HepG2細胞表面特異性結合的多肽的製作方法

2023-05-03 20:49:06

專利名稱：HepG2細胞表面特異性結合的多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，涉及篩選腫瘤組織特異性結合肽，特別是一種H印G2 細胞表面特異性結合的多肽。
背景技術：
肝癌Ofepatocarcinoma)是消化道常見惡性腫瘤之一。在中國，肝癌是發病率高、 死亡率高、治療費用高的疾病。根據世界衛生組織的數據顯示，我國每年至少有肝癌死亡人數55萬。80%以上肝癌患者是由肝炎病毒攜帶者或慢性肝炎患者轉化而來。我國是世界上肝癌高發區之一，其肝癌發病率約為歐美地區的10倍，主要分布在東南沿海。發展中國家此類腫瘤的新發病例數約佔全球發病總數的77%，而中國就佔了全球發病總數的43%。就死亡率而言，肝癌在我國惡性腫瘤死亡率位居第二，僅次於肺癌，每年約50萬人死於肝癌， 而且發病率和死亡率一直處於上升趨勢。因為肝癌在早中期可能不會有症狀，所以多數癌症病人就診時已是晚期，錯過了肝癌治療的最佳時間。晚期肝癌的有效治療方案很少，病人多數前景不好。所以，要提高肝癌術後生存率和降低死亡率的關鍵就在於早期發現、早期診斷和早期治療。但是，目前對肝癌由於仍然缺乏特異的、廉價的、方便的早期診斷方法，所以對肝癌的早期檢出率仍很低，病人死亡率仍很高。噬菌體展示技術(Phage Display Technology)是一項特異性多肽或蛋白的篩選技術，1985年由美國Missouri大學G. P. Smith等首創，此技術可將目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示於噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，使大量隨機多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯繫，使得各種靶分子(如抗體、酶和細胞表面受體等)的多肽配體通過體外親和淘選程序得以快速鑑定。噬菌體展示技術已被廣泛用於腫瘤診斷標誌物和抗腫瘤先導化合物的篩選、腫瘤特異性抗體和腫瘤藥物靶向運輸等方面的研究。噬菌體展示技術正逐步發展成熟，為獲取對癌症診斷和治療有價值的多肽或抗體提供了重要手段。目前已發現多種與腫瘤相關的基因和抗原，腫瘤相關配體和多肽的篩選已成為尋找抗腫瘤藥物的新熱點，針對腫瘤細胞不同表達分子的特異性結合多肽，為腫瘤治療提供了新的靶點，也為放射標記的腫瘤檢測、化療藥物的給藥、藥物敏感實驗及腫瘤的免疫治療提供了新的分子靶位，噬菌體多肽還具有抑制腫瘤相關基因轉錄、阻礙腫瘤新生血管生成和轉移及誘導腫瘤細胞凋亡等作用，將多肽與脂質體或納米藥物偶聯，既有助於在達到更好的靶向治療效果，又減小了藥物的毒副作用，還可用於腫瘤血管三維成像和分子影像技術的檢測及腫瘤治療療效評價。

發明內容
本發明的目的在於，提供一種HepG2細胞表面特異性結合的多肽，利用噬菌體展示隨機十二肽庫篩選得到4條多肽片段，並鑑定它們與肝癌細胞的親和力和特異性，分析胺基酸序列組成，尋找能夠和肝癌細胞特異性結合的配體，分析這些蛋白與細胞結合的胺基酸表位，為研究噬菌體展示多肽在腫瘤早期診斷和靶向藥物治療等研究方面提供實驗依據。為了實現上述任務，本發明採取如下的技術解決方案HepG2細胞表面特異性結合的多肽，其特徵在於，利用噬菌體展示隨機十二肽庫篩選得到4條多肽片段，其胺基酸序列分別為LLADTTHHRPWT，LLADTPHHRPffT, FGffVTPHHELRS 和 SLSDLTHMGPWP。4條多肽片段均為親水性多肽，且4條多肽片段的胺基酸序列具有一定的同源性， 其共有胺基酸序列(基序)S***D(V)TT(P)HH*P(L)W(R)*( 「*」表示該位點胺基酸不確定)。4條多肽片段能夠特異性結合!fepG2細胞，而不識別人胚腎HEK293細胞。上述！fepG2細胞表面特異性結合的多肽的篩選方法，利用噬菌體隨機十二肽庫， 以體外培養的肝癌ifepG2細胞係為靶細胞，以人胚腎細胞HEK293細胞係為吸附細胞，進行 4輪全細胞消減篩選，隨機挑取30個噬菌體克隆擴增並滴定，利用酶聯免疫吸附實驗鑑定陽性克隆，比較陽性克隆與HepG2細胞的親和力，排除假陽性克隆，提取陽性噬菌體克隆單鏈DNA測序，分析多肽的胺基酸序列的基本特徵，多肽同源性比較，檢索出現頻率高的多肽基序，BLAST檢索蛋白質資料庫，檢測多肽基序同源性較高的蛋白質，及可能結合的細胞表面受體和配體；細胞免疫螢光法檢測噬菌體多肽克隆的靶向性，進一步鑑定陽性克隆的特異性。本發明利用噬菌體多肽展示技術篩選肝癌HepG2細胞結合的多肽序列，ELISA鑑定噬菌體克隆與肝癌細胞的親和力，獲得8個陽性噬菌體克隆，測序獲得4條多肽序列，其共有胺基酸序列(基序)為***D(V)TT(P)HH*P(L)W(R)*，同源性分析表明多肽基序可能為腫瘤細胞表面受體結合的配體蛋白上的胺基酸決定簇，細胞免疫螢光進一步鑑定噬菌體陽性克隆的靶向性結果提示噬菌體陽性克隆能夠特異性結合HepG2細胞，篩選獲得的肝癌 HepG2細胞特異性多肽為肝癌的早期診斷、抗腫瘤藥物的靶向運輸及靶向短肽藥物的研發提供了實驗依據。


