一種具有抗菌功能的融合蛋白及其應用的製作方法
2023-05-17 10:27:11 3
專利名稱：一種具有抗菌功能的融合蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種融合蛋白及其應用，尤其涉及一種用基因工程技術建立的動物抗菌 肽基因載體和通過酵母表達系統獲得的抗菌肽融合蛋白，及其在製備抗菌藥物或具有病 害防治功能的水生生物或養殖畜禽飼料產品中的應用。
背景技術：
抗菌肽是生物體自身產生的，抵抗外界微生物、病毒等病原體侵染，用於肌體非特 異性防禦的免疫物質。其廣泛存在於動物和植物中，具有殺菌活力高、作用迅速、不產 生耐藥性等特點，是多細胞生物免疫防禦的有效手段，在生物的生存與進化過程中發揮 著重要作用。抗菌肽不僅能直接殺滅病原微生物，而且能激活生物體的免疫系統，增加 抵抗外界病原體入侵的能力。迄今為止，已經有包括自較為低等的動物至高等哺乳動物 和人類來源的多種抗菌肽被分離、純化。例如家蠶中的cecropin、 cecatotoxin，鯊、 貝類、被囊動物中的防禦素(defensin)，七鰻魚、比目魚中的pleurocidin，兩棲動 物的鵬gainin和dermas印in,鳥類中的防禦素，哺乳動物中的a -def ensin 、 P -defensin,植物中的thionin、植物防禦素等。已經發現的抗菌肽數目超過800餘種。
海洋生物抗菌肽是機體天然免疫系統的重要組成部分，由於大部分海洋動物的免疫 系統為先天性免疫系統，因而較哺乳動物而言，作為先天性免疫系統成員的抗菌肽對海 洋動物的作用就顯得更為重要。對海洋生物抗菌肽的研究主要集中在一些甲殼類動物， 如鱟、蟹等方面，近年來也有關於蝦、貝類抗菌肽或抗菌肽類似物質的研究報導，表明 海洋生物抗菌肽及其在水產養殖業的應用前景正在受到越來越廣泛的關注。但是對魚類 抗菌肽的研究起步較晚，分離得到的抗菌肽種類有限。
defensin是一類重要的抗菌肽家族，其中h印cidin是e-defensin蛋白家族中的 一員(Verga F， et al' Gene. 2005， 364: 37-44 )。 h印cidin最初是從人的血漿抽濾 液或尿液中分離得到的，經檢測證實它是一種富含半胱氨酸的抗菌蛋白，其抗菌活性已 得到多方的證實(Krause A， et al, FEBS Lett, 2000， 480: 147 — 150; Park C H， et al， J Biol Chem, 2001， 276: 7806 - 7810)。在對其進行抗菌活性研究的同時又發現 H印cidin在鐵代謝中也發揮著作用(Nicolas G， et al， Proc Natl Acad, 2001， 98: 8780 - 8785)。隨後克隆得到了多種h印cidin的同源異構體基因。Shike等從雜交石斑 鱸魚中得到了 h印cidin基因，是首次從魚類中得到的h印cidin基因(Shike H, et al， Eur J Biochem, 2002， 269: 2232 - 2237)。 magainin最初是從蟾蜍的皮膚中分離得到 的，這類抗菌肽具有a螺旋結構，通常是由L型兩性胺基酸組成，對革蘭陰性菌、陽性 菌、都有殺傷作用(Zasloff M, Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:5449-5453; Barrell PJ，et al， Protein Expr Purif， 2004， 33:153-159)。
