一種構建組織工程皮膚的方法
2023-05-17 19:13:26
專利名稱：一種構建組織工程皮膚的方法
技術領域：
本發明涉及一種構建組織工程皮膚的方法。
背景技術：
皮膚是人體最大的器官，它由三部分即表皮層、真皮層和皮下層構成。表皮層位於皮膚的最外層，厚度介於0.06-0.8mm之間，其微結構由基底層、棘細胞層、顆粒細胞層和角質層構成。角質層是表皮細胞分化的最後產物，其組成中75%-80%為蛋白質，5%-15%為脂類，由10-15層細胞構成厚度大約10pm的結構。角質層有著許多重要的生理功能，能夠有效阻擋外界毒性化合物對皮膚活性細胞的損傷，特別是對化妝品成分中潛在可能產生的細胞毒性有著極為重要的屏障作用。
組織工程皮膚經歷了從表皮替代物、真皮替代物到雙層結構的組織工程皮膚替代物的階段，其基礎研究和應用研究有了廣泛的進步。應用研究涉及體內應用和體外應用，體內應用集中在各種皮膚創傷的治療，體外主要運用於化合物的毒性檢測，如化合物的腐蝕性、刺激性、光毒性、生殖毒性等的檢測。體外毒性檢測方面，歐洲替代方法驗證中心(ECVAM)主導的對各種動物替代方法進行的驗證工作是一項系統工程，引起了世界範圍的關注。以組織工程皮膚為例，進行的化合物腐蝕性檢測目前只有EpiDerm和EpiSkin兩種產品通過驗證，刺激性檢測目前僅有EpiSkin通過了驗證。通過驗證的組織工程皮膚產品數量之所以如此少，很大程度上是因為構建的組織工程皮膚與天然皮膚在結構上相差甚遠所致。因為結構的不成熟，造成檢測化合物對活性細胞產生的毒性與其本身體內產生毒性的數據不符，導致誤判率偏高，不能達到在功能檢測上要求的預測精確度。
目前，有關提高組織工程皮膚與天然皮膚在結構上的相似性的研究較多，眾多研究均有力的證實組織工程皮膚構建過程中的種子細胞與生物支架之間的相互作用對組織工程皮膚的結構有著極為重要的影響。因此，在選擇生物支架材料上的一個基本原則是儘可能的接近或者模擬天然皮膚的細胞外基質。而天然皮膚的真皮層主要是由成纖維細胞構成的，其細胞外基質也主要由成纖維細胞分泌得來。所以，培養的成纖維細胞所分泌的細胞外基質在組成和結構上與天然皮膚非常類似。利用這種自分泌細胞外基質構建的組織工程皮膚在結構上更接近天然皮膚的結構，在化合物毒性預測的精確度和靈敏度上必然進一步提高。經檢索，有關利用自分泌細胞外基質構建組織工程皮膚的方法，至今尚未見有技術文獻公開。
發明內容
本發明的目的在於提供一種利用自分泌細胞外基質構建組織工程皮膚的方法。
一種構建組織工程皮膚的方法，在所述構建方法中，釆用成纖維細胞的自分泌細胞外基質作為組織工程皮膚的生物支架。
本發明的方法，具體包括以下步驟-
(1) 將插入式細胞培養皿放入細胞培養孔板中，將1~10乂105個人源成纖維細胞與l~3mL細胞培養液充分混合，得細胞懸液，將該細胞懸液滴加到插入式細胞培養皿，在37'C，5%0)2培養箱中培養10 30天，每周換液兩次，得成纖維細胞與自分泌細胞外基質的複合物；
(2) 將步驟(1)得到的成纖維細胞與自分泌細胞外基質的複合物浸泡在無菌PBS中，在37°C， 5%<302培養箱中培養48h，使成纖維細胞飢餓而死亡，得不含活細胞的自分泌細胞外基質；
(3) 將歩驟(2)得到的不含活細胞的自分泌細胞外基質紫外線照射0.5 5h;
(4) 在歩驟(3)處理後的基質上面添加l~10X105/mL人源表皮細胞懸液lmL，繼續培養lh後，添加培養液3 5mL，繼續培養5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織工程皮膚維形進行氣液面培養10 20天結束，即獲得利用自分泌細胞外基質構建的組織工程皮膚。
根據本發明的方法構建組織工程皮膚，利用培養的成纖維細胞所分泌的細胞外基質作為生物支架，人源表皮細胞作為種子細胞，培養得到的組織工程皮膚更接近天然皮膚的結構，利於提高化合物毒性的預測靈敏度和精確度。
本發明的方法具有以下優點 一是方法簡便，所有材料均以液體形式，便於產品的合成和規模生產；二是獲得的產品具有更接近天然皮膚的結構，利於提高化合物毒性的預測靈敏度和精確度；三是產品不含有另外添加的生物材料，不會出現人畜共患病交叉感染的風險；四是獲得的產品便於質量控制，縮小批次之間變異。
具體實施例方式
為進一步說明本發明，結合以下實施例具體闡述-
實施例1:
一種利用自分泌細胞外基質構建組織工程皮膚的方法，包括以下步驟
(1)將插入式細胞培養皿放入細胞培養孔板中，將1乂105個人源成纖維細胞與lmL細胞培養液充分混合，得細胞懸液，將該細胞懸液滴加到插入式細胞培養皿，在37'C， 5%C02培養箱中培養10天，每周換液兩次，得成纖維細胞與自分泌細胞外基質的複合物；
(2) 將步驟(1)得到的成纖維細胞與自分泌細胞外基質的複合物浸泡在無菌PBS中，在37°C， 5%(302培養箱中培養48h，使成纖維細胞飢餓而死亡，得不含活細胞的自分泌細胞外基質；
(3) 將歩驟(2)得到的不含活細胞的自分泌細胞外基質紫外線照射lh;
(4) 在步驟(3)處理後的基質上面添加1X10VmL人源表皮細胞懸液lmL，繼續培養lh後，添加培養液3 5mL，繼續培養5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織工程皮膚雛形進行氣液面培養10~20天結束，即獲得利用自分泌細胞外基質構建的組織工程皮膚。