圖1是本發明的具體技術路線圖；圖2是隨機十二肽pill融合蛋白的N末端序列；圖3是精簡遺傳密碼錶；圖4是8個噬菌體陽性克隆與IfepG2細胞親和力的ELISA鑑定；圖5A、圖5B、圖5C和圖5D分別是四條噬菌體多肽的胺基酸疏水性圖；圖6A X分別是噬菌體陽性克隆靶向IfepG2細胞的免疫螢光檢測(X200)圖，其中A, B, C, D :HepG2cells(A and B)and HEK293 cells(C and D)incubated with PC28positive clone that displays HCSPl peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ;E, F, G, H:HepG2 cells (E and F) and HEK293 cells(G and H)incubated with PC26 positive clone that displays HCSP2 peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ;I, J, K, L :HepG2 cells (I and J)and HEK293 cells (K and L)incubated with PC24 positive clone that displays HCSP3 peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ；M，N，0，P : HepG2 cells(M and N)and HEK293 cells (0 and P)incubated with PC16 positive clone that displays HCSP4 peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ;Q，R，S，T :HepG2 cells(Q and R)and HEK293(S and T)cells incubated with irrelevent phage under the light microscope and the fluorescent microscope ；U，V， W, X:HepG2 cells (U and V)and HEK293 cells(W and X)incubated with PBS under the light microscope and the fluorescent microscope。以下結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式一、技術路線本發明採用噬菌體多肽展示技術，以人肝癌HepG2細胞係為靶細胞，以人胚腎 HEK293細胞為陰性吸附細胞進行4輪消減篩選，從噬菌體12肽庫中篩選能特異性結合肝癌 HepG2細胞的多肽基序，檢索其可能識別的細胞表面受體，為肝癌早期診斷和靶向治療的進一步研究提供良好的實驗依據，具體技術路線如圖1所示。二、材料與方法2. 1主要實驗材料2. 1. 1細胞、噬菌體多肽庫、宿主菌(1)細胞株人肝癌細胞株H印G2，人胚腎細胞株HEK293，購於美國 ATCC(Rockville，美國)。(2)噬菌體肽庫隨機十二肽噬菌體展示文庫(Ph. D. -12TM Phage Display Peptide Library Kit)購自 New England Biolabs，USA，滴度 1· 5X 1013pfu/ml，貯存於含 50%甘油的TBS溶液中。複雜度 2. 7X109個轉化子，於M13噬菌體cPIII蛋白的Kpn-I 和feg-I位點之間插入外源序列。_96gIII測序引物序列為5，-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，。