儘管抗菌肽抗菌功效顯著，應用前景廣闊，但天然抗菌肽的含量很低，無法從生物 體內大量獲取；而化學合成肽價格昂貴，限制了其廣泛應用。目前由於環境汙染的嚴重 致使水產養殖病害頻繁發生，常造成比較大的經濟損失。水產養殖業廣泛和大量使用氯 黴素等抗生素，造成抗生素在水產品中超標累積，給消費者的健康帶來巨大危害。目前 歐盟己經禁止我國抗菌素超標的水產品出口歐盟國家。因此，利用基因工程技術生產基 因工程重組的具有高效殺菌效果的抗菌肽並應用於水產養殖業，以及用於各種畜禽動物 的飼養中，以替代日益受到禁用的抗菌素已經成為我國水產養殖業和畜牧業的必然選 擇。
應用酵母表達系統表達真核生物基因在DNA重組技術中正在得到越來越廣泛的應 用。最先使用的是釀酒酵母系統，迄後具有優良特性的巴斯德畢赤酵母表達系統越來 越受到科學一工業界的重視，並逐漸取代釀酒酵母系統。酵母表達系統具有獨特的生 物學特性，具有嚴格調控外源真核細胞蛋白的表達，加工修飾表達產物，表達量高， 營養要求低等優點。由於抗菌肽直接作用於原核生物細胞膜，抑制其生長以至殺滅菌 體，因此採用真核生物酵母的表達系統幾乎成為生產基因工程重組抗菌肽的唯一選擇。 另外，畢赤酵母表達系統能利用甲醇作為唯一碳源大量合成蛋白質，曾用於工業規模的 單細胞蛋白的生產。以酵母工程菌表達基因工程抗菌肽，能夠大量生產水生生物和動 物飼養所急需的、可以替代抗菌素的動物自身基因表達的抗菌肽，為市場提供無毒無 害、健康的綠色產品。並且對抗菌肽的進一步開發和利用將產生很高的經濟價值和巨 大的社會效益。
發明內容
本發明的目的是提供一種用基因工程技術建立的動物抗菌肽基因載體和通過酵母 表達系統獲得的抗菌肽融合蛋白，及其在製備抗菌藥物或具有病害防治功能的水生生物 或養殖畜禽詞料產品中的應用。
本發明的技術構思是將魚類的抗菌肽和兩棲動物的抗菌肽組成新型的融合蛋白，使 用基因工程的手段構建含融合蛋白cDNA序列的表達載體並整合至酵母基因組進行表達。 其表達產物可以應用於水生生物或畜禽動物養殖中；也可以通過純化或濃縮的方法，得 到高純度的融合蛋白，直接作為抗生素的替代品用於生物的病害防治，細菌性甚至病毒 性疾病的治療。
本發明的具有抗菌功能的融合蛋白由經過修飾的魚類抗菌肽h印cidin和兩棲動物 抗菌肽magainin組成，其特徵在於所述融合蛋白是含有SEQ ID N0: 1所示胺基酸序 列的短肽。
上述融合蛋白的基因由編碼魚類h印cidinl precursor成熟肽的cDNA序列、編碼 兩棲動物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列、限制性內切酶EcroR I位點的cDNA序列 以及符合真核生物表達偏好性的基因序列組成，其特徵在於所述融合蛋白基因的核苷 酸序列是SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
本發明所述的融合蛋白在製備在製備抗菌藥物中的應用。
本發明所述的融合蛋白在製備具有病害防治功能的水生生物或養殖畜禽飼料中的 應用。
其中所述融合蛋白直接作為免疫添加劑添加到水生生物或畜禽詞料中，或經純化 後作為病害防治藥物直接使用或作為飼料添加劑使用。
本發明所述融合蛋白的酵母表達系統，其特徵在於，含有外源融合蛋白cDNA的酵 母細胞內表達載體PA0815或其它類型的酵母表達載體，以及利用載體使融合蛋白基因 在畢赤酵母、釀酒酵母、假絲酵母或其它可食性酵母中進行細胞內或細胞外表達。它的
步驟為
表達載體的構建人工合成的抗菌融合蛋白CDNA序列上設計有限制性內切酶的酶 切位點，融合蛋白cDNA序列和Invitrogen公司的酵母細胞內表達質粒pA0815酶切後 連結在一起，通過PCR反應檢測融合蛋白基因插入的方向，篩選出含有正向插入的融合 蛋白基因的克隆。
酵母表達系統的構建使用限制性內切酶酶切酵母表達質粒，使其線性化，通過電 擊轉化的方法，將融合蛋白cDNA序列整合到酵母的基因組中。將轉化後的菌體懸液塗 布於MD平板上，30。C培養，誘導篩選直至單個菌落出現。挑取單菌落，將其作為模板， 通過PCR反應確認陽性克隆。
