Ph－依賴性的多肽聚集及其用途的製作方法

2023-05-16 23:00:51

專利名稱：Ph－依賴性的多肽聚集及其用途的製作方法
相關申請本申請要求於2003年3月25日提交的美國國家普通專利申請號10/397,059的優先權，為了所有的目的明確地包括其公開的內容作為參考。
背景技術：
在鑑定傳染性海綿狀腦病(TSE)的傳染物的努力中檢測到了朊病毒蛋白(PrP)，因此我們已知很多關於瘙癢病形式PrPSc的病理學活性，而細胞形式的PrPC的生理功能仍然是個謎(Prusiner，S.B.(1998)Prions.Proc Natl Acad Sci U S A 95，13363-13383)。PrPC是在健康的成人腦中不均勻分布的突觸的糖蛋白，其通過糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨附著於細胞表面且分配到稱為脂類筏(raft)的膜結構域。細胞表面上PrPC的定位表明它可能在細胞粘著、配體攝取或跨膜信號傳導中發揮作用。
根據雞PrPC的生物化學分析，假設PrPC可能參與調節突觸末端膽鹼能受體的表達。實際上PrPC-超表達的轉基因小鼠的免疫組織化學顯示的突觸表達模式是PrPC主要位於突觸的質膜以及在突觸小泡中程度較少。電子顯微鏡術表明在突觸前和突觸後都存在蛋白。PrPC也已經沿著延伸的軸突定位，並且有增加的證據表明PrPC可能作為粘著蛋白在軸突生長中起作用。
由序列PHGGGWGQ的重複組成的八肽重複區是哺乳動物中PrP的最保守片段(Schtzl，H.M.，Da Costa，M.，Taylor，L.，Cohen，F.E.和Prusiner，S.B.(1995)Prion protein gene variationamong primates.J Mol Biol 245，362-374；Wopfner，F.，Weidenhofer，G.，Schneider，R.，von Brunn，A.，Gilch，S.，Schwarz，T.F.，Werner，T.和Schtzl，H.M.(1999)Analysis of27 mammalian and 9 avian PrPs reveals high conservation offlexible regions of the prion protein.J Mol Biol289，1163-1178)。人PrP中第60至91位殘基由4個包含His的八肽重複(OPR)組成，而第51至59位殘基由同源序列PQGGGGWGQ組成(圖1)。
圖1顯示人朊病毒蛋白(hPrP)的一級結構。成熟的人朊病毒蛋白由第23至230位殘基組成。第51至91位殘基的OPR區域(灰盒)的詳細胺基酸序列顯示在下部，在核磁共振(NMR)波譜中明確指定的殘基加了下劃線。對於片段54-89，對每個重複的胺基酸只檢測到單組的共振信號。普通的二級結構元件以黑體表示。Cys179和Cys214之間的二硫鍵(S-S)描繪為灰線。上部的箭頭表明被用於本研究的hPrP構建體的N-末端截短位點。
Hornshaw及其同事首先證明了銅與哺乳動物和鳥類朊病毒蛋白OPR的結合(Hornshaw，M.P.，McDermott，J.R.，Candy，J.M.和Lakey，J.H.(1995)Copper binding to the N-terminal tandemrepeat region of mammalian and avian prion proteinstructuralstudies using synthetic peptides.Biochem Biophys Res Commun214，993-999；Hornshaw，M.P.，McDermott，J.R.，Candy，J.M.和Lakey，J.H.(1995)Copper-Binding to the N-Terminal TandemRepeat Region of Mammalian and Avian Prion Protein-StructuralStudies Using Synthetic Peptides.Biochemical and BiophysicalResearch Communications 214，993-999)，並且已經表明銅的結合參與PrPC的生理功能(Brown，D.R.等人(1997)The cellular prionprotein binds copper in vivo.Nature 390，684-687)。最近，在PrPC的OPR內已經鑑定出肝素結合位點，其中在存在Cu2+時結合增強。對於在存在硫酸乙醯肝素時層粘連蛋白受體蛋白作為PrPC受體起作用的發現表明了朊病毒蛋白、銅、肝素/硫酸乙醯肝素和受體蛋白之間的複雜相互作用，其暗示了朊病毒蛋白的細胞功能。也已經表明從突觸小泡釋放PrPC以防止突觸間隙中蛋白的非特異銅結合，並且它支持通過胞吞作用使銅再攝取進入突觸前。
現有技術中觀察到的問題傳染性海綿狀腦病(TSE)或朊病毒疾病是由非常規的傳染物(朊病毒)所引起的中樞神經系統致命性病症，其中非常規的傳染物由朊病毒蛋白(PrPSc)組成(Prusiner，S.B.(1998)Prions.Proc NatlAcad Sci USA 95，13363-13383)。TSE中的關鍵事件是由朊病毒基因PRNP編碼的宿主蛋白，即細胞朊病毒蛋白(PrPc)構象變化成為神經病理學同工型PrPSc，其聚集成為澱粉狀原纖維並且積累進入神經和淋巴網狀細胞(Doi，S.，Ito，M.，Shinagawa，M.，Sato，G.，Isomura，H.和Goto，H.(1988)Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the centralnervous system from preclinical scrapie-infected mice.J GenVirol 69(Pt 4)，955-960；Wadsworth，J.D.F.，Joiner，S.，Hill，A.F.，Campbell，T.A.，Desbruslais，M.，Luthert，P.J.和Collinge，J.(2001)Tissue distribution of proteaseresistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob diseaseusing a highly sensitive immunoblotting assay.Lancet358，171-180)。因此用於檢測其它傳染物的診斷策略，例如PCR是無用的。然而，需要在疾病的臨床病徵早期或臨床前階段期間的準確診斷方法作為體內篩選試驗或感染個體的鑑定。這些測試還不是可利用的，儘管在過去數年中已經取得巨大的成就。