(3)宿主菌大腸桿菌 E. coli ER2738 :F，Iaclq Δ (IacZ) M15proA + B + zzf: :TnlO(TetR)/fhuA2supEthi Δ (lac-proAB) Δ (hsdMS-mcrB) 5 (rk-mk-McrBC-)。該菌株以含50%甘油的菌體培養物形式貯存於_80°C 非感受態細胞，購自New England Biolabs, USA02. 1.2主要試劑及耗材(1) RPMI 1640 培養基購自 Gibco 公司。(2) DMEM培養基購自Gibco公司。(3)胎牛血清購自天津市灝洋生物製品科技有限責任公司。(4)青黴素、鏈黴素、慶大黴素及胰蛋白酶購自Amresco公司。(5) DMS0、臺盼藍購自Sigma公司。(6)PEG8000 購自北京索萊寶科技有限公司。(7) IPTG、BSA 購自西安沃爾森生物技術有限公司。(8)Xgal、DMF、NaN3、0i^、Tween-2O、Agai^§ Amresco 公司。
(9) D-Glucose 購自上海生工生物工程公司。(lO)Bacto-Tryptone、酵母提取物購自 0X0ID，England。(Il)Agarose 購自美國 Invitrogen 公司。(12)山羊抗 M13 多克隆抗體購自 Santa Cruz Biotechnology, Inc 公司。(13)辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗山羊IgG 購自北京博奧森生物技術有限公司。(14)多聚甲醛購自Sigma公司。(15) TMB 購自 Boston Biomedica, Inc. (BBI)公司。(16)FITC標記兔抗山羊IgG 購自北京中杉金橋生物技術有限公司。(17)常規生物化學試劑購自西安沃爾森生物技術有限公司。2. 1. 3主要試劑的配製(1)四環素貯液以20mg/ml的濃度溶於無水乙醇中，封裝至1. 5ml無菌離心管中，Iml/管，_40°C避光保存，用前混勻。(2)5XM9 鹽溶液稱取 Na2HP04 · 12H20 42. 74g, KH2P047. 5g, NaCl 1. 25g, NH4C12. 5g，溶於400ml三蒸水中，磁力攪拌至完全溶解，三蒸水定容至500ml，高壓蒸汽滅
菌，室溫保存。(3)20% Glucose 稱取 20g Glucose，溶於 100ml 三蒸水，用 0. 22 μ m 過濾器過濾
除菌，4 °C貯存。(4)含四環素抗性的1XM9基本培養基取5 XM9鹽溶液100ml，稱取瓊脂粉7. 5g， 調節pH至7. 0，三蒸水定容至500ml，高壓蒸汽滅菌，冷卻至低於70°C時，加入無菌的20% Glucose 10ml，及四環素貯液625μ 1(終濃度SOyg/ml)，混勻倒平板。平板4°C避光保存。(5)含四環素抗性的LB medium (pH 7.4)稱取胰蛋白腖5g，酵母提取物2. 5g， NaCl 2. 5g，溶解於400ml三蒸水中，磁力攪拌至完全溶解。用IM的NaOH調節pH值至7. 0， 三蒸水定容至500ml。高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至低於50°C時，加入四環素貯液1. 25ml (終濃度50 μ g/ml)，4°C避光保存。(6) TBS :50mM Tris-HCl (pH7. 5), 150mM NaCl，高壓滅菌，室溫保存。(7)PEG/NaCl 20% (w/v)PEG8000, 2. 5M NaCl，高壓滅菌，室溫保存。(8) IPTG/Xgal 將 1. 25g IPTG 和 Ig Xgal 溶於 25ml DMF 中，充分混勻，錫箔紙包裹，-20°C保存。(9) LB/IPTG/Xgal 平板IL LB medium,加入 15g 瓊脂粉，高壓滅菌 30min，室溫冷卻至低於70°C時，加入Iml IPTG/Xgal，混勻倒平板。平板4°C避光保存。(10)頂層瓊月旨糖(Top Agarose)稱取 Bacto-Tryptone :lg，yeast extract 0. 5g, NaCl :0. 5g, MgCl · 6H20 :0. lg, Agarose :0. 7g，高壓滅菌 30min，封裝至無菌 50ml 離心管中，室溫保存，用時微波爐融化。(Il)PBS 磷酸鹽緩衝液稱取 NaCl 8g, KCl :0. 2g, Na2HP04 · 12H20 :1. 44g, KH2P04 :0. Mg，溶於900ml三蒸水中，磁力攪拌充分溶解，用10N HCl調節pH值至7. 4，三
蒸水定容至1L。高壓滅菌，室溫保存。(12)Blocking buffer 3% BSA 溶於 PBS(ρΗ7· 4)，0. 22 μ m 濾器過濾除菌，4°C保存。
