聚丙基醚亞胺的糖樹狀聚體的製作方法

2023-05-17 05:37:56 2

專利名稱：聚丙基醚亞胺的糖樹狀聚體的製作方法
聚丙基醚亞胺的糖樹狀聚體本申請要求2010年8月24日提交的美國臨時申請US61/344，571和2011年6月2日提交的英國申請號GB1109292.1的優先權，將這兩篇文獻的內容引入本文參考。本說明書涉及包含聚丙基醚亞胺芯的糖樹狀聚體(glycodendrimer)、包含它們的藥物製劑及其在治療、特別是治療促炎細胞因子例如白細胞介素-6和白細胞介素-8介導的病症中的應用。本說明書還涉及糖樹狀聚體的生產方法和聚丙基醚亞胺芯在製備所述糖樹狀聚體中的應用。背景在2009年，Park等人定義了通過TLR4-MD2識別LPS的結構基礎(Park BS, SongDHj Kim HMj Choi BSj Lee H，Lee J0.The structural basis of lipopolysacchariderecognition by the TLR4-MD-2complex.Nature2009 ；458:1191 - 1195 ；ViriyakosolS，Tobias PS，Kitchens RL，Kirkland TN.MD2binds to bacterial lipopolysaccharide.J.Biological Chemistry2001 ；276 (41):38，044-38，051)。簡言之，MD2具有配有帶電荷的親水性入口的疏水性袋。脂質A(由兩個彼此通過酯鍵連接的磷酸化葡糖胺分子組成)結合這種袋的入口。其脂質鏈然後進入MD2的疏水性袋。TLR4-MD2-LPS複合物進行構象改變且TLR4 二聚化。隨後發生胞內信號傳導。近來強化了 LPS的糖部分和L PS與MD2之間的靜電相互作用的重要性(Meng J等人，MD2residues TYR42, ARG69, ASP122and LEU125provide species specificity forLipid IVA.J Biol Chem.DO1:Ml10.134668 ；Meng J, Lien E,Golenbock DT.MD2mediatedionic interactions between Lipid A和 TLR4are essential for receptor activation.J Biol Chem.2009 ；285:8695-8702)。認為最相關的殘基是Tyrl02,然後是Lys91、Arg96、Argl06、Asnl 14和Serll8。已經將這些殘基和/或其極為親近性的殘基鑑定為在MD2識別LPS中具有重要作用(Park BS, Song DH, Kim HM, Choi BS, Lee H, Lee J0.The structural basis oflipopolysaccharide recognition by the TLR4_MD2complex.Nature2009 ;458:1191 -1195 ；Meng J 等人，MD2residues TYR42, ARG69, ASP122 和 LEU125provide speciesspecificity for Lipid IVA.J Biol Chem.DO1:Ml10.134668 ；Meng J, Lien E, GolenbockDT.MD2mediated ionic interactions between Lipid A&TLR4are essential forreceptor activation.J Biol Chem.2009 ;285:8695-2)。細菌感染和手術組織損傷引起基於TLR4免疫-調節的相同細胞表面受體-配體相互作用。這並不涉及單一受體-配體相互作用。而這些促炎細胞因子應答由細菌來源的脂多糖(LPS)和/或手術衍生的透明質酸片段與細胞表面TLR4受體之間的多價受體-配體相互作用介導(Atala A, Irvine DJ, Moses M, Shaunak S.Wound healing versusregeneration:Role of the tissue environment in regenerative medicine.MRSBulletin August2010; 35:597 - 606)。這些配體對這種受體的結合親和力在受體-配體相互作用數量增加時呈指數地增加。因此，期望通過製成可以調節組織損傷途徑的新生物材料使多價的概念適合於新的生物材料設計。
當多價需要多個和協作性受體-配體相互作用時,藥物介入也需要基於也能夠進行多個和協作性相互作用的分子的新的藥物。這一目的已經使用基於蛋白質的藥物實現，所述基於蛋白質的藥物以高度親和力與多個細胞表面受體發生相互作用。多年來，目的在於實現與合成大分子的類似的協同性相互作用。然而，已經發現，在生物系統中，應用線型聚合物的成功率遠低於預期。使用線型聚合物的嘗試受到如下情況的阻礙:-(1)所用大分子的結構不均勻性；(2)不能控制其大小和分子量特徵；和(3)活化補體和凝固觸發的途徑的毒性副作用。此外，就展示出糖的線型聚合物而言，它們具有自我締合和形成膠束的趨勢，原因在於許多聚合物-糖組合的兩親特徵。就多糖而言，其結構不均勻性和涉及其製備的化學複雜性阻礙了具有適合 的生物特性的所定義的寡糖-類分子的製備規模可伸縮性和可再現的合成。一般而言，需要許多合成步驟且化學中間體和產物的極性使得它們難以純化。這些化合物也難以操控，因為它們傾向於變成吸溼性糖漿狀物，在化學上不穩定，傾向於快速微生物降解和難以加工成藥物。這些基礎問題已經阻礙了基於糖的大分子在藥物應用中的規模化製備。W003/089010公開了基於PAMAM芯的一些糖樹狀聚體。已經廣泛研究了與葡糖胺或硫酸葡糖胺共軛以形成3.5代樹狀聚體(dendrimer)的第3代PAMAM樹狀聚體。