融合蛋白的細胞內或細胞外誘導表達及活性檢測。
表達產物抗菌活性的檢測方法如下
挑選陽性克隆菌落，於3(TC培養，收集菌體，用含有甲醇的培養基重懸菌體，使外 源基因能夠被誘導表達。如使用細胞內表達載體，收集菌體，破碎細胞後取得蛋白粗提 液。如使用細胞外表達載體，收集細胞培養液後通過硫酸銨沉澱、離子交換層析和凝膠 層析純化，通過聚丙烯醯銨凝膠電泳分離得到電泳純的融合蛋白。
通過在培養皿上塗布融合蛋白粗提液並同時接種大腸桿菌、鰻弧菌、溶藻弧菌等種 類致病菌，進行抑菌圈實驗，或是通過在上述致病菌培養液中添加融合蛋白粗提液，檢 測A600吸光值來檢測其抗菌活性。
本發明的融合蛋白經檢測具有明顯的抗菌活性，可以用於水生生物、養殖動物對抗 生素有耐藥性的細菌性疾病的防治，或者將純化的融合蛋白直接作為藥品，用於對細菌 甚至病毒所引起的疾病的治療。
本發明的有益效果是
(1) 應用基因工程技術可以大量生產新型的水生生物和養殖動物的抗菌肽。
(2) 解決靜她長其鵬的病害危害,J^品及禽驢口口oiM^辯鵬示的問題。
(3) 用高技術帶動養殖業以及養殖餌料工業的行業技術進步。
(4) 向社會衛繊泰白WfeK^品和禽熟口口。
圖1. 魚類h印cidinl precursor基因的克隆。圖2.表達融合蛋白cDNA的載體pA0815 — antibac質粒。
圖3. pA0815-antibac陽性克隆的檢測。
圖4.畢赤酵母表達系統表達的抗菌融合蛋白對大腸桿菌的抑菌效果。 圖5.畢赤酵母表達系統表達的抗菌融合蛋白對鰻弧菌的抑菌效果。 圖6.畢赤酵母表達系統表達的抗菌融合蛋白對溶藻弧菌的抑菌效果。
其中圖4 6中1X、2X、3X為不同濃度的抗菌融合蛋白表達系統蛋白粗體液，
0為對照(表達f3-Gal的酵母表達系統蛋白粗體液)。
具體實施例方式
下面以實施例並結合附圖對本發明內容做進一步說明
1.魚類肝臟cDNA的製備大鯪鮃注射鰻弧菌感染24h後，取出肝臟，迅速放於液 氮中，將硬的組織塊置於一80。C冷凍保藏。參照TRIZOLS試劑操作說明，取冷凍保藏的
組織約100mg，加入到lml TRIZ0L試劑中，置室溫下勻化5分鐘之後，加入200W氯仿 劇烈振蕩15秒，室溫下溫育3min。 4'C條件下以12， 600rpm轉速離心15 min。獲取界 面上層液體加入25014以0.腦乙酸鈉和1. 2M氯化鈉組成的高濃度鹽溶液，混勻後再加 入250rt異丙醇混勻，於室溫下沉澱10min，再在4'C以12, 600rpm轉速離心10 min。 移去上清後用lml 70%乙醇漂洗沉澱，以11，000rpm轉速4。C離心5 min。以20WDEPC 處理過的雙蒸水(無RNase) 55。C溶解RNA沉澱10 min後，取2. Oug總RNA，加入 50pM的隨機引物，以DEPC水稀釋至17. U4。 70°C 5 min破壞RNA 二級結構後置冰上驟 冷。依次加入5^1 M-MLV 5X轉錄緩衝液，1. IO固dNTP， 24U rRNA酶抑制劑和200U M-MLV逆轉錄酶。於42。C反應lh後在94。C維持5 min終止反應，於4。C保藏。
2. 魚類抗菌肽h印cidinl precursor基因的克隆和序列分析以大菱鮃肝臟cDNA 為模板，使用引物 W朋sp ( 5—-CAAACCCTCCTAAGATGAAG-3' )， WBHap