(13) TBST :50mM Tris-HCl (pH7. 5), 150mM NaCl,不同濃度(ν/ν)的 Tween-20 (0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 5% )，高壓滅菌，室溫保存。(14) RPMI 1640完全培養基取RPMI 1640培養基幹粉3包，溶於2L超純三蒸水， 並用三蒸水清洗包裝袋2 3次(洗液一併加入培養基中)，加入NaHC03 :6g，FBS :300ml, 抗生素各30ml (青黴素/鏈黴素終濃度為100U/ml，慶大黴素終濃度為100 μ g/ml)，磁力攪拌至完全溶解，ION HCl調節pH值至7. 2左右(過濾後pH值會升高0. 2 0. 3)，超純三蒸水定容至3L。0. 22 μ m過濾器過濾除菌，分裝於500ml滅菌試劑瓶，4°C保存。(1 DMEM完全培養基取DMEM培養基幹粉3包，溶於2L超純三蒸水，並用三蒸水清洗包裝袋2 3次(洗液一併加入培養基中)，加入NaHC03 7. 2g，FBS 300ml，抗生素各 30ml (青黴素/鏈黴素終濃度為100U/ml，慶大黴素終濃度為100 μ g/ml)，磁力攪拌至完全溶解，ION HCl調節pH值至7. 2左右，超純三蒸水定容至3L。0. 22 μ m過濾器過濾除菌，分裝於500ml滅菌試劑瓶，4°C保存。(16) 0. 25 % Trypsin-O. 02 % EDTA 稱取 0. 25g 胰蛋白酶 Trypsin 粉劑，溶於 IOOmlO. IM PBS中，加入IM EDTA M μ 1，磁棒慢速攪拌5 6小時，0. 22 μ m過濾器過濾除
菌，4°C保存。(17)4%臺盼藍母液稱取4g臺盼藍，加入少量三蒸水研磨，加三蒸水定容至 100ml，用濾紙過濾，4°C保存，使用時用PBS稀釋母液至0. 4%使用液。(18) 4%多聚甲醛固定液稱取4g多聚甲醛粉末，溶於100ml PBS (pH7. 2)，磁力攪拌溶解，稍許加熱至60°C，加入幾滴IM NaOH助溶完全，0. 22 μ m濾器過濾，4°C保存。(19) TMB底物貯液稱取IOmg TMB粉末，溶於5ml DMSO中，錫箔紙包裹，4°C保存。(20) TMB 底物緩衝液(ρΗ5· 5)溶液 A 檸檬酸(C6H807 · Η20) 0. lmol/L ；溶液B 磷酸氫二鈉(Na2HP04 · 12H20) 0. 2mol/L ；將溶液Α、溶液B和三蒸水按體積比 24.3 25. 7 50的比例混合，高壓滅菌，4°C保存。(21) TMB工作液依次取TMB底物緩衝液9. 5ml,0. 75% H202 42 μ 1，TMB底物貯液 0. 5ml，於IOml滅菌離心管中充分混勻，避光操作，現用現配。(22)顯色終止液2M H2S04。(23)碘化物緩衝液:10mM Tris-HCl (pH 8. 0)，ImM EDTA，4M NaI。室溫避光保存。2. 2實驗方法2. 2.1細胞培養2. 2. 1. 1 細胞復甦用酒精棉球擦拭超淨工作檯臺面，紫外線照射30min以上，37 °C水浴預熱 RPMI1640培養基和DMEM培養基，從液氮罐中取出凍存的H印G2細胞凍存管，迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，並不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。約1 anin 後凍存管內液體完全溶解，用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，移入超淨臺內，無菌條件下將細胞懸液轉入IOml離心管中，加入5ml RPMI1640培養基，用託架天平平衡後800rpm低速離心 3min，棄上清。加入RPMI1640培養基重懸細胞，轉入10cm2培養瓶中。將培養瓶移至37°C、 飽和溼度、5% C02的培養箱內培養。重複同樣操作復甦HEK293細胞。2. 2. 1. 2細胞傳代培養次日更換培養液一次，待細胞長至90 %融合時，小心吸棄去舊培養基，用預熱的PBS輕輕洗滌細胞，加入適量胰蛋白酶消化液37°C消化3 5min，倒置顯微鏡下觀察，待細胞胞質回縮變圓、細胞不再粘連成片時，吸棄消化液，加入RPMI 1640完全培養基，用滴管輕柔吹打已消化細胞成細胞懸液，將細胞懸液轉移至IOml離心管，平衡後將離心管放入臺式離心機，800rpm，離心5min，小心吸棄上清，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞懸液， 封裝於2 3個培養瓶，補足培養基後旋緊瓶蓋。