已經顯示這些分子具有極為有意義的生物活性和低毒性，且特別是具有顯著的抗-細胞因子和抗-趨化因子特性。然而，迄今為止，尚未將這些化合物作為藥物產品提出且始終沒有對人體給藥，因為尚無鑑定為可商業化和有活力地將它們製成適合於對人體給藥的「純度」水平的方式。眾多所謂的「不純物」是與期望的種類極為密切相關的種類，因此，分離不同的本體極為困難且使用目前可得到的基於色譜和/或過濾的技術是不可能的。儘管不希望受到理論約束，但是目前本發明的發明人認為基於PAMAM糖樹狀聚體的化學自身與提供適合於藥物應用的分子不相容。然而，PAMAM糖樹狀聚體因其生物活性而是特殊的分子。儘管存在可以製備樹狀聚體的許多芯，但是似乎由幾種可選的芯製成的糖樹狀聚體不具有必需的生物學特性。本發明的發明人認為，令人意外地，本文所述的糖樹狀聚體可以提供適合的生物特性，從而使得它們適合於藥物介入，另外，基於本發明分子的化學適合於提供一種分子，其最終可以用作藥物產品。發明概述因此，提供了糖樹狀聚體，其包含:a)以平均9 - 64個末端羧酸基團支持的無毒性樹狀聚體聚丙基醚亞胺芯；和b)與所述芯共軛的2 - 8個氨基糖或硫酸氨基糖，其選自葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、甘露糖胺、N-乙醯甘露糖胺、半乳糖胺、它們的任意一種的硫酸鹽及其組合，其中每個糖直接通過O長度的醯胺鍵與末端羧酸基團的殘基連接。發明詳述樹狀聚體是一類聚合物化合物，其不同於常規的線型聚合物的方面在於其高度分支的、環狀和對稱結構體系。第一種樹狀聚體通過分支合成方法由Vfigtle在1978年、Allied Corporation的 Denkewalter 在 1981 年、Dow Chemical 的 Donald Tomalia 在 1983 年和在 1985 年及Newkome在1985年製成。在1990年，Jean Fr6chet引入了匯聚合成方法。樹狀聚體的普及性隨後顯著增加，截止到2005年產生了超過5，000篇的科學論文和專利(Hourani R等人.Advances in elegance of chemistry in designing dendrimers.Macromol.RapidCommun.2010;31:947-74)。分支合成是主要的，其中分子從中心向外以層疊加。所謂的代實際上是指生產樹狀聚體的合成中的疊層步驟數量。因此，在分支方法中，樹狀聚體從芯向外生長，典型地存在具有每種新「代」的反應官能團的數量倍增。然而，對術語「代」需要謹慎地加以採用，因為不同的原料需要不同的合成技術，這可能意味著在一些方式中，由一種原料製成的某些「代」的樹狀聚體可能不一 定直接與由不同原料製備的樹狀聚體比擬，不過，名義上它們以相同的代數給出。術語「代」並不等同於樹狀聚體的絕對物理尺寸。相反，匯聚合成在於其中分子以碎片構成並且在合成的最後步驟或後期階段時組裝。因此，匯聚生長方法包括將具有碳水化合物的樹狀楔形物合成為結構成分之一，然後使這些楔形物連接提供分支的其他成分，然後最終使這些樹型單元(dendrons)連接芯成分，得到期望的樹狀聚體。採用這種匯聚合成方案典型地得到較大量的在樹狀聚體表面上展示的糖，特別是可以導致在組裝最終的樹狀聚體時在樹狀聚體上完全糖封端。並不將以匯聚方式製備的樹狀聚體歸為一代。有利地，樹狀聚體具有可以比對線型聚合物可能的更精確得多定義的分子結構(Tomalia DA, Naylor AM, Goddard III WA.(1990)Starburst dendrimers:molecularlevel control of size,shape,surface chemistry,topology and flexibilityfrom atoms to macroscopic matter.Angewandte Chemie-1nternationalEdition, 29, 138-175.;Hourani R&Kakkar A.Advances in elegance of chemistry indesigning dendrimers.Macromol.Rapid Commun.2010;31:947-74)。如上所述，不同的原料可以用於生成芯。基於聚醯氨基胺(PAMAM)的樹狀聚體已經得到廣泛研究。通過分支合成製備PAMAM樹狀聚體。有關分支合成的陰離子型羧酸封端的PAMAM樹狀聚體的詳細綜述可以在W003/089010和Shaunak S，Thomas S，GianasiE,Godwin A, Jones E,Teo I, Mireskandari K,Luthert P,Duncan R, Patterson S，KhawP&Brocchini S.的 Polyvalent dendrimer glucosamine conjugates prevent scartissue formation.Nature Biotechnology2004 ；22:977 - 985 中找到。迄今為止，PAMAM樹狀聚體是商業化和分支合成的樹狀聚體的最佳研究結果。通過在芯上遞增添加稱作代的分支層形成它們。典型地，可以得到為胺封端的完整代和羧酸封端的半代的它們。樹狀聚體的代由此代表相關術語的其大小(測定為以埃計的其直徑)及其分子量(Vogte F，Richardt G, Werner N.Dendrimer chemistry-concepts, synthesis,properties and applications.2009.Publisher Wiley.第 I 章，1-22 頁)。分支樹狀聚體還可以由聚丙基亞胺(PPI)、聚賴氨酸、三嗪和聚丙基醚亞胺合成。在2010年有關目前領域中分支合成的樹狀聚體及其應用的詳細綜述可以在:-Menjoge AR, Kannan RM, Tomalia DA, Dendrimer based drug and imagingconjugates:design considerations for nanomedical applications.Drug DiscoveryToday2010; 15(5-6):171 - 185)中找到。