只在TSE中形成PrPSc，因此這是對於這些病症的特異標記物。儘管在TSE影響的宿主體內廣泛分布有PrPSc且具傳染性，但組織學和生物化學損害只限於中樞神經系統(CNS)，稱為海綿狀腦病。在偶發和遺傳的TSE中，PrPSc起源的組織是未知的，但很可能PrPSc開始於CNS中，因此使得根據在容易接近的組織或體液中檢測PrPSc來開發早期診斷方法是無益的。在朊病毒感染期間，可在淋巴網狀組織中容易地檢測到PrPSc(Doi，S.等人(1988)Western blot detectionof scrapie-associated fibril protein in tissues outside thecentral nervous system from preclinical scrapie-infected mice.J Gen Virol 69(Pt 4)，955-960)，導致建議在取自活組織檢查的扁桃體組織中測量PrPSc來診斷羊中的瘙癢病和vCJD(Hill，A.F.，Zeidler，M.，Ironside，J.和Colline，J.(1997)Diagnosis of newvariant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy.Lancet349，99-100)，所述vCJD是一種已經從BSE-感染的牛傳染到人的Creutzfeldt-Jakob氏疾病的新變體。
近年來，已經極大地注意到在外周和易接近的組織(例如扁桃體)或體液(例如腦脊液(CSF)或血液)中的PrPSc檢測用於臨床前體內診斷TSE的可能用途。實驗數據不能檢測受任何形式的人TSE感染的患者血液中的傳染性，但vCJD患者可能是例外，對該患者的血液中傳染性的關注已經提高，這主要是由於PrPSc的高水平和淋巴網狀組織中的傳染性。
從臨床前診斷的觀點看來，診斷方法的靈敏性和濃縮PrPSc的方法成為至關重要的，這是因為CNS外部的PrPSc的量可能是極小的。現用的PrPSc檢測方法，例如ELISA的檢測極限是大約2pM(Ingrosso，L.，Vetrugno，V.，Cardone，F.和Pocchiari，M.(2002)Moleculardiagnostics of transmissible spongiform encephalopathies.Trends in Molecular Medicine 8，273-280)。使用以高親和力結合PrPSc的磷鎢酸鈉(Wadsworth，J.D.F.等人(2001)Tissuedistribution of protease resistant prion protein in variantCreutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitiveimmunoblotting assay.Lancet 358，171-180)和新發現的分子，例如纖溶酶原(Fischer，M.B.，Roeckl，C.，Parizek，P.，Schwarz，H.P.和Aguzzi A.(2000)Binding of disease-associated prionprotein to plasminogen.Nature 408，479-483)和原鈣粘著蛋白-2(protocadherin-2)(Brown，P.，Cervenakova，L.和Diringer，H.(2001)Blood infectivity and the prospects for a diagnosticscreening test in Creutzfeldt-Jakob disease.J Lab Clin Med137，5-13)用於改進的提取PrPSc的方法可能促進臨床前診斷TSE的新希望。增加PrPSc的最小可檢測水平的最初方法來自Saborio及其同事(Saborio，G.P.，Permanne，B.和Soto，C.(2001)Sensitivedetection of pathological prion protein by cyclicamplification of protein misfolding.Nature 411，810-813)，其開發了用於使PrPSc擴增10-100倍的有效方案。
發明目的和概述因此本發明的目的是提供可逆聚集/解離多肽的備選可能性。本發明的目的也是提供選擇性地結合這種多肽聚集體的三維結構的配體。本發明進一步的目的是提供檢測配體與這種多肽聚集體的三維結構結合的傳感器。
通過權利要求1所述的方法和權利要求10所述的蛋白獲得這些和進一步的目的。由從屬權利要求衍生另外的和優選的特性。
在pH值4.5和5.5之間的哺乳動物朊病毒蛋白的結構研究證實N-末端的100-殘基結構域是柔性無序的，即具有隨機的捲曲信息。本發明描述了在pH值6.5和7.8之間，即在細胞膜的pH，在包括高度保守序列PHGGGWGQ的重組的人朊病毒蛋白hPrP(23-230)中構造了八肽重複。在pH6.2，OPR的核磁共振(NMR)解決的結構顯示導致可逆的pH-依賴性的PrP寡聚化成為大分子的聚集體的新結構基序。與HGGGW-Cu2+的晶體結構比較表明銅離子的結合誘導可能調節PrP聚集的構象轉變。這些結果表明突觸間隙內同源的細胞粘著中細胞朊病毒蛋白的功能性作用。
生物受體可為特異的和靈敏的生物傳感器提供基礎(Schultz，JS.(1987)Sensitivity and dynamics of bioreceptor-basedbiosensors.Ann.N Y Acad.Sci.506，406-414)。在自然界中存在許多針對在生物技術和生物醫學中令人感興趣的生物化學試劑的生物受體來源。可改變並且利用現代的生物工程學技術改變和大量地產生這些生物受體(抗體、酶、膜蛋白、結合蛋白)(Rigler，P.，Ulrich，W.P.，Hoffmann，P.，Mayer，M.和Vogel，H.(2003)Reversible immobilization of peptidessurface modificationand in situ detection by attenuated total reflection FTIRspectroscopy.Chemphyschem.4，268-275)。也可通過改變類似分析物的結構來精細調諧生物傳感器的特徵，其也為給定生物受體提供幾個數量級範圍的靈敏性。分析物和生物受體之間反應的解離動力學可限制生物傳感器的最終靈敏性，因為在靈敏性和傳感器對分析物濃度改變的反應速率之間存在折衷。
本發明的優點包括·具有固有的聚集能力的多肽或蛋白可通過位於該多肽結構域中的肽重複的存在和結構而寡聚化，其中該多肽的結構域依賴於pH是柔性無序的。
·為可逆的多肽聚集/解離所需要的肽重複可以單獨地或與柔性無序蛋白結構域一起，是天然胺基酸序列的一部分，或可通過多肽或蛋白的翻譯後修飾導入。
·寡聚化只依賴於多肽或蛋白的流體環境的pH。
