一組篩選胰腺導管腺癌的基因組合及應用的製作方法

2023-05-03 16:07:16

專利名稱：一組篩選胰腺導管腺癌的基因組合及應用的製作方法
技術領城本發明屬生物技術，主要涉及一組基因組合，用於篩選胰腺導管腺癌。
背景技術：
胰腺癌是預後很差的惡性腫瘤。總體的中位生存時間不到6個月。5年生存率只有0.4-5％。外科切除腫瘤可提高生存期，手術切除腫瘤的病人的中位生存時間可達到11-20個月，5年生存率可達到7-25％。但由於胰腺癌病人缺乏早期的臨床表現。病人就診時多已屬晚期。
由於胰腺癌切除和活檢的手術風險較大，所以胰腺癌臨床標本並不容易得到，這就使得大部分胰腺癌病人得不到明確和及時的診斷，從而延誤了病人的治療。因此，如果能從胰腺癌病人的PBMC中找到腫瘤相關的基因，從而達到診斷腫瘤的目的，將很好地指導我們的臨床工作。
目前，CA199是最常使用的胰腺癌腫瘤標誌物。關於CA199的研究已很多。大多數研究結果認為，CA199的敏感性在80％左右，而特異性在60-70％左右，是目前能得到的最好的胰腺癌腫瘤標誌物。CA199升高還可發生在其他消化道惡性腫瘤，如胃癌、結腸癌、膽道系統惡性腫瘤；也可發生在良性病變，如胰腺炎、肝炎和肝硬化等。
目前還沒有理想的來自血液的胰腺癌腫瘤標誌物，尋找更好的胰腺癌病人血液中的腫瘤標誌物，具有很高的臨床應用價值。

發明內容
本發明的目的是提供一組篩選胰腺導管腺癌的基因組合，包括10個基因L48784、X83300、AI620827、AI494291、NM_020970、BF433657、J02959、BC022313、NM_000904、NM_004994。
本發明的另一個目的是提供該基因組合在篩選胰腺導管腺癌中的應用。
本發明通過檢測人類外周血單個核細胞的這組基因，可以從健康人群中篩選出胰腺癌病人，具體篩選步驟為1.按照Affymetrix基因表達譜晶片操作指南，使用AFFYMETRIXHUMAN GENOME U133 PLUS 2.0 ARRAY檢測這組基因在5名胰腺癌和5名正常人的外周血單個核細胞(PBMC)中的表達，得到基因表達的信號值；
2.5名胰腺癌病人外周血單個核細胞(PBMC)的平均信號值高於5名正常人的基因被認為是上調表達基因；5名胰腺癌的平均信號值低於5名正常人的基因被認為是下調表達基因；3.取上述10個外周血單個核細胞中基因表達信號值的中位值作為臨界值，以判斷受測試的PBMC的基因表達是上調還是下調表達；受測試的人的PBMC，在10個基因中有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌PBMC中上調或下調的表達趨勢相符合，就推測受測試的人為胰腺癌病人；如果在受測試的人的PBMC中，在10個基因中，有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌中上調或下調的表達趨勢不符合，就推測受測試的人為正常人。
本發明利用Affymetrix公司的基因表達譜晶片對胰腺癌病人外周血單個核細胞(PBMC，peripheral blood mononuclear cells)的表達譜和正常人外周血單個核細胞表達譜進行研究，篩選胰腺癌的腫瘤相關基因，為胰腺癌的臨床診斷和篩選提供新的途徑。在小樣本的實驗中已證明本實驗具有很高的敏感性和特異性。本發明的有益之處為(1)病人的血液是容易得到的樣本；(2)本發明的篩選方法是一種對人體無害的檢測方法；(3)小樣本高通量寡核苷酸表達譜晶片已證明這個基因組合具有很高的推測準確性(100％)。
具體實施例方式
本發明通過實施例作進一步的說明。
實施例11.按照Affymetrix基因表達譜晶片操作指南，使用AFFYMETRIXHUMAN GENOME U133 PLUS 2.0 ARRAY檢測這組基因在5名胰腺癌和5名正常人的PBMC中的表達，得到基因表達的信號值，(參見表1)。
表1