有一些證據表明，與用胺基封端的那些相反，以游離羧酸封端的樹狀聚體已經改善了毒理學特性((Malik N, Wiwattanapatapee R, Klopsch R, Lorenz K, Frey H, WeenerJ ff,Meijer E W，Paulus ff&Duncan R.(2000)Dendrimers: Relationship betweenstructure and biocompatibility in vitro, and preliminary studies on thebiodistribution of1251-labelled polyamidoamine dendrimers in viv0.J ControlledRelease65, 133-148))。然而，當合成PPI樹狀聚體時，天然得到的端基是胺。這就促使本領域的一些技術人員嘗試和將胺封端的樹狀聚體轉化成相應的羧酸封端的樹狀聚體，參見Ashton PR, BoydSE, Brown CL, Nepogodiev SA, Meijer Eff, Peerlings HffI, Stoddart JF.Synthesis ofglycodendrimers by modification of poly (propylene imine)dendrimers.Chem.Eur.J.1997; 3 (6):974-984。這就產生了複雜的反應混合物。由此拋棄了使用羧酸封端的PPI樹狀聚體進行的另外的研究。然而，作者使用D-半乳糖和乳糖的間隔臂衍生物將胺封端的樹狀聚體轉化成100%表面糖基化的樹狀聚體。樹狀聚體已經應用於許多領域。在製藥領域中，將它們作為藥物載體研究並且在診斷應用中研究。因其自身的權利而極為罕見將樹狀聚體視為治療本體，部分原因在於其大小和複雜性。在樹狀聚體作為藥物載體或作為診斷工具的應用中，該領域顯然被生產越來越大的樹狀聚體所困擾。存在許多有關該物質的合成化學論文。然而，應注意，文獻中已經反覆證實高化合價(在這些大分子中)並不相當於高生物親和力。實際上，基礎骨架的精確性與糖配體/分子的拷貝數對具有生物活性的分子而言同樣重要(TurnbullWB&Stoddard JF.Design and synthesis of glycodendrimers.Reviews in MolecularBiotechnology.2002;90:231-255)。即芯並非簡單地是氨基糖分子的惰性支持物。此外，作者持續地得出結論，儘管商購樹狀聚體可以以這樣的方式被修飾，以改變其配體的表面密度，但是樹狀聚體骨架的重新設計是向前探索糖樹狀聚體的最佳方式，這種糖樹狀聚體具有有用的 生物活性與謹慎定義的大小、形狀、靈活性和表面配體密度。W003/089010公開了具有具備免疫-調節特性的部分糖基化表面的第3.5代PAMAM樹狀聚體。約15%或以下的表面末端羧酸通過O長度醯胺鍵與葡糖胺連接。在2004年，Shaunak證實了第G3.5代羧酸封端的PAMAM樹狀聚體(MWtl2，931，具有約64個周邊羧酸基團)和通過O長度醯胺鍵具有12.5%表面載量的葡糖胺)阻斷了促炎細胞因子應答(Shaunak S，Thomas S，Gianasi E, Godwin A, Jones E, TeoI, Mireskandari K,Luthert P,Duncan R, Patterson S, Khaw P&Brocchini S.Polyvalentdendrimer glucosamine conjugates prevent scar tissue formation.NatureBiotechnology2004;22:977 - 985;Vogte F, Richardt G, Werner N.Dendrimer chemistry-concepts, synthesis,properties and applications.2009Publisher Wiley.第 8章:Special properties and potential applications.289 - 324 頁且還參見圖 2)。這種樹狀聚體葡糖胺通過高度純化的LPS抑制促炎細胞因子TNF-a、IL-1 β和IL_6從初級人單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞中釋放。重要地，這種抑制作用在LPS後6h加入樹狀聚體葡糖胺時仍然可以觀察到。該作用是劑量依賴性的並且可逆轉，其中IC5tl為70nM(圖3&4&5)。儘管這種PAMAM糖樹狀聚體具有一些有意義的體外或體內生物活性，特別是它可以減少促炎細胞因子和促炎趨化因子，且還證實有助於預防動物模型中的過度瘢痕形成，但是這種分子尚未發展成治療劑(