附圖簡述下列附圖旨在說明現有技術以及本發明。
也將通過


本發明所述方法的優選實施方案，而不意欲將其用來限制本發明的範圍。
圖1.人朊病毒蛋白的一級結構；圖2.hPrP多肽的表觀分子量；圖3.hPrP1H NMR波譜的pD依賴性圖3A hPrP(23-230)；圖3B hPrP(81-230)；圖3C hPrP(90-230)；圖4.八肽重複結構的立體視圖圖4A HGGGWGQP的20能量-改進(20energy-refined)的DYANA構象異構體；圖4B(HGGGWGQP)3的空間充滿模型；圖4C HGGGWGQ和HGGGW-Cu2+的X射線結構的比較；圖5.hPrP(23-230)的主鏈運動性(backbone mobility)。
發明詳述已經描述了在pH4.5的完整的人(Zahn，R.等人(2000)NMRsolution structure of the human prion protein.Proc Natl AcadSci U S A 97，145-150)、牛和鼠的PrP，以及在pH5.5的金黃倉鼠PrP的重組形式的NMR解決的結構。在酸性條件下，所有的朊病毒蛋白包含從大約第121-230位殘基延伸的C-末端球狀的結構域和N-末端結構域，所述C-末端結構域包含雙鏈的反平行β-摺疊和3個α-螺旋，並且N-末端結構域包括柔性無序的第23-120位殘基(圖1)。在pH7.3，即腦的平均間隙環境，沒有可利用的詳細結構信息，只是除了相應於在pH7確定的人朊病毒蛋白，hPrP(121-230)球狀結構域的C-末端片段的NMR結構(Luigi Calzolai和R.Z.，未發表的結果)，其與在酸性條件的結構基本上相似(Zahn等人，2000)。在最近已經根據於pH8的溶液中生長的晶體所確定的二聚體hPrP(90-231)的晶體結構中，2個球狀結構域通過鏈間的二硫鍵連接。
在研究pH對PrPC結構的可能影響的努力中，我們已經利用NMR光譜學和動態光散射研究了溶液中的重組的人朊病毒蛋白(hPrP)。為了這些研究，我們已經生產出相應於成熟的PrPC的重組的hPrP(23-230)以及2個N-末端截短的PrP構建體(圖1)。我們發現4個OPR-組氨酸的質子化導致PrP聚集。從15N-標記的hPrP(23-230)的距離限制(distance constraint)計算，我們已經計算出在pH6.2溶液中OPR的NMR結構。將這個結構與最近確定的銅結合的八肽重複片段HGGGW-Cu2+的晶體結構進行比較(Burns，C.S.等人(2002)Molecular features of the copper binding sites in theoctarepeat domain of the prion protein.Biochemistry 41，3991-4001)。關於在存在和不存在銅時PrPC中OPR的可能功能性作用來評估結果。
此外，本發明包括下列應用·提供和應用新類型的篩選試驗以及在TSE(傳染性海綿狀腦病)的臨床病徵早期或臨床前階段期間的準確診斷方法，特別是vCJD(Crelltzfeldt-Jakob氏病的新變體)。
·將OPR-標記的融合蛋白或多肽固定至固相，例如樹脂、玻璃珠等，使得能夠對所提供的和/或應用的OPR-標記的融合蛋白或多肽進行新類型的親和純化、富集或檢測。
·提供OPR-標記的融合蛋白或多肽，及它們用作IT技術的新類型的pH依賴性的分子開關，或用作在分子水平上工作的分子傳感器或機器。
·提供特異識別朊病毒蛋白的OPR-標記的融合蛋白或多肽作為針對TSE的治療劑，以及提供用於vCJD治療的基因治療載體。
·提供用於產生多克隆、單克隆和/或工程化抗體的OPR-標記的融合蛋白或多肽。
·提供選擇性地結合這種多肽聚集體的三維結構的配體。這種配體包括朊病毒蛋白(PrPC和PrPSc)、抗體、化學分子和包含八肽的融合蛋白。
·提供用於傳感器技術，包括化學(例如生物化學的)和/或物理學(例如光學)的傳感器晶片的OPR-標記的融合蛋白或多肽。
實驗結果1.人朊病毒蛋白的產生和光譜特性為了本研究製備下列多肽(圖1)成熟形式的人朊病毒蛋白，hPrP(23-230)；包含單個八肽的hPrP(81-230)；完全缺乏OPR並且與為朊病毒繁殖所需要的最小序列相應的hPrP(90-230)；和相應於優良構造的球狀PrP結構域的hPrP(121-230)(Zahn等人，2002)。該系列的構建體使得能夠研究總的鏈長度對人朊病毒蛋白溶液特性的可能影響。
2.pH對人朊病毒蛋白流體動力學半徑的影響圖2中概括了從動態光散射測量值確定的hPrP多肽的流體動力學半徑(RH)。
圖2顯示了hPrP多肽的表觀分子量。在20℃，用以pH4.5的10mM醋酸鈉(淺灰條)、pH7.0的10mM磷酸鈉(暗灰條)或pH4.5並且包含100mM氯化鈉的10mM醋酸鈉(黑條)緩衝的4mg/ml蛋白溶液進行動態光散射測量。對於各自具有30個數據點的4個獨立測量值給出標準誤。箭標指明在pH7.0，hPrP(23-230)的表觀分子量大於4MDa。
在pH4.5，hPrP(121-230)的RH與單體蛋白的分子大小很好地相符。當假定對於C-末端結構域為球形時，與如從胺基酸序列計算的13.1kDa相比，估計的hPrP(121-230)的表觀分子量是15.1kDa。第23-120位殘基的N-末端結構域只略微減少了hPrP分子在pH4.5溶液中的擴散速率，但是在存在100mM氯化鈉時，隨著N-末端長度的增加RH也增加。鹽對表觀分子量的影響是相當非特異性的，因為其不依賴於特異的序列基序。
然而在pH7.0，將蛋白溶液從pH4.5調節至pH7後，hPrP(23-230)的快速沉澱阻礙了利用動態光散射對RH的估計(圖2)，表明hPrP聚集體的顆粒大小＞4MDa。大小排阻層析實驗未能更精確地鑑定PrP聚集體的分子大小，因為蛋白與瓊脂糖-葡聚糖凝膠可能由於OPR對多糖的親和力而有相互作用(Hundt，C.等人(2001)Identificationof interaction domains of the prion protein with its 37-kDa/67-kDa laminin receptor.Embo Journal 20，5876-5886)。與此相反，當與在低離子強度的pH4.5溶液中的測量值相比時，C-末端片段hPrP(81-230)、hPrP(90-230)和hPrP(121-230)只顯示RH的略微增加，表明hPrP(23-230)高特異性地聚集成為大分子的蛋白微粒可能歸因於包括OPR的第23至89位殘基的N-末端片段(圖1)。
3.pD對人朊病毒蛋白的1H NMR譜線寬度的影響為了進一步表徵hPrP(23-230)的pH依賴性的聚集，我們在各種溶液條件進行1H NMR實驗。NMR實驗中的1H譜線寬度大約與總的旋轉相關時間(τc)成比例並且因此依賴於分子量和分子的形狀。譜線寬度明顯地大於以蛋白分子量為基礎所預測的值意味著由於聚集的τc增加或意味著化學交換或構象交換效應對譜線寬度有顯著影響。