(5—-AATCCTCAGAACCTACAGCA-3')進行PCR反應。反應退火溫度為52°C, 30個循環得 到大約300bp的PCR條帶(見圖l)。得到的PCR產物使用凝膠電泳試劑盒回收，經測 序證實，該序列全長293bp，包括完整的編碼區，其中開放閱讀框長273bp，編碼90個 胺基酸，詳見GenBank序列號AM113708。。通過NCBI的Blastn伺服器對核酸序列進 行同源相似性比對。同源相似性較高的序列多為H印cidin家族的基因序列，其中與牙鮃 的同源相似性為90%[ /^e〃t/oscj'ae朋 crocea(DQ307050)]，與白鱸的同源相似性為84 % [yfforw e c力/ysoA (AF394246)]，與黑鯛的同源相似性為83% [/)ca/ t力o/)艱r〃s sc/^e^^h'(AY669380)]。確定該序列為大菱鮃h印cidinl precursor基因。使用signalP 月艮務器予頁測hepcidinl precursor蛋白序列的iW號月太區土或，hepcidinl precursor蛋白 序列中C端24個胺基酸為信號肽。使用軟體0miga2. 0預測h印cidinl precursor蛋白 序列的二級結構，h印cidinl precursor的蛋白序列中N端21個胺基酸為{3 -摺疊結構， 而這部分序列包含八個半胱氨酸。H印cidin蛋白家族成熟肽的最顯著的特徵就是由這八 個半胱氨酸形成的P-摺疊結構，這符合h印cidin蛋白家族的特徵。比較鱸魚、斑馬魚 H印cidin成熟肽，從而得出大菱鉀h印cidinl precursor的成熟肽具有21個胺基酸。
3. 融合蛋白cDNA的的設計與製備融合蛋白cDNA序列由編碼魚類h印cidinl precursor成熟肽的基因序列、編碼兩棲動物抗菌肽Magainin成熟肽的基因序列、限制 性內切酶EcroR I位點的序列以及符合真核生物表達偏好性，同時符合Kozak規則的基 因序列組成。進行基因工程修飾的位點描述如下(l)第4位的偏好鹼基為G; (2)ATG 的5'端約15bp範圍的側翼序列內不含鹼基T; (3)在-3， -6和-9位置，G是偏好鹼基； (4)除-3， -6和-9位，在整個側翼序列區，C是偏好鹼基。所以融合蛋白基因序列編碼 的蛋白序列是由h印cidinl precursor和Magainin的兩段成熟肽序列經基因工程方法 優化設計修飾組成。使用固相亞磷酸醯胺法人工合成這段基因序列，序列長151bp (見 SEQIDN0: 2所示的核苷酸序列)，編碼39個胺基酸，後續構建的酵母表達系統所表達 的蛋白就是這個含有39個胺基酸的短肽(見SEQ ID NO: l所示胺基酸序列)。
4. 酵母表達系統pA0815-antibac載體的構建人工合成的抗菌融合蛋白基因序列 上設計有限制性內切酶EcroR I的酶切位點，酵母細胞內表達質粒載體pA0815同樣具有 EcroRl的單酶切位點，融合蛋白基因和pA0815質粒酶切後具有同樣的粘性末端。使用 EcroR I分別酶切融合蛋白基因和pA0815質粒，使用凝膠電泳回收試劑盒分別回收酶切 後的產物。使用DNA Ligation Kit試劑盒進行連接，取融合蛋白基因加入pA0815載體2W連接緩衝液2. 5W、連接酶4.5W， 16匸連接過夜。使其連結在一起，並導入 到大腸桿菌DH5a中。使用引物HMsp (5—-GGACAGCCACATCTCCCTTT-3')和HMap (5、-GTGCGAATTCTCAGAACTTC-3—)，以轉化後大腸桿菌DH5 a菌懸液為模板，進行PCR反應， 退火溫度53'C，進行30個循環。連接產物檢測融合蛋白基因插入的方向。如果融合蛋 白基因正向插入到質粒pA0815中則會出現大約130bp的PCR條帶，如果融合蛋白基因 反向插入則不會出現PCR條帶。篩選出含有正向插入的融合蛋白基因的克隆。將得到的 表達載體命名為pA0815-antibac質粒(圖2)。將該質粒導入到大腸桿菌中，使其形成 多克隆。製備pA0815-antibac質粒，使用限制性內切酶Sal I酶切質粒，使其線性化。 將約20Pg的線性化pA0815-antibac質粒溶液與80Ml的GS115感受態細胞混勻，轉至 0.2ml冰預冷的電轉化杯中。將電轉化杯冰浴5min後使用電轉化儀進行轉化。