樣本分組情況胰腺癌組T1，T2，T3，T4，T5；正常人組N1，N2，N3，N4，N5，Public ID基因的公共號，T均數腫瘤樣本信號值的平均值，N均數正常對照樣本信號值的平均值，差2＝T均數-N均數，差2＞0表明基因在胰腺癌PBMC中上調表達，差2＜0說明基因在胰腺癌PBMC中下調表達。
符合判定標準取上述10個外周血單個核細胞中基因表達信號值的中位值作為臨界值，以判斷受測試的PBMC的基因表達是上調還是下調表達；受測試的人的PBMC，在10個基因中有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌PBMC中上調或下調的表達趨勢相符合，就推測受測試的人為胰腺癌病人；如果在受測試的人的PBMC中，在10個基因中，有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌中上調或下調的表達趨勢不符合，就推測受測試的人為正常人。
2.5名胰腺癌的平均信號值高於5名正常人的基因被認為是上調表達基因；5名胰腺癌的平均信號值低於5名正常人的基因被認為是下調表達基因。根據上表可以看出L48784、X83300、AI620827、AI49429、NM_020970是下調表達基因；而BF433657、J02959、BC022313、NM_000904、NM_004994是上調表達基因。
3.取上述10個PBMC中基因表達量檢測結果的中位值作為臨界值，以判斷受測試的PBMC的基因表達是上調還是下調表達；4.按照Affymetrix基因表達譜晶片操作指南，使用AFFYMETRIXHUMAN GENOME U133 PLUS 2.0 ARRAY檢測這組基因在受測試的人的PBMC中的表達，用上述篩選標準進行篩選受測試的人的PBMC，在10個基因中有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌PBMC中上調或下調的表達趨勢相符合，就推測受測試的人為胰腺癌病人；如果受測試的人的PBMC，在10個基因中有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌中上調或下調的表達趨勢不符合，就推測受測試的人為健康人群；本發明通過k倍交叉驗證推測這組10個基因組成的基因組合的診斷價值(參見實施例2-51)k倍交叉驗證是將樣本分成測試組和訓練組，通過訓練組樣本建立模型來對測試組樣本進行推測。重複k次後，再計算k次推測正確率的平均正確率，即得此模型最後的正確率。
根據全部25種可能的排列組合，本實驗以25組交叉驗證的方式，將樣本分成25組，每組有8個樣本(4個癌和4個正常)當訓練樣本，其餘2個為測試樣本。用訓練組樣本建立篩選標準(見表2-51)，來推測測試組樣本是否為癌的正確率。
在表2-51中各種縮寫的含義差1＝受測樣本-中位數的信號值，T均數腫瘤樣本信號值的平均值，N均數正常對照樣本信號值的平均值，差2＝T均數-N均數，差2＞0表明基因在胰腺癌PBMC中上調表達，差2＜0說明基因在胰腺癌PBMC中下調表達，中位數訓練組8個PBMC中基因表達量的信號值的中位數。
「符合」判定標準取訓練組8個PBMC中基因表達量檢測結果的中位值作為臨界值，以判斷受測試的PBMC的基因表達是上調還是下調表達；在測試組中，受測試的人的PBMC，在10個基因中有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌PBMC中上調或下調的表達趨勢相符合，就推測受測試的人為胰腺癌病人；如果受測試的人的PBMC，在10個基因中有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌中上調或下調的表達趨勢不符合，就推測受測試的人為健康人群；(簡而言之，差1和差2的同為負數或同為正數，則判定符合；否則，判定為不符合。)實施例2操作參照實施例1，結果參見表2。
表2.交叉驗證1-1


表2中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌。
實施例3操作參照實施例1，結果參見表3。
表3.交叉驗證1-2

表3中不符合率為9/10。推測受測樣本為正常人。
實施例4操作參照實施例1，結果參見表4。
表4.交叉驗證2-1

表4中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌。
實施例5操作參照實施例1，結果參見表5，表5.交叉驗證2-2

表5中不符合率為7/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例6操作參照實施例1，結果參見表6。
表6.交叉驗證3-1


表6中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例7操作參照實施例1，結果參見表7。
表7.交叉驗證3-2

表7中符合率為9/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例8操作參照實施例1，結果參見表8，表8.交叉驗證4-1


表8中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌。
實施例9操作參照實施例1，結果參見表9，表9.交叉驗證4-2

表9中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例10操作參照實施例1，結果參見表10，表10.交叉驗證5-1

表10中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例11操作參照實施例1，結果參見表11，表11.交叉驗證5-2