圖3顯示hPrP1H NMR波譜的pD依賴性。顯示的是在D2O中的hPrP的0.6mM溶液於20℃在750MHz1H NMR波譜中從6至9ppm的光譜區。(A)hPrP(23-230)。(B)hPrP(81-230)。(C)hPrP(90-230)。在這些實驗前，通過將樣品溶解在D2O中使不穩定的質子與氘核交換。隨後，在通過加入少量的DCl使其再降低至pD4.5前，通過加入少量的NaOD使樣品的pD以逐步的方式增加(參見從下到上的箭標)。在各個波譜的頂部表明了所選擇的芳族共振信號的共振分配。
圖3A顯示在D2O中記錄的hPrP(23-230)的1H NMR波譜中從6至9ppm的光譜區。在pD4.5，位於摺疊的C-末端結構域內的His、Phe和Tyr殘基的芳環質子顯示大約23kDa的球狀蛋白的一般譜線寬度。柔性無序尾部的較少分散的共振線，例如組氨酸61、69、77和85的Hε1的重疊共振是明顯較狹窄的，因為由於尾部中運動性增加其有效的τc是更小的。當pD從4.5逐步增加至8時，His的Hε1共振移到高磁場並且1H譜線寬度普遍地增加，如圖3A中對於芳環質子所顯示的。通過上端波譜顯示變化是可逆的。用hPrP(81-230)重複相同的實驗導致共振信號的譜線輕微增寬(圖3B)，而對於hPrP(90-230)，譜線寬度不依賴於pD(圖3C)。
由於在D2O中進行這些測量，其中只檢測到非可交換的質子，所以我們可排除作為在NMR波譜中觀察到的一致譜線增寬的可能來源的化學交換。此外，構象交換對譜線寬度的唯一效應可能比在圖3A中觀察到的小很多，並且所記錄的NMR波譜與具有差的分散共振的熔化球狀蛋白的波譜並不相似(Dyson，H.J.和Wright，P.E.(2001)Nuclear Magnetic Resonance methods for elucidation ofstructure and dynamics in disordered states.Nuclear MagneticResonance of Biological Macromolecules，Pt B 339，258-270)。更可能的，並且根據動態光散射實驗(圖2)，在6.0至8.0的pD值的NMR峰值的漸進性增寬是由蛋白聚集造成的，所述蛋白聚集是由於肽片段23-89內的His側鏈，即4個OPR-組氨酸的去質子化(圖1)，導致觀察到Hε1共振的高磁場移動(圖3A)。在用未標記的hPrP(23-230)和15N-標記的hPrP(121-230)的等摩爾混合物的pH7.0的H2O溶液記錄的[15N，1H]-相關光譜學(COSY)波譜中沒有譜線增寬(數據未示出)，表明OPR的結合表位位於N-末端片段23-120內。
4.N-末端結構域在pH6.2的共振分配根據與在pH4.5記錄的波譜進行化學位移比較，從使用15N-標記的hPrP(23-230)進行的[15N，1H]-COSY pH-滴定實驗獲得N-末端片段23-120在pH6.2的主鏈醯胺質子和氮的序列特異性分配(Liu，A.Z.，Riek，R.，Wider，G.，yon Schroetter，C.，Zahn，R.和Wüthrich，K.(2000)NMR experiments for resonance assignments of C-13，N-15 doubly-labeled flexible polypeptidesApplication to thehuman prion protein hPrP(23-230).Journal of Biomolecular Nmr16，127-138)。在pH6.2，其中大約40％的無擾組氨酸是去質子化的，在[15N，1H]-COSY波譜中共振線只略微地增寬，表明在這些條件下PrP分子的大部分是單體的。利用三維的15N-解決的[1H，1H]-核Overhauser增強分光術(NOESY)波譜證實主鏈的分配，其隨後用於側鏈質子的分配。分配所有的多肽主鏈共振，其中除去Gly35、Gly93和Gly94的醯胺氮和醯胺質子，其與OPR區域中Gly殘基的共振重疊(Liu等人，2000)。個別的OPR片段的相應共振線完全重疊，只是除了2個側翼的二肽Gln52-Gly53和Gly90-Gln91(圖1)，即對於所有的5個重複，來自八肽中給定殘基的給定原子以相同的頻率發生共振。在不穩定的側鏈質子中，可利用殘基內的NOEs分配所有4個Asn和8個Gln殘基的醯胺基，唯一例外的是Gln59。由於與溶劑快速交換，所以在pH6.2不能檢測到3個Arg殘基的ε-質子共振。
5.在pH6.2時N-末端結構域的構象限制和結構計算的集合對於NOESY交叉峰(crosspeak)的分配，我們使用與結構計算程序DYANA結合的自動化NOE分配軟體CANDID。在hPrP(23-230)中肽片段23-120結構計算法的開始，總共分配有689個NOESY交叉峰，並且整合到在pH6.2記錄的15N-解決的[1H，1H]-NOESY波譜中，其產生322個NOE上限距離限制。顯著地是，總共可鑑定219個NOESY交叉峰為起源於在pH6.2 OPR區域的醯胺氮和質子，而在pH4.5隻觀察到98個這種峰(Liu等人，2002)。這表明在pH6.2的OPR中存在另外的結構區域，其在pH4.5是不穩定的。相比之下，對於OPR外部的殘基沒有鑑定出另外的NOESY交叉峰，表明pH-依賴性的結構形成只限於這個區域。
在15N-解決的[1H，1H]-NOESY內的每個交叉峰都可能是醯胺質子與相同八肽的第二質子或與另一個八肽的一個質子相互作用的結果。為了研究NOESY交叉峰與八肽內和八肽間分配的相容性，我們利用程序CANDID和DYANA進行相應於2個OPR的16-殘基肽(PHGGGWGQ)2的結構計算，其中將相同的化學位移歸因於2個OPR內給定殘基的相應原子。從所得到的80個NOE上限距離限制中，分配11個限制作為包括第一個八肽C-末端Gln的八肽間的7個具有Pro的連續(i，i+1)NOEs、2個具有His的中等距離(i，i+2)NOEs和2個具有Trp的長距離(i，i+5)NOEs。
為了進一步改善OPR的結構計算，我們研究了在單個八肽內具有多種可能分配的NOESY交叉峰的相容性。我們利用相同的峰列表作為輸入進行一系列的CANDID/DYANA結構計算，只是除了化學位移列表內的胺基酸序列關於標準的OPR序列PHGGGWGQ而變化(圖1)。表1的結果表明所有的8個結構計算集中於接近1的殘餘DYANA指標函數值。
表1用CANDID和DYANA的NOE分配後計算的OPR特徵a
表1的說明a通過在第60-91位殘基的OPR區域內從不同的序列位置開始產生8個不同的變體八肽序列(圖1)。2個、3個和4個OPR的片段的DYANA計算的輸入是由序列列於第一欄的單個OPR的CANDID/DYANA輸出的第7個循環變化而來的。從100個隨機化的結構開始每個計算。