條件為 電壓1. 5kV，電擊10msec，使外源基因整合到酵母GS115的基因組中。轉化後將菌體加 入lml冰預冷的lmol山梨醇溶液混勻，轉至1. 5ml的EP管中。轉化後的菌體懸液隨後 均勻塗布於MD平板上於3(TC培養，直至單個菌落出現。挑取單菌落，將其作為模板， 使 用 引 物 5—A0X (5、-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3—) 和 3—AOX (5、-GCAAATGGCCATTCTGACATCC-3')，通過PCR反應篩選具有pA0815-antibac的陽性克 隆。整合融合蛋白cDNA序列的陽性克隆出現600bp左右的PCR條帶(圖3)。挑選含 pA0815-antibac的菌落，置於裝有25ml剛GY培養基的搖瓶中，於3(TC培養至菌液的 0D6。。 = 2. 0。收集菌體，用歷MY重懸菌體，使0D6 。 =1. 0左右。所得的菌液置於1L的 搖瓶中，放置於3(TC培養，每24h向培養基中添加無水甲醇至終濃度為0. 5%培養至0D6 。 =3.0。收集菌體，破碎細胞後取得蛋白粗提液，其中富含融合蛋白。
也可以將蛋白粗提液用梯度硫酸銨沉澱，然後將沉澱收集溶於磷酸緩衝液後，分別 經離子交換層析和凝膠層析處理，得到電泳純的融合蛋白。
同時，以同樣條件下培養的，可以表達P-Gal的酵母表達系統蛋白粗體液作為對照。
5. 抑菌試驗在塗布有大腸桿菌、鰻弧菌或溶藻弧菌的平板培養皿上滴加不同濃度 的酵母蛋白粗提液或經過純化的融合蛋白。將培養皿至於37'C過夜培養，次日觀察並記 錄抑菌效果。
上述富含融合蛋白的粗提液和經過純化的融合蛋白，均表現有抗菌活性(結果見圖 4 6)。
6. 融合蛋白在製備抗菌藥物中的應用將含融合蛋白分泌型表達載體的酵母，經 常規培養後收集培養液，再經常規沉澱、離心、脫鹽、層析等步驟得到獸藥級的融合蛋 白；或在融合蛋白序列兩端添加組氨酸cDM序列等標籤，使用親和層析獲得更高純度
的融合蛋白。
獲得的融合蛋白可直接作為抗菌藥物，以常規用藥量應用於水生生物或其它養殖禽 畜疾病的防治。
7. 融合蛋白在製備具有病害防治功能的水生生物或養殖畜禽飼料中的應用由於
酵母含有豐富的蛋白質、維生素及其它營養物質，因此含胞內表達型載體的酵母可以作 為飼料添加劑。按照設定比例將含胞內表達型載體的酵母添加到水生生物或養殖畜禽飼 料中，在為水生生物或養殖畜禽提供營養物質的同時，提高其病害防禦能力。
如應用上述方法，使用100L發酵罐，於3(TC下擴大培養基因組中包含有SEQ ID N0:
2所示核苷酸序列的畢赤酵母GS115，通過發酵液中添加0. 5%甲醇誘導抗菌融合蛋白基 因的表達，經3_5天培養，經過濾後，得到大量具有表達抗菌活性融合蛋白的GS115 酵母，所述酵母菌數不少於5X104cfu/g，含水量《10%。
以常規方式選擇玉米粉、糠、麩皮、豆餅、魚粉、骨粉為水生生物或養殖畜禽的基 礎飼料，將上述獲得的酵母菌作為飼料添加劑，直接添加於上述水生生物或養殖畜禽的 基礎飼料中混合，所述飼料添加劑添加比例量為基礎詞料重量的20% (可相應減少魚粉 或其它蛋白質飼料的用量)，使混有添加劑的基礎飼料的最終營養成分中粗蛋白>35%、 粗脂肪》3%、粗纖維》3%、粗灰分》15%、鈣》2%、磷》1%、賴氨酸》1.8%，製得 具有病害防治功能的水生生物或養殖畜禽飼料。
或者，以基礎伺料重量5% 25%的添加比例量直接將上述所得發酵全液用於畜禽和 水產養殖生物的餵養。
進一步的，以上述方法將含融合蛋白分泌型表達載體的酵母，經常規培養後收集培 養液，再經常規沉澱、離心、脫鹽、層析等步驟得到獸藥級的含有SEQ ID NO: 1所示 胺基酸序列的融合蛋白。