倒置顯微鏡下觀察細胞數量，傳代細胞密度不應少於lX105cellS/ml，置於37°C、飽和溼度、5% C02孵箱，擰松瓶蓋培養。2 3日待細胞鋪滿瓶底繼續傳代。2. 2. 1. 3 細胞凍存凍存前24h進行細胞換液，取培養2 3天對數生長期的細胞，按細胞傳代方法收集細胞並計數，以1 5X 106cells/ml細胞濃度懸浮於含10% DMSO的RPMI 1640完全培養基中，輕輕反覆吹打均勻，Iml/管分裝於凍存管中，置於凍存杯中室溫放置2h，於-80°C 超低溫冰箱中過夜，次日置於液氮罐中長期保存並做好凍存記錄。2. 2. 2 宿主菌 E. coli ER2738 的活化(1)復甦取250 μ 1 LB-Tet液體培養基於1. 5ml無菌離心管中，以無菌技術從 E. coli ER2738的甘油凍存物中取出2 3μ 1菌液與之充分混勻，滴加至M9_Tet平板，用滅菌玻璃珠塗布2 3min，倒出玻璃珠，平板室溫放置5min，標記後置於37°C細菌培養箱倒置培養過夜。次日長出克隆後封口膜封口，4 °C避光保存備用。(2)培養取:3ml LB-Tet液體培養基置於IOml滅菌離心管中，用無菌槍頭以無菌技術挑取單克隆置於其中，標記後置於恆溫搖床37°C，300rpm振蕩培養過夜。細菌擴增液於4°C保存備用，取一管細菌與滅菌甘油1 1混合，分裝於1.5ml無菌離心管，每管 lml, _80°C超低溫冰箱保存。2. 2. 3噬菌體展示十二肽庫的消減篩選以人胚腎HEK293細胞為陰性吸附細胞，肝癌H印G2細胞為靶細胞，參照隨機十二肽噬菌體展示文庫(Ph. D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit)使用說明書，優化改良篩選方法，進行4輪消減篩選，保持每一輪篩選投入噬菌體量不少於1. 5 X IOIOPFUo第一輪篩選程序如下(1)細胞準備將生長狀態良好的人肝癌細胞H印G2和人胚腎HEK293細胞，分別傳代，接種於10cm2細胞培養瓶，置於37°C、飽和溼度、5% C02孵箱培養24h後換液，培養至細胞貼壁，生長狀態良好，待融合度為90%以上，匯合成單層細胞時進行篩選。(2)細菌活化將過夜振蕩培養的ER2738以1 100稀釋於20ml LB-Tet液體培養基中，37°C，225rpm，緩慢振搖2 池至對數前期，於紫外分光光度計上測0D600 0. 5。(3)封閉取融合度為90%以上的HEK293細胞，吸棄培養基，用PBS輕輕洗滌兩次，加無血清培養基，37°C、5% C02培養lh，吸去培養液，加入Blocking buffer (3% BSA+PBS)，37°C封閉池；重複同樣操作，封閉肝癌細胞IfepG2細胞。(4)洗滌吸棄封閉液，用0. 1 % TBST輕柔地洗滌6次，操作要避免細胞脫落。(5)陰性細胞吸附將10μ1噬菌體庫(第2輪至第4輪篩選取擴增庫 1. 5X1010PFU)與lml TBS混合，與ΗΕΚ293細胞孵育，37°C，孵育lh，孵育期間每隔15min 放脫色搖床上微搖。(6)取上清用吸管緩慢吸取上清，轉移至2ml滅菌離心管，lOOOrpm，離心5min，轉移上清至新離心管，再離心一次以去除上清中可能含有的細胞。(7)結合迅速將上清與已封閉、洗滌好的肝癌H印G2細胞孵育，37°C，孵育池。(8)洗滌小心吸棄上清，消化收集細胞於離心管，IOOOrpm,離心5min，吸棄上清， 用0. 1 % TBST反覆吹打洗滌IfepG2細胞20次，IOOOrpm,離心5min，重複洗滌4次，棄盡上清獲得細胞沉澱，用無菌濾紙條吸盡剩餘液滴。(9)擴增將細胞沉澱加入已搖至對數前期的ER2738菌液中，置於恆溫搖床， 370C，225rpm,振蕩培養4.釙。(10)噬菌體純化①將噬菌體擴增菌液分裝於滅菌的1.5ml離心管，每管1ml，13000rpm，離心 IOmin,上清轉入新離心管中，再離心，取上清上部80%轉入新離心管中。②加入1/6體積的PEG/NaCl (167 μ 1/tube)，反覆vertex混勻，4°C沉澱噬菌體過夜。③次日，4°C，13000rpm,離心過夜沉澱物15min。④倒掉上清，再次短暫離心，用微量移液器吸盡殘留上清液。⑤每管加入1ml TBS重懸沉澱，反覆vertex混勻，懸液轉移至滅菌1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm，離心5min，以去除殘餘細胞。⑥上清轉入另一無菌微量離心管中，用l/6PEG/NaCl (170 μ Ι/tube)，反覆vertex 混勻，再次沉澱，冰上孵育60min，4°C，13000rpm,離心lOmin。