b每個OPR輸入中NOE上限距離限制的數目。
c殘餘的DYANA指標函數值(2)。對於用於表示結構的一組20個構象異構體給出平均值±標準差。
然而，當利用相同距離限制但對於包含2個、3個或4個連續OPR的肽重複DYANA計算時，所得到的結構集中於不同的指標函數值。只有那些具有重複序列元件HGGGWGQP(表1)的肽獲得了恆定的小的殘餘限制破壞，表明這些結構大部分是與實驗性的限制一致的，因此比其它7個八肽序列的結構在空間上是更有利的。
進一步用程序OPALp對20個最好的DYANA構象異構體進行了能量改進，所述構象異構體用於表示8-殘基肽HGGGWGQP和24-殘基肽(HGGGWGQP)3的NMR結構，所述24-殘基肽相應於hPrP(23-230)的第61至84位殘基(圖1)。表2給出了結構計算結果的概覽。
表2代表HGGGWGQP和(HGGGWGQP)3的NMR結構的20能量-改進的DYANA構象異構體的表徵
表2的說明1給出了對於具有最低DYANA指標函數值的20能量-最小化構象異構體的平均值±標準差。輸入由分別對於HGGGWGQP和(HGGGWGQP)3為98和294NOE的上限距離限制組成。
2在能量最小化前。
3相對於平均配位的RMSD值。
表2表明HGGGWGQP的20個構象異構體組中總的RMSD值代表了高質量的結構測定(圖4A)，而(HGGGWGQP)3的NMR結構說明得較不準確，這是由於連接OPR的長距離NOEs的遺漏分配(missingassignment)。
圖4顯示八肽重複結構的立體視圖。(A)代表為了HGGGWGQP的N、Cα和C』原子的最佳配合而添加的20能量改進的DYANA構象異構體的所有重原子。主鏈是灰色的，側鏈以不同的顏色顯示Trp(黃色)、His(青色)、Gln(粉紅色)和Pro(橙色)。(B)(HGGGWGQP)3的空間充滿模型。編號相應於人朊病毒蛋白序列中的第61至84位殘基(圖1)。使用如(A)中的相同顏色代碼。(C)比較HGGGWGQP的NMR結構和HGGGW-Cu2+的X射線結構(Burns等人，2002)。由五肽片段HGGGW(RMSD 1.3)的主鏈重原子的最佳配合重疊產生的2個分子的相對定向。NMR結構的主鏈和側鏈重原子是綠色的。在X射線結構中，氧、氮、碳和氫原子分別以紅色、藍色、灰色和白色顯示。五肽和有序的水分子之間的氫鍵表示為白色虛線。通過青色的球形顯示銅離子的位置(為了例證性的目的，銅半徑不是按比例來反映真實的原子半徑的)。紅色和藍色線分別表明銅和肽氧和氮原子之間的銅配位位點。
6.八肽重複(HGGGWGQP)和(HGGGWGQP)3的NMR結構HGGGWGQP的NMR結構與相應的(HGGGWGQP)3中的OPR具有相同的球狀摺疊，在HGGGWGQP平均結構中主鏈重原子和相應於hPrP(23-230)的第61-68位殘基的(HGGGWGQP)3N-末端八肽之間的RMSD值為0.32。片段HGGGW和GWGQ分別採取環構象和β-轉角結構，其中通過dNN和dαN的NOE連通性的連續模式以及Trp和Gln之間dα N(i，i+2)NOE的連通性來加強β-轉角。在(HGGGWGQP)3中，排列八肽以形成三角形的球狀結構域(圖4B)。通過重複組的氫鍵穩定這個分子結構3個OPR中的每一個包含3個八肽內的氫鍵His(i)HN-O』Gln(i+6)，Gly(i+2)HN-Nε2His(i)和Trp(i+3)Hε-O』Gly(i)。通過類型Gly(i+2)HN-O』Pro(i)的2個氫鍵穩定3個OPR之間的聯繫。Gln(i)-Pro(i+1)的肽鍵是反式構象。所有的側鏈原子大多是暴露於溶劑的，包括Trp的疏水性側鏈(圖4B)。因此從OPR的三維結構看來似乎暴露於溶劑的疏水性殘基的對稱分布對PrP聚集很重要。
7.hPrP(23-230)在pH6.2的主鏈動力學OPR內在pH6.2的三級結構相互作用的形成與可通過測量異核的15N{1H}-NOEs檢測到的分子內速率過程相關。在前述研究的pH4.5的溶液中(Zahn等人，2002)，包括hPrP(23-230)的第23-120位殘基的N-末端結構域唯一地顯示負的NOEs，這與顯示球狀構造的結構域的一般值的C-末端結構域形成對照。因此，對於C-末端結構域的主鏈15N-1H部分估計有效的旋轉相關時間，τc，是至少幾個納秒，而N-末端結構域中的15N-1H部分必須是τc＜1ns，正如對於柔性隨機捲曲樣多肽鏈所預期的。相反，在pH6.2，N-末端結構域的包括OPR和OPR側翼的幾個殘基的一些15N-1H部分(圖5)顯示大約0.2的正的15N{1H}-NOEs，表明該多肽區摺疊成為具有某種程度運動性的球狀結構，估計可能是因為它與更多解摺疊的構象處於平衡。
圖5顯示hPrP(23-230)的主鏈運動性。在pH6.2和20℃，90％H2O/10％ D2O中的hPrP(23-230)的0.5mM溶液中測量醯胺基的穩態15N{1H}-NOEs。在從第51至91位的框中，圓形表明由於簡併的化學移動(參見正文)，對於所有的5個重複，模式都是相同的。箭標表明對於Lys23和Lys24的15N{1H}-NOEs低於-1。因為波譜重疊，所以一些15N{1H}-NOEs不能得到定量。
除主鏈醯胺基之外，OPR的Trp吲哚15Nε-1H部分特徵為NOE值接近於零，意味著側鏈可能參與瞬時的三級結構相互作用，與來自結構計算的結果一致。儘管hPrP(23-230)在高於6.2的pH值聚集阻礙了在這些條件下的詳細NMR表徵，但看來似乎在pH7，由於組氨酸去質子化程度的增加，OPR的球狀結構是進一步穩定的。
結果的討論1.八肽重複結構代表了新的結構基序程序DALI(Holm，L.和Sander，C.(1993)Protein-StructureComparison by Alignment of Distance Matrices.Journal ofMolecular Biology 233，123-138)顯示在此描述的HGGGWGQP和(HGGGWGQP)3的結構與任何先前在蛋白資料庫中保藏的結構之間沒有顯著的相似性，表明OPR結構代表了新的結構基序。我們的結構計算結果偏離了先前對合成的OPR肽的結構研究。在pH7.4進行的圓二色性實驗表明OPR採取與聚-L-脯氨酸類型II螺旋具有相似特性的延伸構象(Smith，C.J.，Drake，A.F.，Banfield，B.A.，Bloomberg，G.B.，Palmer，M.S.，Clarke，A.R.和Collinge，J.(1997)Conformational properties of the prion octa-repeat andhydrophobic sequences.Febs Letters 405，378-384)，而最近在pH6.2和6.6之間進行的NMR研究表明片段HGGGW和GWGQ分別採取環構象和β-轉角(Yoshida，H.，Matsushima，N.，Kumaki，Y.，Nakata，M和Hikichi，K.(2000)NMR studies of model peptidesof PHGGGWGQ repeats within the N-terminus of prion proteinsA loop conformation with histidine and tryptophan in closeproximity.Journal of Biochemistry 128，271-281)。雖然我們也觀察到片段GWGQ的轉角樣構象(圖4A)，但我們結構中的環構象是不同的，因為從我們的結構計算不支持His的咪唑側鏈與Trp的芳環的緊密鄰近度。因為關於包括一個或兩個八肽的環化OPR的NMR數據也沒有顯示His和Trp側鏈的緊密鄰近度(Yoshida等人，2000)，所以可能只短暫地形成這種相互作用。