圖1)，因為不能使得分子以適合的形式用作藥物。本發明的發明人目前對樹狀聚體葡糖胺的作用機制例如在抗-細胞因子和抗-趨化因子中的機制有了更好的理解。脂多糖(LPS -變量MWt>10kDa)是誘導這種先天性免疫應答的革蘭氏陰性菌外膜糖脂。它由如下成分組成-(a)親水性多糖芯；(b)溶劑接觸的疏水性脂質A成分；和(C) O-抗原。僅需要脂質A來誘導促炎細胞因子應答。它由通過醯胺或酯鍵連接3-羥基脂肪酸的二磷酸化β -1, 6-連接的D-葡糖胺二糖組成，所述的3-羥基脂肪酸進一步被非羥基化的12 - 14個碳脂肪酸鏈取代。LPS、TLR4與MD2蛋白之間的細胞表面相互作用對於啟動促炎細胞因子介導的應答是重要的。轉運蛋白CD14首先匯集，然後將可溶性LPS遞送至可溶性、循環和單體MD2。脂質A (MWt 2kDa)的兩種磷酸化葡糖胺殘基通過靜電相互作用與人MD2的疏水袋的帶電荷入口(Serl 18 {4，磷酸}和Lysl22{l』磷酸}及Arg90和Lys91)結合。二葡糖胺和磷酸基團保留在溶液中和疏水袋的外部；這些殘基用於將LPS錨定MD2的疏水袋的入□。然後LPS的脂質鏈在MD2的疏水袋中被埋藏。隨後形成的人TLR4 _MD_2 -LPS複合物需要:-(a)人 MD2 上 Met85、Leu87、Ilel24 和 Phel26 分別與人 TLR4 上 Phe436、Phe436、Phe440和Phe444的疏水相互作用；(b)人MD-2上Arg90和Gly 123分別與TLR4上Glu439和Ser416的氫鍵相互作用。所形成的複合物進行構象改變，導致受體複合物二聚化，引起胞內信號傳導事件並且啟動促炎細胞因子產生。低水平刺激促炎細胞因子產生對處理感染而言是生理學有益的，因為能夠使共刺激分子活化和產生適應性免疫應答。然而，過度促炎細胞因子產生可能變成病理性的，使宿主具有嚴重的不良反應，包括膿毒性休克和死亡。我們對生物活性的糖樹狀聚體與無生物活性的糖樹狀聚體之間的差異的分析導致我們認為其與MD2腔的入口處的特定胺基酸殘基的相互作用對它們的生物活性而言是重要的。MD2上的袋的親水性入口(脂質A所結合的)被本說明書的糖樹狀聚體且特別是樹狀聚體葡糖胺封閉。這防止了 TLR4 二聚化和信號傳導事件(Barata TS, TeoI，Brocchini S，Zloh MjShaunak S.Partially glycosylated dendrimers blockMD2and prevent TLR4-MD2—LPS complex mediated cytokine responses.PLoS ComputBiol2011;7(6):el002095.do1:10.1371/journal, pcb1.1002095)。我們的研究已經證實生物活性的部分糖基化的樹狀聚體顯示最大數量和最強的與MD2袋的入口內層上的幾個殘基的相互作用。這些殘基中的幾個對LPS結合MD2而言也是重要的。具有最高標準化相互作用值的殘基是LyS91、Tyrl02、Argl06、ASnll4和Serll8。具有較低相互作用值的幾個其他殘基也顯著地促成了部分糖基化樹狀聚體與人MD2的協同性結合；它們是 Arg96、Ser98、Lysl09、Thrll2 和 Thrll6。
因此，在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與一種或多種(例如1、2、3、4或5種)選自Lys91、Tyrl02、Argl06、Asnll4和Serl 18的殘基發生相互作用。認為本說明書的糖樹狀聚體與一種或多種這些重要的胺基酸發生相互作用。本文所用的相互作用是指非共價鍵合，例如氫鍵、離子鍵、範德華力和疏水性相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與Lys91發生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與Tyrl02發生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與Argl06發生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與Asnll4發生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與Serll8發生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與如下的殘基發生相互作用:Lys91 和 Tyrl02 ；Lys91 和 Argl06 ；Lys91 和 Asnl14 ；Lys91 和 Serl18 ；Tyrl02和 Argl06 ;Tyr 102 和 Asnl 14 ;Tyr 102 和 Serl 18 ；Argl06 和 Asnl 14 ；Argl06 和 Serl 18 或Asnll4&Serll80在一個或多個實施方案中，本說明書的樹狀聚體還具有至少一種(例如2、3、4或5種)與選自Arg96、Ser98、Lysl09、Thrl 12和Thrl 16的殘基的相互作用。

此外，部分糖基化樹狀聚體對人MD2的親和力根據包括葡糖胺分子和幾個樹狀聚體的周邊羧酸分支的這兩種分子之間緊密接觸(即1.3人)的數量增加得以證實。這些靜電相互作用封閉了人MD2疏水袋的入口並且被認為封閉了 LPS的脂質鏈的入口。因此，推定樹狀聚體表面的生物活性是因存在來自芯樹狀聚體的游離周邊羧酸和氨基糖(或其硫酸鹽)所致。有利地，例如，本說明書的部分糖基化樹狀聚體是靈活性的和動態的，並且具有親水性邊緣，這意味著構象改變可以誘導形狀互補性。因此，本說明書的糖樹狀聚體與生物靶標的相互作用可以誘導分子上的「構象改變」。認為這能夠使樹狀聚體表面的糖例如葡糖胺封閉MD2袋的入口。與一些樹狀聚體的游離羧酸分支的另外的協同性靜電相互作用隨後發生。認為這些相互作用共同地阻斷LPS的脂質鏈進入人MD2袋，並且還防止TLR4-MD2-LPS細胞表面複合物形成。生物學重要的結果在於促炎細胞因子級聯不啟動。因此，在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體具有與例如如上所述的靶標中的一種或多種所述胺基酸發生的相互作用。作為本文所用的「密切」預以指2人或以下例如1.5A或以下、特別是1.3人的相互作用。我們還首次證實了存在脂質鏈並非是MD2拮抗劑或部分拮抗劑絕對必需的。