⑦棄上清，再次短暫離心，用微量移液器吸去殘餘上清。⑧每管加入200μ 1 TBS/0. 02% NaN3，反覆vertex混勻，短暫離心lmin，沉澱任何殘餘不溶物，上清轉入新1.5ml離心管中，此即為擴增後的一級庫，標記，以1 1加入滅菌甘油，-20°C保存。(11)噬菌體滴定①取2 3μ1 Ε. coli ER2738宿主菌，塗布M9_Tet平板，置於恆溫培養箱37°C倒置培養過夜。②菌操作挑取分離良好的單克隆於:3ml LB-Tet液體培養基中，置於恆溫搖床 37°C，300rpm，振蕩培養16 18小時。③將過夜ER2738培養物1 100稀釋於3ml LB-Tet培養基中，225rpm，振蕩培養 1. 5h 2h，至 0D600 0. 5。④準備5個LB/IPTG/Xgal平板於37°C恆溫培養箱預熱(每個噬菌體稀釋度對應一個平板)。⑤預先準備45°C水浴，微波爐中融化Top Agarose，分裝於IOml離心管中，3ml/ tube，置於水浴中備用。⑥將ER2738 (0D600 0. 5)分裝於1. 5ml滅菌離心管中(每個噬菌體稀釋度對應一管),200 μ 1/tube，4°C 保存備用。⑦在LB中準備10倍系列稀釋的噬菌體擴增庫，稀釋範圍為102 1011。⑧取107 1011不同噬菌體稀釋度，每管10 μ 1，分別與200 μ 1宿主菌混合，快速振蕩混勻，室溫溫育5min。⑨將感染的細菌快速加入45°C預溫的Top Agarose中，每次一管，快速vortex混勻，立即傾注於37°C預熱的LB/IPTG/Xgal平板上，快速旋轉傾斜平版使之均勻鋪展開來。 室溫冷卻5min，置於恆溫培養箱中，37°C倒置培養過夜。⑩次日，待平板長出藍斑，選擇密度合適( 100個藍斑)的平板計數，計算擴增噬菌體庫的滴度。計算方法如下擴增噬菌體庫的滴度=(藍斑數目X對應噬菌體稀釋倍 i^)/10 μ Kpfu/μ Do(12)下一輪篩選將滴定後的次級庫再次與ΗΕΚ293細胞和肝癌!fepG2細胞孵育， 篩選過程如上述，分別用上一輪結合、擴增、滴定的噬菌體次級庫，進行3輪篩選，每輪篩選投入的噬菌體量均為1. 5X1010PFU，逐輪增加篩選強度與陰性細胞HEK293細胞孵育時間增加至1. 25h、l. 5h、2h ；與靶細胞H印G2細胞孵育時間每輪篩選減少為1. 5h、l. 25h、lh ； TBST洗滌次數相應增加為6次、8次、10次；洗滌液中Tween-20濃度依次增加為0. 2%、 0. 3%,0. 5%。2. 2. 4細胞ELISA初步鑑定噬菌體陽性克隆2. 2. 4. 1噬菌體單克隆的製備(1)經過第4輪篩選獲得的噬菌體不經過擴增，直接感染宿主菌E. coli ER2738， 滴定鋪制LB/IPTG/Xgal平板，37°C倒置培養過夜。( 將過夜培養的宿主菌按1 100比例稀釋於LB-Tet液體培養基，分裝於30個 IOml離心管，每管3ml。(3)無菌操作，從長出藍斑數目 100的平板上，隨機挑取30個噬菌體克隆，接種到分裝好的離心管中，於37°C恆溫搖床，225rpm，緩慢振搖4.證。(4)將每個噬菌體單克隆擴增液分裝於滅菌1. 5ml離心管中，按照上述「噬菌體純化」方法純化每個單克隆。(5)滴定每一個噬菌體單克隆。(6)以同樣方法滴定原始噬菌體肽庫，從滴定平板上隨機提取一個克隆擴增、滴定，以作為陰性噬菌體克隆對照。2. 2. 4. 2ELISA法鑑定噬菌體單克隆與肝癌細胞結合的特異性以人胚腎細胞系HEK293細胞為陰性對照細胞，人源肝癌細胞系H印G2細胞為靶細胞，用全細胞酶聯免疫吸附實驗(ELISA)鑑定隨機挑取的30個噬菌體克隆結合特異性和親和力，以排除假陽性和非特異性克隆，同時設立PBS對照及原始噬菌體肽庫單克隆對照(無關克隆對照)。具體操作方法如下(1)取生長狀態良好的肝癌細胞HepG2和HEK293細胞，傳代消化，細胞計數，接種 96孔細胞培養板，密度4X 105cells/ml，每孔200 μ 1，每組設兩個復孔，置於37°C，5% C02 細胞培養箱中孵育M 36h，待細胞貼壁長滿單層進行下步實驗。(2)吸棄培養基，用預熱的PBS洗滌2次，每孔加入200 μ 1無血清培養基，置細胞培養箱孵育Ih。(3)吸棄培養基，PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛，100μ 1/孔，室溫固定30min。(4)吸棄固定液，在吸水紙上輕輕拍幹，PBS洗滌5minX3次。(5)在吸水紙上輕輕拍幹，滴加3% H2O2，100 μ 1/孔，室溫孵育20min，以阻斷內源性過氧化物酶活性。(6)棄H2O2，在吸水紙上輕輕拍幹，PBS洗滌5minX3次。