哺乳動物八肽的變體包括序列，例如PHGGSWGQ(小鼠)和PHGGGWSQ(大鼠)或假八肽(pseudooctapeptide)，例如從這些八肽衍生的、具有多於或少於8個胺基酸的假八肽，例如PHGGGGWSQ(各種物種)或PHGGGSNWGQ(有袋類)。非哺乳動物六肽包括序列，例如PHNPGY(雞)或PHNPSY、PHNPGY(龜)或假六肽，例如由這些六肽衍生的具有多於或少於6個胺基酸的假六肽。在此論述的序列應理解為本發明要旨的實例而不是限制。
2.銅在調節pH依賴性的PrP聚集中的可能作用出人意料地是，HGGGWGQP NMR結構中的HGGGW環與最近從在pH7.4生長的晶體確定的存在於銅結合的八肽重複片段HGGGW-Cu2+的晶體結構中的相應殘基具有相似的主鏈摺疊(Burns，C.S.等人(2002)Molecular features of the copper binding sites in theoctarepeat domain of the prion protein.Biochemistry 41，3991-4001)。在HGGGW-Cu2+的結構(圖4C)中，Cu2+是與來自His咪唑的δ1-氮和來自緊鄰的2個Gly殘基的醯胺氮的赤道連接五配位的，其中Gly殘基中的第二個甘氨酸也貢獻其醯胺羰基氧。除His的主鏈氮和Cα外，從His至第三個Gly的氮的所有原子近似位於赤道面中，而銅正好高於該面，與五配位的複合物一致。Trp吲哚也通過與軸向配位的水分子的氫鍵而加入，而穀氨醯胺是具有不參與銅結合的官能團的唯一側鏈。通過其數據，Burns及其同事提出了一個模型，其中，膜結合PrP的2個「金屬夾心」八肽重複內暴露的穀氨醯胺側鏈可能起PrP分子之間的分子間識別相互作用位點的作用，並且因此刺激銅誘導的胞吞作用(Pauly，P.C.和Harris，D.A.(1998)Copper stimulates endocytosis of the prion protein.J Biol Chem273，33107-33110)或便於形成PrPSc。
雖然無銅的HGGGW-環的NMR結構與HGGGW-Cu2+中相應的殘基具有相似的主鏈構象，其中2個五肽的主鏈重原子之間的RMSD值為1.3(圖4C)，但對於在HGGGW-Cu2+結構中參與銅配位的芳族側鏈存在明顯的構象差異。在無銅的HGGGW中，His咪唑向下移位並且偏向HGGGW-Cu2+結構中銅五配位複合物的赤道面，導致His的δ1-氮和Cu2+結合位點之間的距離從1.9增加到3.5。此外，HGGGW中的Trp吲哚繞與穿過配位的氮和Cu2+軸平行的虛軸(virtual axis)翻轉大約180°，因此阻礙了在HGGGW-Cu2+結構中觀察到的Trp的εNH和軸向水分子的氧原子之間氫鍵的形成。
從在此報導和先前公開的結構和生物化學數據的組合(Aronoff-Spencer，E.等人(2000)Identification of the Cu2+binding sitesin the N-terminal domain of the prion protein by EPR and CDspectroscopy.Biochemistry 39，13760-13771；Viles，J.H.，Cohen，F.E.，Prusiner，S.B.，Goodin，D.B.，Wright，P.E.和Dyson，H.J.(1999)Copper binding to the prion proteinstructural implications of four identical cooperative bindingsites.Proc Natl Acad Sci USA 96，2042-2047)，OPR內HGGGW-環的構象看來似乎依賴於pH和銅結合 根據示意圖(1)，在4.7至5.8的pH值，即內體樣區室的pH時，OPR-組氨酸主要是質子化的因此，OPR是柔性無序的並且只以低親和力和協同性結合銅。在6.5至7.8的pH值，即在細胞膜的pH時，OPR-組氨酸主要是去質子化的，因此穩定促進聚集的HGGGW-環構象，並且如果存在Cu2+，其將整合進入銅結合位點。通過HGGGW的銅配位作用導致輕微的但是重要的構象變化，其可能導致PrP聚集體中的結構改變。因此銅的功能可以是pH依賴性的PrP聚集的調節劑，儘管仍然有待顯示Cu2+的結合是否與OPR逆聚集成為二聚或寡聚蛋白聚集體相容。
現有技術中還不知道PrPC形成大的蛋白聚集體。此外，新近發現PrPC的聚集依賴於流體環境的pH。此外，先前還不知道OPR決定著PrPC的pH依賴性的聚集，以及構象變化涉及該OPR聚集的pH依賴性。目前的資料庫缺乏與圖4中報導的相似的三維結構。寡聚化反應依賴於流體環境的pH，並且當單價或二價陽離子，例如Hg2+、Ni2+、Sn2+或Cu2+離子不存在時，也發生寡聚化。
3.pH-依賴性的聚集對PrPC生理功能的意義假定與重組的hPrP相比，天然的PrPC在體內的表現類似，那麼其聚集狀態可能也主要依賴於環境的pH。因此包含His的OPR可起pH依賴性的聚集位點的作用，其在突觸前膜表面的脂類筏濃縮大量的PrPC分子。44nm直徑的脂類筏將為直徑為5nm的大約80個PrPC分子提供足夠的表面。因此，銅的生理學作用可以是調節脂類筏內PrPC分子的數目，由此刺激PrPC胞吞進入突觸前小泡，其中由於局部的酸性pH，朊病毒蛋白將解離成單體。該模型可能與Burns及其同事的建議(Burns等人，2002)相一致，只是除了銅發揮調節劑而不是PrPC聚集誘導劑的作用。
