Gly dl、Lep dl、Pso ol、Sui ml 和 Tyr pi，特別是 Der pi。
11.根據權利要求10的組合物，其中所述半胱氨酸蛋白酶變應原是Derpi。
12.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述黏膜施用選自經口(經由消化系 統的黏膜)、鼻、陰道、舌下、目艮睛、直腸、尿道、乳房內、肺、Otolar (即經由耳)和頰部施用。
13.根據權利要求12的組合物，其中所述黏膜施用選自舌下和頰部施用。
14.根據前述權利要求中任一項的組合物，其包括佐劑。
15.佐劑系統，其用於在包括半胱氨酸蛋白酶的用於黏膜施用的疫苗中使用。
16.根據權利要求15的佐劑系統，其中所述半胱氨酸蛋白酶處於還原活性狀態。
17.根據權利要求15或16的佐劑系統，其中所述佐劑系統進一步包括還原的穀胱甘肽。
18.根據權利要求15-17中任一項的佐劑系統，其中所述佐劑系統進一步包括穀胱甘 肽S-轉移酶。
19.根據權利要求18的佐劑系統，其中所述穀胱甘肽S-轉移酶是Derp8。
20.根據權利要求15的佐劑系統，其中所述半胱氨酸蛋白酶處於氧化無活性狀態。
21.根據權利要求15-20中任一項的佐劑系統，其中所述半胱氨酸蛋白酶變應原選自 Ale ol、Aca sl、Blo tl、Der fKDer piΛDer ml、Der sl、Eur ml、Gly dl、Lep dl、Pso ol、 Sui ml 禾口 Tyr pi。
22.根據權利要求21的佐劑系統，其中所述半胱氨酸蛋白酶變應原是Derpi。
23.用於黏膜施用的抗原疫苗組合物，其包括抗原和根據權利要求15-22中任一項的 佐劑系統。
24.根據權利要求23的組合物，其中所述抗原是變應原。
25.根據權利要求24的組合物，其中所述抗原選自草花粉變應原、塵蟎變應原、豚草變 應原、雪松花粉、貓變應原和樺樹變應原。
26.預防或治療有此需要的受試者中的過敏症的方法，其包括給所述受試者施用根據 權利要求1-14或24-25中任一項的疫苗組合物。
全文摘要
本發明涉及包括處於還原活性狀態或處於氧化無活性狀態的半胱氨酸蛋白酶變應原用於黏膜施用的過敏症疫苗組合物。本發明進一步涉及用於在包括半胱氨酸蛋白酶用於黏膜施用的疫苗中使用的佐劑系統。
文檔編號A61K39/39GK101909646SQ200980101639
公開日2010年12月8日 申請日期2009年1月7日 優先權日2008年1月8日
發明者M·M·費雷拉斯戈麥斯 申請人:阿爾克-阿貝洛有限公司