實施例2:
一種利用自分泌細胞外基質構建組織工程皮膚的方法，包括以下步驟(1 )將插入式細胞培養皿放入細胞培養孔板中，將5 X 105個人源成纖維細胞與2mL細胞培養液充分混合，得細胞懸液，將該細胞懸液滴加到插入式細胞培養皿，在37'C， 5%C02培養箱中培養20天，每周換液兩次，得成纖維細胞與自分泌細胞外基質的複合物；
(2) 將步驟(1)得到的成纖維細胞與自分泌細胞外基質的複合物浸泡在無菌PBS中，在37°C， 5。/。C02培養箱中培養48h，使成纖維細胞飢餓而死亡，得不含活細胞的自分泌細胞外基質；
(3) 將步驟(2)得到的不含活細胞的自分泌細胞外基質紫外線照射3h;
(4) 在步驟(3)處理後的基質上面添加5X105/mL人源表皮細胞懸液lmL，繼續培養lh後，添加培養液3 5mL，繼續培養5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織工程皮膚雛形進行氣液面培養10~20天結束，即獲得利用自分泌細胞外基質構建的組織工程皮膚。、
實施例3:
一種利用自分泌細胞外基質構建組織工程皮膚的方法，包括以下步驟(1)將插入式細胞培養皿放入細胞培養孔板中，將10X 105個人源成纖維細胞與3mL細胞培養液充分混合，得細胞懸液，將該細胞懸液滴加到插入式細胞培養皿，在37°C，
55%<:02培養箱中培養30天，每周換液兩次，得成纖維細胞與自分泌細胞外基質的復
合物；
(2) 將步驟(1)得到的成纖維細胞與自分泌細胞外基質的複合物浸泡在無菌PBS中，在 37°C， 5%(:02培養箱中培養48h，使成纖維細胞飢餓而死亡，得不含活細胞的自分泌 細胞外基質；
(3) 將步驟(2)得到的不含活細胞的自分泌細胞外基質紫外線照射5h;
(4) 在步驟(3)處理後的基質上面添加10X 105/mL人源表皮細胞懸液lmL，繼續培養lh 後，添加培養液3 5mL，繼續培養5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織工 程皮膚雛形進行氣液面培養10 20天結束，即獲得利用自分泌細胞外基質構建的組織 工程皮膚。
以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行 限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作 出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。
權利要求
1、一種構建組織工程皮膚的方法，其特徵在於在所述構建方法中，採用成纖維細胞的自分泌細胞外基質作為組織工程皮膚的生物支架。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於包括以下步驟(1) 將插入式細胞培養皿放入細胞培養孔板中，將l-10XlS個人源成纖維細胞與1 3mL 細胞培養液充分混合，得細胞懸液，將該細胞懸液滴加到插入式細胞培養皿，在37'C， 5%<302培養箱中培養10 30天，每周換液兩次，得成纖維細胞與自分泌細胞外基質的 複合物；(2) 將步驟(1)得到的成纖維細胞與自分泌細胞外基質的複合物浸泡在無菌PBS中，在 37°C， 5%<302培養箱中培養48h，使成纖維細胞飢餓而死亡，得不含活細胞的自分泌 細胞外基質；(3) 將步驟(2)得到的不含活細胞的自分泌細胞外基質紫外線照射0.5 5h;(4) 在步驟(3)處理後的基質上面添加l~10X105/mL人源表皮細胞懸液lmL，繼續培養 lh後，添加培養液3 5mL，繼續培養5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織 工程皮膚雛形進行氣液面培養10-20天結束，即獲得利用自分泌細胞外基質構建的組 織工程皮膚。
3、 權利要求1或2所述的方法構建的組織工程皮膚。
全文摘要
一種構建組織工程皮膚的方法，在所述構建方法中，採用成纖維細胞的自分泌細胞外基質作為組織工程皮膚的生物支架。本發明利用培養的成纖維細胞所分泌的細胞外基質作為生物支架，人源表皮細胞作為種子細胞，培養得到的組織工程皮膚更接近天然皮膚的結構；本發明的方法具有以下優點一是方法簡便，所有材料均以液體形式，便於產品的合成和規模生產；二是獲得的產品具有更接近天然皮膚的結構，利於提高化合物毒性的預測靈敏度和精確度；三是產品不含有另外添加的生物材料，不會出現人畜共患病交叉感染的風險；四是獲得的產品便於質量控制，縮小批次之間變異。
文檔編號A61L27/60GK101485905SQ20091007835
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月26日 優先權日2009年2月26日
發明者楊曉冉, 王軍兵, 豔 程, 董益陽, 鄒運動, 鄭洪豔 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院