以常規方式選擇玉米粉、糠、麩皮、豆餅、魚粉、骨粉為水生生物或養殖畜禽的基 礎飼料，將上述獲得的融合蛋白作為飼料添加劑，直接添加於上述水生生物或養殖畜禽 的基礎飼料中混合，所述詞料添加劑添加比例量為基礎飼料重量的10%，使混有添加劑 的基礎飼料的最終營養成分中粗蛋白>35%、粗脂肪》3%、粗纖維》3%、粗灰分》15 %、鈣》2%、磷》1%、賴氨酸》1.8%，製得具有病害防治功能的水生生物或養殖畜禽 飼料。
序列表
〈110〉國家海洋局第一海洋研究所
—種具有抗菌功能的融合蛋白及其應用
〈141〉2007-9-11
<160〉2
<210〉1
39
〈212>PRT
<213〉人工序列
1
Met Asp Ser His lie Ser Leu Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys 5 10 15
Lys Ala Tyr Lys Gly Cys Gly Phe Cys Cys Arg Phe Gly lie Gly 20 25 30
Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe 35
<210〉2
〈211>151
<212〉cDNA
<213〉魚類h印cidinl precursor成熟肽的cDNA序列&編碼兩棲動物抗菌肽magainin成
熟肽的cDNA序列
<400〉2
ccctcgaatt cgccgccacc atggacagcc acatctccct ttgccgctgg tgctgcaact 60 gctgcaaggc ctacaagggc tgtggcttct gctgtaggtt cggcattggc aagttcctgc 120 actctgccaa gaagttctga gaattcgcac c 15權利要求
1.一種具有抗菌功能的融合蛋白，由經過修飾的魚類抗菌肽hepcidin和兩棲動物抗菌肽magainin組成，其特徵在於所述融合蛋白是含有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的短肽。
2. 權利要求1所述融合蛋白的基因，由編碼魚類h叩cidinl precursor成熟肽的cDNA 序列、編碼兩棲動物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列、限制性內切酶EcroR I位點 的cDNA序列以及符合真核生物表達偏好性的基因序列組成，其特徵在於所述融合蛋 白基因的核苷酸序列是SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
3. 權利要求1所述融合蛋白在製備抗菌藥物中的應用。
4. 權利要求1所述融合蛋白在製備具有病害防治功能的水生生物或養殖畜禽飼料中 的應用。
5. 如權利要求4所述的應用，其特徵在於所述融合蛋白直接作為免疫添加劑添加 到水生生物或畜禽飼料中，或經純化後作為抗菌藥物直接使用或作為飼料添加劑使用。
全文摘要
本發明公開了一種具有抗菌功能的融合蛋白及其應用。所述融合蛋白基因序列組成為克隆得到的hepcidinl precursor抗菌肽基因和人工合成的magainin抗菌肽基因，通過基因工程手段將二者組成為新型的融合蛋白cDNA並整合在酵母的基因組上，通過誘導使融合蛋白cDNA在酵母表達，進而通過酵母發酵培養獲得大量的融合蛋白。本發明的融合蛋白經檢測具有明顯的抗菌活性，可以用於水生生物、養殖動物的細菌性疾病的防治，或者將純化的融合蛋白直接作為藥品，替代抗生素用於對細菌甚至病毒所引起的疾病的治療。
文檔編號C07K19/00GK101182360SQ20071011386
公開日2008年5月21日 申請日期2007年10月8日 優先權日2007年10月8日
發明者叢柏林, 劉晨臨, 劉勝浩, 林學政, 黃曉航 申請人:國家海洋局第一海洋研究所