表11中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例12操作參照實施例1，結果參見表12，表12.交叉驗證6-1

表12中符合率為8/10。推測受測樣本為胰腺癌。
實施例13操作參照實施例1，結果參見表13，表13交叉驗證6-2


表13中不符合率為9/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例14操作參照實施例1，結果參見表14，表14.交叉驗證7-1

表14中符合率為8/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例15操作參照實施例1，結果參見表15，表15.交叉驗證7-2


表15中不符合率為9/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例16操作參照實施例1，結果參見表16，表16交叉驗證8-1

表16中符合率為8/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例17操作參照實施例1，結果參見表17，表17.交叉驗證8-2

表17中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例18操作參照實施例1，結果參見表18，表18.交叉驗證9-1

表18中符合率為8/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例19操作參照實施例1，結果參見表19，表19交叉驗證9-2

表19中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例20操作參照實施例1，結果參見表20，表20.交叉驗證10-1


表20中符合率為8/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例21操作參照實施例1，結果參見表21，表21.交叉驗證10-2

表21中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例22操作參照實施例1，結果參見表22。
表22.交叉驗證11-1


表22中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例23操作參照實施例1，結果參見表23。
表23.交叉驗證11-2

表23中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例24操作參照實施例1，結果參見表24。
表24交叉驗證12-1

表24中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例25操作參照實施例1，結果參見表25。
表25交叉驗證12-2


表25中不符合率為7/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例26操作參照實施例1，結果參見表26。
表26.交叉驗證13-1

表26中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例27操作參照實施例1，結果參見表27。
表27.交叉驗證13-2


表27中不符合率為9/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例28操作參照實施例1，結果參見表28。
表28交叉驗證14-1

表28中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例29操作參照實施例1，結果參見表29。
表29.交叉驗證14-2

表29中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例30操作參照實施例1，結果參見表30。
表30交叉驗證15-1


表30中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例31操作參照實施例1，結果參見表31。
表31.交叉驗證15-2

表31中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例32操作參照實施例1，結果參見表32。
表32交叉驗證16-1


表32中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例33操作參照實施例1，結果參見表33。
表33交叉驗證16-2

表33中不符合率為9/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例34操作參照實施例1，結果參見表34。
表34.交叉驗證17-1


表34中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例35操作參照實施例1，結果參見表35。
表35.交叉驗證17-2

表35中符合率為7/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例36操作參照實施例1，結果參見表36。
表36.交叉驗證18-1

表36中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例37操作參照實施例1，結果參見表37。
表37交叉驗證18-2


表37中不符合率為9/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例38操作參照實施例1，結果參見表38。
表38.交叉驗證19-1

表38中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例39操作參照實施例1，結果參見表39。
表39.交叉驗證19-2


表39中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例40操作參照實施例1，結果參見表40。
表40.交叉驗證20-1

表40中符合率為10/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例41操作參照實施例1，結果參見表41。
表41.交叉驗證20-2

表41中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例42操作參照實施例1，結果參見表42。
表42.交叉驗證21-1


表42中符合率為9/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例43操作參照實施例1，結果參見表43。
表43.交叉驗證21-2

表43中不符合率為9/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例44操作參照實施例1，結果參見表44。
表44.交叉驗證22-1


表44中符合率為9/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例45操作參照實施例1，結果參見表45。
表45.交叉驗證22-2

表45中不符合率為7/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例46操作參照實施例1，結果參見表46。
表46.交叉驗證23-1

表46中符合率為9/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例47操作參照實施例1，結果參見表47。
表47.交叉驗證23-2


表47中不符合率為9/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例48操作參照實施例1，結果參見表48。
表48.交叉驗證24-1

表48中符合率為9/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例49操作參照實施例1，結果參見表49。
表49.交叉驗證24-2


表49中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
實施例50操作參照實施例1，結果參見表50。
表50.交叉驗證25-1