備選地，哺乳動物PrPC中的OPR可能起神經元軸突和樹突狀細胞之間的細胞-細胞粘著的胞間接觸位點的作用。最近已經由Lehmann及其同事證明細胞粘著中潛在涉及PrPC(Mange，A.，Milhavet，O.，Umlauf，D.，Harris，D.和Lehmann，S.(2002)PrP-dependent celladhesion in N2a neuroblastoma cells.Febs Letters 514，159-162)。他們表明超表達PrPC的成神經細胞瘤細胞，當與非轉染的細胞相比時顯示增加的聚集特性。在細胞聚集測定期間加入銅螯合劑或陽離子螯合劑沒有顯著的影響，表明PrPC-介導的粘著以不依賴陽離子的方式發生。用針對包括鼠PrP第45-66位殘基的合成肽而產生的多克隆抗體P45-66(Lehmann，S.和Harris，D.A.(1995)A mutantprion protein displays an aberrant membrane association whenexpressed in cultured cells.J Biol Chem 270，24589-24597)處理成神經細胞瘤細胞顯著地抑制細胞聚集。由這些結果推斷，PrPC可能在神經元細胞中起粘著分子作用，其中通過PrPC特異性地跨細胞結合至異源蛋白，例如N-CAM或層粘連蛋白受體前體而介導細胞聚集。然而，根據我們對OPR構成pH-依賴性的聚集位點的發現，看來似乎PrPC也可能參與同源的細胞-細胞識別。這與抗體P45-66的聚集抑制活性一致，抗體P45-66的表位包括包含His的OPR，其決定了pH依賴性的PrP聚集(圖1)。通過在另外的很大程度上非結構化的N-末端結構域中OPR內的聚集位點相互作用的鄰近細胞中2個GPI錨定的PrPC分子的線性組合將容易地跨越20-30nm的突觸間隙距離(Agnati，L.F.，Zoli，M.，Stromberg，I.和Fuxe，K.(1995)Intercellular Communication in the Brain-Wiring Versus VolumeTransmission.Neuroscience 69，711-726)。因此可以相信，朊病毒蛋白與其它的同源細胞粘著分子，例如鈣粘著蛋白相似(Pokutta，S.和Weis，W.I.(2002)The cytoplasmic face of cell contactsites.Current Opinion in Structural Biology 12，255-262)，這對於在早期發育期間確定腦的結構和連通性是至關重要的。此外PrPC可能參與重構突觸的構造以及改變突觸信號的強度，因此其在突觸的結構、功能和適應性中發揮活性的作用。因為PrPC的細胞聚集活性不依賴於銅，所以銅的作用可能是使得PrPC在具有獨立細胞功能的2個寡聚構象之間轉換的陪伴分子，即從不依賴銅的細胞-細胞粘著轉換為銅依賴性的胞吞，反之亦然。
材料和方法1.樣品製備如先前描述的實現未標記形式的或具有統一的15N-標記的hPrP多肽的克隆、表達和純化(Zahn，R.，von Schroetter，C.和Wüthrich，K.(1997)Human prion proteins expressed in Escherichia coliand purified by high-affinity column refolding.FEBS Lett 417，400-404)。利用Ultrafree-15離心過濾器裝置(Millipore)濃縮蛋白溶液。
2.NMR測量和結構計算在裝備有4射頻通道和具有屏蔽的Z-梯度線圈的三重共振探針頭的Bruker DRX500、DRX750和DRX800分光計上，用在90％ H2O/10％D2O或99.9％ D2O中的1mM蛋白溶液的未標記或15N-標記的樣品在20℃進行NMR測量。對於構象限制的收集，在800MHz記錄了在H2O中的三維15N-解決的[1H，1H]-NOESY波譜，其混合時間τm＝100ms，在T＝20℃，207(t1)×39(t2)×1024(t3)複合點，t1，cax(1H)＝23.0ms，t2，max(15N)＝21.4ms，t3，max(1H)＝114ms，且將該數據組補零至512×128×2048點。用程序PROSA進行波譜的處理(Güntert，P.，Dotsch，V.，Wider，G.和Wüthrich，K.(1992)Processing of MultidimensionalNmr Data with the New Software Prosa.Journal of BiomolecularNmr 2，619-629)。相對於2，2-二甲基-2-矽戊烷(silapentane)-5-磺酸鈉鹽校準1H和15N的化學位移。
利用3s的質子飽和時間段，通過應用5ms時間間隔中120-度脈衝的級聯，按照Farrow等人(Farrow，N.A.，Zhang，O.W.，Formankay，J.D.和Kay，L.E.(1994)A HeteronuclearCorrelation Experiment for Simultaneous Determination of N-15 Longitudinal Decay and Chemical-Exchange Rates of Systemsin Slow Equilibrium.Journal of Biomolecular Nmr 4，727-734)在500MHz測量穩態的15N{1H}-NOEs；t1，max(15N)＝117.4ms，t2，max(1H)＝146.3ms，時域數據大小250(t1)×1024(t2)複合點。
利用與結構計算程序DYANA(Güntert，P.，Mumenthaler，C.和Wüthrich，K.(1997)Torsion angle dynamics for NMR structurecalculation with the new program DYANA.Journal of MolecularBiology 273，283-298)組合的CANDID軟體(Herrmann，T.，Güntert，P.和Wüthrich，K.(2002)Protein NMR structure determinationwith automated NOE assignment using the new software CANDIDand the torsion angle dynamics algorithm DYANA.Journal ofMolecular Biology 319，209-227)獲得NOE分配。CANDID和DYANA進行自動的NOE-分配和NOE強度的距離校準，除去共價固定的距離限制，具有扭轉角動力學的結構計算和自動的NOE距離上限破壞分析。如對於CANDID所輸入的，通過用程序XEASY(Bartels，C.，Xia，T.H.，Billeter，M.，Güntert，P.和Wüthrich，K.(1995)TheProgram Xeasy for Computer-Supported Nmr Spectral-Analysis ofBiological Macromolecules.Journal of Biomolecular Nmr 6，1-10)挑取交互的峰並利用程序SPSCAN(Ralf Glaser，個人通信)自動地積分峰體積生成上述NOESY波譜的峰列表。