我們的分子對接(molecular docking)研究顯示這些部分糖基化的樹狀聚體結合人MD2並且幹擾如下的靜電結合:_(i)LPS的二 -葡糖胺上的4』磷酸與MD2上的Serl 18 ；(ii)MD2 上的 LPS 與 Lys91 ;和(iii)隨後 TLR4 與 MD2-LPS 複合物上 Tyrl02 結合。這三種殘基排列在MD2疏水袋的親水性入口上。幾種其他人MD2表面殘基[即Arg96、Ser98、Argl06、Lysl09、Thrll2、Asnll4 和 Thrll6]與幾種部分糖基化樹狀聚體的周邊羧酸分支之間另外的多價相互作用顯然能夠決定其自身的位置，使得它始終封閉MD2袋的入口。這阻斷了 LPS的脂質鏈進入人MD2袋並且可以解釋分子的拮抗劑活性。來自我們的模型化研究和我們的生物學研究的結果還共同表明，至少G3.5部分糖基化PAMAM樹狀聚體(和本發明的有可能更適合的樹狀聚體)與人MD2的相互作用是特異性的，且樹枝狀結構對這種分子的生物活性而言是重要的(Barata TS, Shaunak S，TeoI，Zloh MjBrocchini S.Structural studies of biologically active glycosylatedpolyamidoamine(PAMAM)dendrimers.J Mol Model.Epub ahead of print:doil0.1007/s00894-010-0907-l ；Barata TSj Brocchini S，Teo I，Shaunak S，Zloh M.From sequenceto3D structure of hyperbranched molecules:application to surface modified PAMAMdendrimers.J Mol Model.Epub ahead of print:doil0.1007/s00894-011-0966-y ；BarataTS，Teo I，Brocchini S，Zloh M，Shaunak S.Partially glycosylated dendrimers blockMD_2and prevent TLR4-MD-2—LPS complex mediated cytokine responses.PLoS ComputBio12011;7(6):e1002095.do1:10.1371/journal.pcb1.1002095 ;Shaunak S，ThomasS，Gianasi Ej Godwin A，Jones E，Teo I，Mireskandari K，Luthert P，Duncan R，PattersonSj Khaw P&Brocchini S.Polyvalent dendrimer glucosamine conjugates prevent scartissue formation.Nature Biotechnology2004 ;22:977-985)。因此，我們的結果表明，需要通過樹狀聚體的臂連接的至少兩種糖例如葡糖胺分子結合幾種暴露和帶電荷的胺基酸，它們排列在MD2上的腔的入口上。因此，本說明書的糖樹狀聚體一般包含至少2個氨基糖或其硫酸鹽(包括其組合)。由於具有所述的這種情況，本說明書的分子一般作為分子群體提供。該群體可以包含大量離散的分子，其中一些可以包含少於2個的氨基糖或硫酸氨基糖。一般而言，具有少於2個的氨基糖或硫酸氨基糖的分子數量較低，例如少於3%，例如2%，1%或以下，特別是
0.5% 或 0.l%w/wo認為20埃範圍內 的靜電相互作用負責樹狀聚體例如樹狀聚體葡糖胺與MD2之間的這種相互作用，而非氫鍵相互作用(這僅可能出現在4埃距離內)。推定因這種高親和力結合，2個糖部分例如2個葡糖胺殘基的最佳間隔可能為10 L.樹狀聚體例如樹狀聚體葡糖胺與MD2上的袋的親水性入口結合幾乎完全封閉了MD2內該袋的入口 ；它還誘導了 MD2自身內的構象改變，使得LPS非常難以作為有效激動劑結合蛋白質。這有利地誘導了促炎細胞因子產生。這種重要的新機理性觀察結果顯示樹枝狀分子氨基糖(無任何脂質鏈或磷酸基團結合樹狀聚體)可以作為LPS結合MD2上疏水袋的帶電荷的親水性入口的部分拮抗劑起作用(圖6&7)。儘管不希望受到理論約束，但是認為表面特性(外臂靈活性和電荷分布)與分子大小對生物活性而言是極其重要的，特別是氨基糖和游離羧酸和例如群密度例如形成的O長度醯胺鍵的組合是在適合大小骨架上阻斷靶受體和產生治療結果所需的。糖樹狀聚體的親水性表面也起重要作用。能夠產生協同性作用的化合物在調節免疫系統中的生物控制機制方面非常重要，更具體地，它們很少在純合成分子中實現。本說明書的樹狀聚體適合於在體外和體內產生協同性作用。儘管從第3.5代陰離子型羧酸封端的PAMAM樹狀聚體的分子中生成的數據已經極為富有希望和令人激動，但是其缺乏進展的一個原因在於，儘管本領域的許多工作人員作了反覆嘗試，但是尚不能將該分子製備成「單分散體」，即實際上的可以可再現性地製備令藥物許可部門滿意的特徵化分子群體。這是因為，如同所有聚合物一樣，最終PAMAM樹狀聚體不可避免地包括少量成分的混合物，它們因樹狀聚體合成過程中出現的副反應產生。就所有聚合物而言，難以將這些成分分離出來以生成單一種類。迄今為止，尚未得到生成PAMAM樹狀聚體單一種類的方法。可以認為化學自身存在缺陷的方面在於不能在這種分子的合成過程中防止副反應發生。使用PAMAM化學的不完全反應和環化反應是指對PAMAM產物而言存在一些結構不均勻性。這意味著極難以製備這種分子，它具有規模化製備的純度和可再現性以及許可部門批准例如來自FDA批准的新藥所需的分析化學表徵程度。因此，有必要考慮PAMAM化學的現實的可替代選擇以使用具有規模化製備的純度和可再現性以及藥物所需的分析化學表徵程度的分子實現期望的生物效果。因此，發明人已經尋找了一種替代分子，它與第3.5代PAMAM樹狀聚體的分子共有特徵。