(7)加入 Blocking buffer (3% BSA in 0· 5% TBST)，250 μ 1/孔，室溫封閉 2h。(8)吸去封閉液，0. TBST洗滌5次，分別加入噬菌體單克隆，1X1010PFU， 100 μ 1/孔(稀釋於0.2% TBST)，設PBS對照和原始噬菌體肽庫單克隆對照，37°C孵育 1. 5h，間隔20min置脫色搖床緩慢振搖。(9)吸去噬菌體克隆，在吸水紙上輕輕拍幹，PBS振蕩洗滌5minX5次。(10)加入山羊抗 M13 多克隆抗體(1 2000 稀釋於 Blocking buffer), 100 μ 1/ 孔，37°C孵育lh，並間隔15min放脫色搖床上緩慢振搖。(11)吸棄一抗，在吸水紙上輕輕拍幹，PBS振蕩洗滌5minX5次。(12)加入 HRP 標記兔抗山羊 IgG(l 8000 稀釋於 Blocking buffer), 100 μ 1/ 孔，37°C孵育lh，並間隔15min放脫色搖床上緩慢振搖。(13)吸棄二抗，在吸水紙上輕輕拍幹，PBS振蕩洗滌5minX5次。(14)在吸水紙上輕輕拍幹，加入現配TMB顯色工作液，100 μ 1/孔，37°C孵育10 30min,肉眼觀察(白色背景)，陽性孔應為藍色或深藍色，陰性孔和對照孔應無色或淡藍色。(15)加入顯色終止液OM H2S04)終止反應，50 μ 1/孔，立即用酶標儀於450nm波長下測OD值，記錄數據。(16)判定結果，分析酶標測定儀取λ = 450nm, Ρ/η彡2. 1時陽性，Ρ/η彡1. 5陰性，1. 5 < P/n 2. 1的克隆為陽性克隆。P/n =肝癌!fepG2細胞孔0. D值/人胚腎HEK293細胞孔0. D值(用空白孔校T =100% )。(17)接種肝癌!fepG2細胞於96孔細胞培養板，重複以上ELISA實驗步驟，進一步鑑定陽性克隆與肝癌HepG2細胞的結合活性，排除假陽性克隆，比較陽性克隆與HepG2細胞親和力，每個克隆設8個復孔，同時設PBS對照和無關克隆對照。2. 2. 5陽性噬菌體克隆單鏈DNA快速純化(1)按上述噬菌體擴增方法，擴增陽性克隆，在第一步離心後，將500μ 1含噬菌體上清轉入新無菌1. 5ml離心管中。(2)加入200 μ 1 PEG/NaCl，反覆顛倒混勻，室溫放置IOmin。(3)4°C，12000rpm，離心15min，去上清，再次短暫離心，小心吸去殘餘上清。(4)沉澱物徹底重懸於100 μ 1碘化物緩衝液中，加入250 μ 1無水乙醇。室溫溫育 IOmin0短時間的室溫溫育使ssDNA沉澱而大多數噬菌體蛋白保持在溶液中。(5)41，10000印111，離心101^11，棄上清。用70%乙醇洗沉澱，短暫真空乾燥。(6)沉澱重懸於 30 μ 1 TEdOmM Tris-HCl (pH 8. 0)，ImM EDTA)中。2. 2. 6噬菌體單鏈DNA測序取5μ 1噬菌體陽性克隆、噬菌體原庫無關克隆對照和陰性克隆單鏈DNA作為模板，稀釋_96gIII測序引物5'-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，，送南京金絲瑞生物工程公司全自動測序。根據噬菌體展示試劑盒說明書讀序圖，利用DNAMar軟體找到Egal I 酶切位點CGGCCG和Kpn I酶切位點GGTACC，十二肽序列即插入這兩個酶切位點之間，找出編碼Gly-Gly-Gly的鹼基序列(GGT GGA GGT或CCA CCT CCA)其上遊36個鹼基為編碼十二肽的密碼子，按照十二肽庫的設計原則，每個密碼子的第三位均為G或T，驗證找到的鹼基序列是否正確，利用軟體得出模板鏈的鹼基序列，按照試劑盒說明書提供的三聯密碼子圖翻譯成多肽序列(參見圖2)。融合蛋白表達時N端有一段信號肽前導序列，蛋白分泌後前導序列被切除，使隨機肽直接位於成熟蛋白的N末端，下箭頭指示前導序列的切割位點。- 和-96引物的互補位置也在圖中標出。參見圖3，文庫的隨機序列區域僅用32個密碼子編碼所有20種胺基酸。這使單密碼子胺基酸的出現頻率相對較高，同時排除了三個終止密碼子中的兩個。在構建該文庫的菌株中，琥珀終止子TAG*可被Gln抑制。2. 2. 7陽性克隆胺基酸序列的同源性和特徵分析將翻譯的胺基酸序列通過NCBI/BLAST軟體同資料庫中蛋白質的胺基酸序列進行同源性分析，將出現頻率較高的序列用ExPASY提供的軟體ProtParam tools來分析12肽片段的組成及特點，利用FASTA工具來分析多肽序列的疏水性。2. 2. 