用CANDID和DYANA進行的計算的輸入包含NOESY峰列表和來自序列特異的共振分配的化學位移列表。計算按照7循環的迭代NOE分配和結構計算的標準方法進行(Herrmann等人，2002)。在最初的6個CANDID循環期間，使用不明確的距離限制。對於最終的結構計算，只保留下述NOE距離限制，其相應於計算的第六個循環後具有明確分配的NOE交叉峰。通過比較距離上限與由第六個CANDID循環產生的結構來鑑定立體有擇的分配。使用程序OPALp(Luginbühl，P.，Güntert，P.，Billeter，M.和Wüthrich，K.(1996)The new program OPAL for moleculardynamics simulations and energy refinements of biologicalmacromolecules.Journal of Biomolecular Nmr 8，136-146)，利用AMBER力場使具有最低的最終DYANA指標函數值的20個構象異構體在水殼體(water shell)中能量最小化。使用程序MOLMOL(Koradi，R.，Billeter，M.和Wüthrich，K.(1996)MOLMOLA program fordisplay and analysis of macromolecular structures.Journal ofMolecular Graphics 14，51-55)來分析所得到的20能量最小化構象異構體(表1和2)並且製備結構的附圖。
3.動態光散射實驗在20℃利用Protein Solutions Ltd.型號801動態光散射儀器(Hertford，英國)進行動態光散射測量。該儀器從散射光強度數據的自相關函數計算樣品池中分子的平移擴散係數DT。利用Stokes-Einstein關係式DT＝kBT/6πηRH，從DT推導散射顆粒的流體動力學半徑RH，其中kB是玻耳茲曼常數，T是開爾文絕對溫度，η是溶劑的粘度。在包含pH4.5的10mM醋酸鈉或pH7.0的10mM磷酸鈉的緩衝溶液中蛋白濃度是4mg/ml。將蛋白溶液過濾通過100nm孔徑的濾器(Whatman，英國)。為了減少氣泡或塵埃的幹擾，利用來自molecular research DYNAMICS的DynaPro動態光散射儀器控制軟體(版本4.0)，每個實驗分析30個數據點。利用球形模型從規則化的直方圖方法計算流體動力學半徑RH，其中根據對已知球狀蛋白校準的標準曲線從該球形模型估計表觀分子量。
權利要求
1.一種多肽的可逆聚集和/或解離的方法，該方法包括提供具有固有聚集能力的多肽，其中流體環境中多肽的寡聚化是以定位於該多肽結構域中的肽重複的存在和結構為基礎的，所述多肽結構域依賴於流體環境的pH而是柔性無序的。
2.權利要求1的方法，其中包括肽重複的柔性無序結構域緊密鄰近於多肽胺基酸序列的N-末端。
3.根據前述權利要求之一的方法，其中通過改變所述流體環境的pH而在該流體環境中進行多肽的可逆寡聚化反應。
4.根據前述權利要求之一的方法，其中在6.2至7.8的pH範圍中進行寡聚化和/或在4.5至5.5的pH範圍中解離成為單體。
5.根據前述權利要求之一的方法，其中每個肽重複具有包括八肽、或假八肽、或六肽或假六肽的序列。
6.權利要求5的方法，其中八肽具有下列胺基酸序列PHGGGWGQ，並且假八肽是從這個序列衍生出來的。
7.權利要求5的方法，其中六肽具有下列胺基酸序列PHNPGY，並且假六肽是從這個序列衍生出來的。
8.根據權利要求1至5中一項的方法，其中每個肽重複包括與C-末端β-轉角結構連接的N-末端環構象。
9.根據權利要求1至5中一項的方法，其中肽重複包括4個相同的八肽。
10.具有固有的可逆聚集和解離能力的工程化多肽或融合蛋白，其中流體環境中多肽的寡聚化是以整合入該多肽結構域的肽重複的存在和結構為基礎的，所述多肽的結構域依賴於流體環境的pH而是柔性無序的。
11.權利要求10的工程化多肽，其中可逆的聚集和解離能力是以流體環境中pH的變化為基礎的。
12.根據權利要求10或11中一項的工程化多肽，其中每個肽重複具有包括八肽、和/或假八肽、和/或六肽/和/或假六肽的序列。
13.權利要求12的工程化多肽，其中八肽具有胺基酸序列PHGGGWGQ；六肽具有胺基酸序列PHNPGY，並且假八肽或假六肽是從這些序列衍生出來的。
14.根據權利要求10或11中一項的工程化多肽，其中每個肽重複包括與C-末端β-轉角結構連接的N-末端環構象。
15.權利要求10至14中一項所述的工程化多肽的用途，其中將工程化的多肽用於提供和/或應用檢測人或動物朊病毒蛋白的診斷測試。
16.權利要求10至14中一項所述的工程化多肽的用途，其中將工程化的多肽固定至固相。
17.權利要求16所述的工程化多肽的用途，其中將工程化的多肽用於提供和/或應用包括肽重複的融合蛋白和/或天然蛋白的親和純化和/或富集和/或檢測。
18.權利要求10至14中一項所述的工程化多肽的用途，其中將工程化多肽用於特異識別朊病毒蛋白，以提供針對TSE，例如vCJD的預防、藥物或治療和/或其應用。
19.權利要求10至14中一項所述的工程化多肽的用途，其中將工程化多肽用於提供OPR-標記的融合蛋白或多肽來產生選擇性地結合這種多肽聚集體的三維結構的配體。
20.權利要求19所述的工程化多肽的用途，其中將工程化多肽用於提供OPR-標記的融合蛋白或多肽來產生多克隆的、單克隆的和/或工程化的抗體。
21.權利要求10至14中一項所述的工程化多肽的用途，其中將工程化多肽用於提供檢測配體與這種多肽聚集體的三維結構結合的傳感器。
22.權利要求10至14中一項所述的工程化多肽的用途，其中將工程化多肽用於提供OPR-標記的融合蛋白或多肽來用於傳感器技術，包括化學的/或物理學的傳感器晶片。
23.權利要求1至9中一項所述的方法的用途，其中將多肽的可逆聚集和/或解離用於提供和/或應用檢測人或動物的朊病毒蛋白的診斷測試。
24.權利要求1至9中一項所述的方法的用途，其中將多肽的可逆聚集和/或解離用於提供和/或應用包括肽重複的融合蛋白和/或天然蛋白的親和純化和/或富集和/或檢測。
全文摘要
本發明提供多肽的可逆聚集和/或解離的備選方法。本發明所述的蛋白或多肽具有固有的聚集能力，其中聚集是以定位於該多肽的柔性無序結構域中肽重複的存在和結構為基礎的多肽寡聚化。包括肽重複的柔性無序結構域優選緊密鄰近於蛋白胺基酸序列的N－末端。優選地，每一肽重複具有包括1至4個胺基酸序列為PHGGGWGQ的相同八肽的序列。優選的蛋白選自細胞朊病毒蛋白(PrP
文檔編號C07K14/47GK1764840SQ200480007849
公開日2006年4月26日 申請日期2004年3月23日 優先權日2003年3月25日
發明者R·查恩 申請人:瑞士聯邦蘇黎世技術大學