然而，結果是提供期望的生物特性的表面特徵、大小、靈活性和親水性並不如此的易於複製。令人意外地，在本領域工作幾乎8年後，發明人目前已經鑑定了極為有限數量的糖樹狀聚體，其具有期望的生物特性和基於不同化學的芯，因非常謹慎，所以它們可以用於製備具有規模化製備的純度和可再現性以及藥物所需的分析化學表徵程度的分子，例如生成單分散體，即例如基本上單一的化學本體。這種芯基於聚丙基醚亞胺，且令人意外地，使用這種芯製備的糖樹狀聚體似乎共有PAMAM糖樹狀聚體的一些或全部有利的生物特性，且在一個或多個領域中可以顯示超過PAMAM糖樹狀聚體的改善。已經生產了高純度(至 少95%)的聚丙基醚亞胺且聚丙基醚亞胺-葡糖胺具有白色結晶外觀。術語「單分散體」作為樹狀聚體化學領域中一般所理解的含義使用。這意味著樹狀聚體具有窄的分子量分布，其中主要存在一種定義分子量的具體種類。更具體地，一種具體種類以90%或以上，例如91、92、93、94、95、96、97、98%或以上存在。有利地，認為本說明書的糖樹狀聚體具有有用的生物特性，一般而言，它們能夠被製成具有規模化製備的純度和可再現性以及藥物所需的分析化學表徵程度的分子，例如基本上為單一的化學本體。在一個實施方案中，本發明的糖樹狀聚體是少量充分定義的化學本體的混合物，它們是無害的或基本上與主要樹狀聚體種類相似和例如具有相似的生物活性。在本說明書上下文中的「無害」預以指不導致有害效應且在生物環境中基本上無害的不純。例如，有害作用可以涉及組織毒性或催化作用或降解或任意其他可以被視為藥物缺點的特性。本文所述的「基本上相似」預以指其中分子包含與期望的種類相同的成分，但它們以不同比例存在，例如基本上相似一般是指包含相同的芯和糖的糖樹狀聚體，但芯上的羧酸的數和/或糖或與芯共軛的糖的數量與期望的不同。在一個實施方案中，以分支方式製備樹狀聚體芯，因此，可以將得到的樹狀聚體指定為一代。
在一個實施方案中，芯樹狀聚體的「代」是4或以下，例如3、2、1或0.5。本文所用的樹狀聚體芯預以指分支樹狀聚體聚合物，此後表面通過「氨基糖」與其共軛而得到修飾。一般而言，如果考慮最終的芯，則它以游離羧酸封端。然而，如果芯位於中間階段，則它可以被非羧酸的官能團封端。本文所用的末端羧酸基團預以指位於樹狀聚體的一個表面分支末端上的游離羧酸基團-C(O)OH和任意羧酸殘基。本文所用的末端羧酸殘基預以指與另一種本體例如氨基糖發生化學反應後遺留的末端羧酸部分，例如-C(O)-。游離羧酸基團預以指未反應(非共軛羧酸)的_C(0)0H。本文所用的糖樹狀聚體預以指因樹狀聚體芯上糖例如氨基糖與一些末端羧酸共軛產生的本體。糖，例如氨基糖與樹狀聚體芯通過糖上的氮與來自末端羧酸基團的羰基形成的醯胺鍵連接。這是直接的醯胺鍵，也稱作O長度醯胺鍵。在一個實施方案中，樹狀聚體芯上末端羧酸的數量平均為10或12 — 48，例如8、
12、16、24、32、40 或 48，例如 16、24、32 或 48。在一個實施方案中，樹狀聚體芯具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個羧酸
或其組合。在一個實施方案中，樹狀聚體芯上末端羧酸的數量為16、17、18、19、20、23、24、25、
26、27、28和其組合。在一個實施方案中，樹狀聚體芯上末端羧酸的平均數為10 — 20，例如平均為14 一18，例如平均為16個羧酸，特別是16個羧酸。本領域技術人員顯而易見，一般對指定分子群體而言，存在的羧酸的數量在計算時是整個群體內的平均值。在一個實施方案中，將所述群體定義為，它不包括具有低於定義的下限閾值和高於定義的上限閾值的羧酸的分子，例如，如果需要包含16個羧酸的分子，則下限值可以為12且上限值可以為20乃至18。在一個實施方案中，糖樹狀聚體包含組合數量的末端羧酸和相當於起始芯內游離羧酸數量的羧酸殘基。在本說明書的糖樹狀聚體的分子中，存在至少一個且一般是一個以上游離羧酸，例如，其中羧酸的數量=X-Y,其中X是9 一 64範圍的數值(且相當於樹狀聚體芯的羧酸數量)，Y是2 — 8範圍的數值(且相當於表面共軛糖分子的數量)。在一個實施方案中，游離羧酸的數量為8、10、14、21、28、35或38(或其組合)。在一個實施方案中，游離羧酸的數量為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或其組合。在一個實施方案中，共軛後游離羧酸的數量在該群體中平均為12 - 14，例如14。這些游離羧酸可以在有利於糖樹狀聚體與靶受體增強的多價結合方面具有作用，且由此與分子的生物活性相關。本說明書的糖樹狀聚體可以作為可表徵的分子的離散群體提供。有利地，羧酸封端的陰離子型聚丙基醚亞胺樹狀聚體與陽離子型聚丙基醚亞胺樹狀聚體相比在體外明顯不具有毒性(Krishna TR&Jayaraman N.Synthesis of poly (propylether imine)dendrimers and evaluation of their cytotoxic properties.J.0rganicChemistry2003; 68 (25): 9, 694-9, 704; Jain S, Kaur A, Puri R等人Polypropyletheriminedendrimer:A novel non-toxic dendrimer for sustained drug delivery.Eur JMed Chem201; 45:4997-5005)。這種較高代陽離子型樹狀聚體的內在毒性是指它們對作為藥物對人反覆靜脈內給藥而言可能不適合或不安全(Malik N, WiwattanapatapeeR, Klopsch R, Lorenz K, Frey H, Weener J ff, Meijer E ff, Paulus ff&Duncan R.(2000)Dendrimers:Relationship between structure and biocompatibility in vitro, andpreliminary studies on the biodistribution of1251-labelled polyamidoaminedendrimers in viv0.Journal of Controlled Release65, 133-148)。因此，認為本說明書的糖樹狀聚體具有低毒性，使得它們適合於用作藥物。