8細胞免疫螢光法鑑定陽性噬菌體克隆的靶向性(1)細胞爬片的準備①將24mmX 24mm蓋玻片浸泡，洗潔精清洗，自來水衝洗，稀鹽酸浸泡他，流水衝洗，鉻酸浸泡過夜，流水衝洗，蒸餾水、三蒸水衝洗三次，置於玻璃培養皿中高壓滅菌，烘乾備用；②在6孔細胞培養板中滴加少量細胞培養基，用無菌操作，夾取蓋玻片，放入培養板孔中，使其貼附到孔底；③取生長狀態良好的肝癌H印G2細胞和人胚腎HEK293細胞，PBS衝洗一遍，胰蛋白酶消化收集細胞，細胞計數，接種至6孔細胞培養板孔中的蓋玻片上，4X105cellS/ml， lml/well，置於37°C，5% C02細胞培養箱，培養Mh。(2)免疫螢光檢測陽性噬菌體克隆的靶向性①待H印G2細胞和HEK293細胞培養至長滿單層，吸棄培養基，PBS衝洗3次，吸盡殘留液體，4%多聚甲醛室溫固定細胞，30min ；②用PBS 洗滌 5min X 3 次；③滴加3 % BSA室溫封閉濁；④棄封閉液，分別將展示CCSPl 4多肽的噬菌體陽性克隆滴加至細胞表面 (1X1010PFU)，37°C孵育 2h ；⑤PBS 洗滌 5minX5 次；⑥滴加抗Ml3多克隆抗體(工作濃度1 500)，37°C孵育濁；⑦PBS 洗滌 5minX5 次；⑧滴加FITC標記兔抗山羊IgG (工作濃度1 100)，37°C孵育Ih ；⑨PBS洗滌5minX3次，90%緩衝甘油封片，尼康Ti-S倒置顯微鏡鏡檢並拍照記錄。2. 2. 9統計學方法採用SPSS 16. O-GLM中的Univariate分析數據，數據均以士 SD表示，組間多重比較採用Duncan檢驗處理。P < 0. 01為差異極顯著，P 0. 05為無統計學意義。
三、實驗結果3.1噬菌體十二肽庫4輪消減篩選本發明是從噬菌體隨機十二肽庫中篩選出與人肝癌細胞親和力較高的噬菌體多肽，以人源肝癌HepG2細胞為靶細胞，以人胚腎細胞HEK293細胞為陰性吸附細胞，完成對噬菌體十二肽庫4輪消減篩選，回收與肝癌HepG2細胞結合的噬菌體，重複對陰性細胞的消減篩選以排除非特異克隆。在篩選過程中，嚴格控制每輪篩選中加入噬菌體的數量，以保證篩選結果的穩定性。噬菌體原庫的效價為1.5X1013pfu/ml，第一輪篩選投入噬菌體為 LsxiO11Pfu,回收噬菌體滴定後每輪儘量保證投入噬菌體量在l.SXKTpfu以上(如表 3-1和圖4所示)，通過4輪消減篩選，特異性克隆得到大量富集和擴增，為進一步挑取陽性克隆奠定良好的實驗基礎，提高了獲得具有高親和力噬菌體十二肽的可能性。表3-1四輪消減篩選中投入噬菌體量和回收噬菌體滴度
Round of biopanning Input phages(pfu)Output phages(pfu/ml)
權利要求
1.HepG2細胞表面特異性結合的多肽，其特徵在於，利用噬菌體展示隨機十二肽庫篩選得到4條多肽片段，其胺基酸序列分別為LLADTTHHRPffT ； LLADTPHHRPffT ； FGffVTPHHELRS ； SLSDLTHMGPffP0
2.如權利要求1所述的HepG2細胞表面特異性結合的多肽，其特徵在於，所述的4條多肽片段的胺基酸序列具有一定的同源性，其共有胺基酸序列為***D (V)TT(P)HH*P(L) W(R)*。
3.如權利要求1所述的HepG2細胞表面特異性結合的多肽，其特徵在於，所述的4條多肽片段均為親水性多肽。
4.如權利要求1所述的HepG2細胞表面特異性結合的多肽，其特徵在於，所述的4條多肽片段能夠特異性結合HepG2細胞，而不識別人胚腎HEK293細胞。
全文摘要
本發明公開了HepG2細胞表面特異性結合的多肽，利用噬菌體展示隨機十二肽庫篩選得到4條多肽片段，其胺基酸序列分別為LLADTTHHRPWT，LLADTPHHRPWT，FGWVTPHHELRS和SLSDLTHMGPWP。本發明利用噬菌體多肽展示技術篩選肝癌HepG2細胞結合的多肽序列，ELISA鑑定噬菌體克隆與肝癌細胞的親和力，獲得8個噬菌體克隆，測序獲得4條多肽序列，其共有胺基酸序列(基序)為***D(V)TT(P)HH*P(L)W(R)*，同源性分析表明多肽基序可能為腫瘤細胞表面受體結合的配體蛋白上的胺基酸決定簇，細胞免疫螢光進一步鑑定噬菌體陽性克隆的靶向性結果提示噬菌體陽性克隆能夠特異性結合HepG2細胞，篩選獲得的肝癌HepG2細胞特異性多肽為肝癌的早期診斷、抗腫瘤藥物的靶向運輸及靶向短肽藥物的研發提供實驗依據。
文檔編號C07K7/08GK102532272SQ20111045176
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者侯穎春, 尹田樂 申請人:陝西師範大學