表50中符合率為9/10。推測受測樣本為胰腺癌病人的PBMC。
實施例51操作參照實施例1，結果參見表51。
表51.交叉驗證25-2


表51中不符合率為10/10。推測受測樣本為正常人的PBMC。
本發明涉及的序列110浙江大學120一組篩選胰腺導管腺癌的基因組合及應用16010170Patent In Version 2.12101211220213人4001L487841 gaatcagaga tcattgattt cttcctgggg gcctctctca aggatgaggt tttgaagatt61 atgccagtgc agaagcagac ccgtgccggc cagcgcacca ggttcaaggt acccggctgt121 cctgggaggg ggctgcgctg ggcttgccgg gactctctcg gctctgcata gttgcacttg181 gcttcacccg tgtgactttc gtaacgggga gagagagaaa21022111295213人4002X833001 gtgaaagagc aggttctgct tctttggtgt agtcctgaag cttcctaaga aacttcacat61 caggtgatgg ataggagcaa ccctgtaaaa ccagccttag actatttttc aaacaggctg121 gtgaattacc agatctccgt caagtgcagt aaccagttca agttggaagt gtgtcttttg181 aatgcagaaa acaaagtcgt ggacaaccag gctgggaccc agggccagct gaaggtgctg241 ggtgccaacc tctggtggcc gtacctgatg cacgaacacc ccgcctacct gtactcgtgg301 gaggatggtg attgctcaca ccaaagcctt ggacccctcc cagcctgtga cctttgtgac361 caactccacc tacgcagcag acaagggggc tctgtatgtg gatgtgatcc gtgtgaacgg421 ctactactct tggtatcgca actacgggca cctggagttg attcagctgc agctggccgc481 ccagtttgag aattggtgta agacatcaca atcccattat tcagagcgcg tatggagtgg541 aaacgcttgt agggtttcac caggtaagcg gtgttgaact ttctgcttgt gtattctctc601 tgggcagaga tgccacttgc ctcccccacc atgccatctc tgaagaatat tacagaccat661 tttggagcat ggtgaataag aaattttcac cttaggagtt cagttgaata gtcattttta721 tatttgtgac tgcaagtcac tcttaggggc tgtacttcct tagtactggt agcattatta781 tccaatggac ttttatagct ttcattaggt tttcttttgt ttttgttctt taaagaacgt841 tttacttatc ttagtatttc atttttcatc tatattatga ggcagtaaga gtcttctgtt
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權利要求
1.一組篩選胰腺導管腺癌的基因組合，其特徵是由L48784、X83300、AI620827、AI494291、NM_020970、BF433657、J02959、BC022313、NM_000904、NM_004994十個基因組合，分別具有SEQ ID NO1～SEQ ID NO10的基因序列。
2.根據權利要求1所述的一組篩選胰腺導管腺癌的基因組合在篩選胰腺導管腺癌中的應用。
3.根據權利要求2所述的一組篩選胰腺導管腺癌的基因組合在篩選胰腺導管腺癌中的應用，通過以下技術方案實現(1)建立篩選標準按照Affymetrix基因表達譜晶片操作指南，使用AFFYMETRIX HUMAN GENOME U133 PLUS 2.0 ARRAY檢測這組基因在5名胰腺癌患者和5名正常人的外周血單個核細胞中的表達，得到基因表達的信號值；(2)5名胰腺癌患者外周血單個核細胞的平均信號值高於5名正常人的基因被認為是上調表達基因；5名胰腺癌患者的平均信號值低於5名正常人的基因被認為是下調表達基因；(3)取上述10個外周血單個核細胞中基因表達信號值的中位值作為臨界值，以判斷受測試的外周血單個核細胞的基因表達是上調還是下調表達；受測試的人的外周血單個核細胞，在10個基因中有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌外周血單個核細胞中上調或下調的表達趨勢相符合，就預測受測試的人為胰腺癌病人；如果受測試的人的外周血單個核細胞，在10個基因中有7個或7個以上的基因表達情況與這些基因在胰腺癌中上調或下調的表達趨勢不符合，就預測受測試的人為正常人。
全文摘要
本發明提供一組篩選胰腺導管腺癌的基因組合，包括10個基因L48784、X83300、AI620827、AI494291、NM_020970、BF433657、J02959、BC022313、NM_000904、NM_004994。本發明提供的基因組合在篩選胰腺導管腺癌中的應用。本發明通過檢測人類外周血單個核細胞的這組基因，可以從健康人群中篩選出胰腺癌病人。本發明的篩選方法是一種對人體無害的檢測方法；本發明的篩選方法設計合理，為胰腺癌的臨床診斷和篩選提供新的途徑，且具有很高的敏感性和特異性。
文檔編號C12Q1/68GK1904072SQ200610052679
公開日2007年1月31日 申請日期2006年7月28日 優先權日2006年7月28日
發明者吳育連, 燕海潮 申請人:浙江大學