在一個實施方案中，與樹狀聚體芯共軛的氨基糖的平均範圍在2 — 8，例如3、4、5、6或7，例如包含平均為16個羧酸的芯。在一個實施方案中，2個氨基糖與樹狀聚體芯共軛。在一個實施方案中，主要種類的糖樹狀聚體包含2個氨基糖，但群體例如還可以包含具有I或3個糖的本體。在一個實施方案中，提供了與2、3、4或5例如2、3、或4、特別是2或3個糖共軛的樹狀聚體芯(例如具有16個羧酸或平均具有16個羧酸的群體)。還提供了包含所述分子的群體。甚至在具有與之共軛的相同數量的糖分子的糖樹狀聚體群體中，分子也可以作為區域異構體存在。即糖本體、特別是糖樹狀聚體的相對位置可變。即糖的空間排列在該群體的一個分子與另一個分子比較時是不同的。在一個實施方案中，使主要糖樹狀聚體種類的區域異構體的數量最小化，特別是對指定具有與之共軛的相同數量的糖的糖樹狀聚體群體而言，至少50%的所述群體是期望的區域異構體，特別是75%是期望的區域異構體。可以影響區域異構體分布以通過優化共軛過程中的合成化學條件提供期望的結
果O在一個實施方案中，30%或以下的樹狀聚體的羧酸與糖共軛，例如29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%的樹狀聚體的羧酸是共軛的，例如28.75%。在一個實施方案中，20%或以下的樹狀聚體的羧酸與糖共軛，例如19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1% 或以下的樹狀聚體的羧酸是共軛的，例如16.75或12.5%。在一個實施方案中，共軛羧酸的數量在3% - 14%，例如6% - 13%，特別是12.5%。然而，本發明的發明人認為在每個分子中至少需要2個氨基糖以有效地阻斷靶受體。此外，在一個方面中，提供了高度優化的糖樹狀聚體，其包含2個氨基糖和14個其餘的末端羧酸。在一個實施方案中，樹狀聚體是樹狀聚體群體，其中後面的本體是主要的成分，例如是單分散體。這種分子(即第3代陰離子型羧酸封端的聚丙基醚亞胺樹狀聚體葡糖胺)在外形上小於本領域在先描述的第3.5代PAMAM樹狀聚體葡糖胺。第3.5代PAMAM樹狀聚體在芯內具有64個末端羧酸。在一個實施方案中，本說明書的糖樹狀聚體是第4代分子。令人意外地，這種小的聚丙基醚亞胺樹狀聚體在芯內僅具有16個末端羧酸。在相同濃度(基於mg/ml)下，認為聚丙基醚亞胺芯在製備所述糖樹狀聚體中的應用可以減少一些促炎細胞因子，其程度等於或大於G3.5代PAMAM樹狀聚體葡糖胺，正如下表I中所概述的。表1:來自所示的幾個圖的結果的概述表。當與G3.5PAMAM樹狀聚體葡糖胺比較時，量化了使用G3聚丙基醚亞胺樹狀聚體葡糖胺在促炎細胞因子中的減少倍數。100%對照=從用25ng/ml LPS刺激的細胞中釋放細胞因子的刺激。

權利要求
1.糖樹狀聚體，包含: a)支持平均9- 64個末端羧酸基團的無毒性樹狀聚體聚丙基醚亞胺芯；和 b)與所述芯共軛的2- 8個氨基糖或硫酸氨基糖，其選自葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、甘露糖胺、N-乙醯甘露糖胺、半乳糖胺、它們的任意一種的硫酸鹽及其組合， 其中每個糖直接通過O長度的醯胺鍵與末端羧酸基團的殘基連接。
2.權利要求1的糖樹狀聚體，其中該糖樹狀聚體是一代樹狀聚體。
3.權利要求2的糖樹狀聚體，其中樹狀聚體芯是第4代或以下，例如第3代或以下。
4.權利要求1一 3任一項的糖樹狀聚體，其中末端羧酸數為12 - 48。
5.權利要求4的糖樹狀聚體，其中末端羧酸數為12- 32，例如16 — 32，特別是16 —32。
6.權利要求5的糖樹狀聚體，其中末端羧酸數約為9，約12，約16，約24，約32或約48，例如約16。
7.權利要求1一 6任一項的糖樹狀聚體，其中氨基糖或硫酸氨基糖是葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、2-硫酸葡糖胺、3-硫酸葡糖胺、6-硫酸葡糖胺、2，6- 二硫酸葡糖胺、3，6- 二硫酸葡糖胺、3，4，6-三硫酸葡糖胺、2-硫酸N-乙醯葡糖胺、3-硫酸N-乙醯葡糖胺、6-硫酸N-乙醯葡糖胺、2，6- 二硫酸N-乙醯 葡糖胺、3，6- 二硫酸N-乙醯葡糖胺或3，4，6-三硫酸N-乙醯葡糖胺或其組合。
8.權利要求1一 7任一項的糖樹狀聚體，其中2 - 6、例如3、4或5個氨基糖與芯共軛。
9.權利要求1一 7任一項的糖樹狀聚體，其中平均至少2、4、6或8個氨基糖與每個芯共軛，特別是2或3例如2個氨基糖與每個芯共軛。
10.權利要求9的糖樹狀聚體，其中氨基糖是葡糖胺。
11.權利要求1一 7任一項的糖樹狀聚體，其中2 - 6、例如3、4或5個硫酸氨基糖與每個芯共軛，特別是2或3例如2個硫酸氨基糖氨基糖與每個芯共軛。
12.權利要求11的糖樹狀聚體，其中硫酸氨基糖是6-硫酸葡糖胺。
13.權利要求1一 12任一項的糖樹狀聚體，其中樹狀聚體芯具有為氧的中心原子。
14.權利要求1一 12任一項的糖樹狀聚體，其中樹狀聚體芯具有為氮的中心原子。
15.糖樹狀聚體群體,其中該群體的平均特性如權利要求1一 14任一項所定義。
16.藥物製劑，包含如權利要求1一 14任一項所定義的糖樹狀聚體或如權利要求15所定義的群體及藥學可接受的賦形劑。
17.權利要求16的製劑，用於局部給藥。
18.權利要求16的製劑，用於輸注或直接注射。
19.權利要求16的製劑，用於口服給藥。
20.權利要求16- 19任一項的製劑，其中在一個劑量中包含10μ g — Ig如權利要求1 - 14任一項所定義的糖樹狀聚體或權利要求15的群體。
21.如權利要求1一 14任一項所定義的糖樹狀聚體、權利要求15所定義的群體或如權利要求16 - 20任一項所定義的藥物製劑，用於治療。
22.權利要求21的糖樹狀聚體或製劑，用於治療或預防與宿主/患者的過度促炎細胞因子應答相關的疾病。
23.權利要求22的糖樹狀聚體或製劑，其中炎症應答由一種或多種細胞因子水平增加介導，所述細胞因子選自IL-6、TNF-a、IL-8、IL-1 β和MIP-1 β。
24.權利要求22或23的糖樹狀聚體或製劑，用於治療或預防與革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽性菌導致的感染相關的促炎細胞因子應答。
25.權利要求24的糖樹狀聚體或製劑，其中革蘭氏陰性菌感染與腹瀉相關，例如造成炎性腹瀉的志賀菌屬或沙門氏菌屬或彎曲桿菌屬或難辨梭菌或任意類型的大腸桿菌所導致的那些感染。
26.權利要求24的糖樹狀聚體或製劑，其中感染由大腸桿菌、Klebsiellaaeruginosa、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和/或任意其他感染性生物體導致。
27.權利要求21 — 23任一項的糖樹狀聚體或製劑，用於治療或預防炎性腸病，例如克羅恩病和/或潰瘍性結腸炎。
28.權利要求21 - 23任一項的糖樹狀聚體或製劑，用於治療或預防炎症呼吸應答，例如在過敏反應和/或哮喘中和/或細菌/病毒呼吸道感染後的應答。
29.權利要求21— 23任一項的糖樹狀聚體或製劑，用於治療或預防傷口癒合過程中的過度瘢痕形成、瘢痕疙瘩形成、溼疹和銀屑病。
30.權利要求29的糖樹狀聚體或製劑，用於治療或預防移植，例如角膜和/或皮膚移植。
31.治療或預防的方 法，包含對有此需要的患者給予治療有效量的權利要求1一 14任一項的糖樹狀聚體、權利要求15的群體或權利要求16 — 20任一項的製劑。
32.權利要求31的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、群體或製劑是為了治療或預防與患者過度促炎細胞因子應答相關的疾病或病症。
33.權利要求32的方法，其中所述應答由一種或多種細胞因子水平增加介導，所述細胞因子選自 IL-6、TNF- a、IL-8、IL-1 β 和 ΜΙΡ-1 α 和 β。
34.權利要求32的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、群體或製劑是為了治療或預防與革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽性菌感染相關的促炎細胞因子應答。
35.權利要求34的方法，其中革蘭氏陰性菌感染與腹瀉相關，例如由志賀菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、難辨梭菌、大腸桿菌導致的那些。
36.權利要求34的糖樹狀聚體、群體或製劑,其中所述感染由大腸桿菌、klebsiellaaeruginosa、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和/或任意其他感染性生物體導致。
37.權利要求31— 33任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或製劑是為了治療或預防炎性腸病，例如克羅恩病和/或潰瘍性結腸炎。
38.權利要求31— 33任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或製劑是為了治療或預防那些腸易激疾病的形式，例如與腸細菌過度刺激Toll樣受體相關的那些腸易激疾病的形式。
39.權利要求31- 33任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或製劑是為了治療或預防炎症呼吸應答，例如在過敏反應和/或哮喘中和/或細菌/病毒呼吸道感染後的應答。
40.權利要求31— 33任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體或其製劑是為了治療或預防傷口癒合過程中的過度瘢痕形成、瘢痕疙瘩形成、溼疹和銀屑病。
41.權利要求31— 33任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體或其製劑是為了治療或預防移植，例如角膜和/或皮膚移植。
42.權利要求31- 33任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或製劑是治療或預防牙齦炎。
全文摘要
糖樹狀聚體，包含a)支持平均9－64個末端羧酸基團的無毒性樹狀聚體聚丙基醚亞胺芯；和b)與所述芯共軛的2－8個氨基糖或硫酸氨基糖，其選自葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、甘露糖胺、N-乙醯甘露糖胺、半乳糖胺、它們的任意一種的硫酸鹽及其組合，其中每個糖直接通過0長度的醯胺鍵與末端羧酸基團的殘基連接。本發明還擴展至包含所述糖樹狀聚體的定義的群體、包含所述分子或群體的藥物組合物、所述分子和製劑的製備方法和所述分子、群體和組合物的治療應用。
文檔編號C07H11/00GK103180333SQ201180047847
公開日2013年6月26日 申請日期2011年8月22日 優先權日2010年8月24日
發明者蘇尼爾·肖那克, 伊恩·阿瑟·泰奧 申請人:英皇創新有限公司