提高井岡黴素發酵水平的方法
2023-05-03 15:07:21
提高井岡黴素發酵水平的方法
【專利摘要】一種提高井岡黴素發酵水平的方法，通過在吸水鏈黴菌井岡變種5008中雙缺失轉錄負調控基因SHJG7318和SHJG4003，實現井岡黴素產量和產率的提高。本發明所得到工程菌株井岡黴素的發酵產量提高50％以上，抗生素合成速率加快，生產率由2.1克／升／天提高到4.1克／升／天，提高幅度近一倍。
【專利說明】提高井網黴素發酵水平的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程，尤其涉及一種提高井R黴素發酵水平的方法。
【背景技術】
[0002]放線菌是一類高GC含量的革蘭氏陽性菌，目前已知抗生素中有60%以上是由放線菌合成。鏈黴菌是一類高等放線菌，具有強大的抗生素合成能力和複雜的形態分化，故一直受到人們的關注。自上世紀六十年代，有關以A因子為代表的Y-丁內酯類自誘導信號分子在鏈黴菌次級代謝與分化中的作用及其機制，已有大量報導。但是，在不同鏈黴菌中其調控作用和方式也不盡相同，尚存在不少需要深入研究的科學問題。深入研究Y-丁內酯調控系統對鏈黴菌工業菌株的次級代謝的調控作用及其機制，將為如何利用代謝調控和代謝工程來提高抗生素的工業發酵水平提供重要的理論指導。 [0003]井R黴素，又稱有效黴素，是一種由吸水鏈黴菌井R亞種5008(簡稱5008)產生的C7N氨基環醇類抗生素。由於井R黴素能抑制真菌生長，可高效防治水稻紋枯病，故被廣泛用於我國和亞洲其他水稻產區。此外，井R黴素及有效氧胺等其他井R黴素生物合成的中間產物都可用於生產治療II型糖尿病的藥物。鑑於井R黴素的重要性，本 申請人:在2005年鑑定完成了井R黴素生物合成基因簇，2012年完成了 5008的全基因組測序。通過對基因組進行分析，在其染色體上找到了多套包括A因子受體蛋白在內的相關的A因子調控網絡相關的同源基因，這暗示5008中可能存在類A因子級聯繫統；並且類A因子級聯繫統可能參與了井R黴素生物合成的調控。
[0004]通過文獻調研，我們發現提高valABC等井R黴素合成基因簇中結構基因的轉錄水平是井岡黴素高產的必要條件，並且AdpA同源蛋白AdpA-H作為全局調控蛋白能正調控valABC基因的轉錄。adpA基因的轉錄一般受A因子受體蛋白的負調控，為此通過解除轉錄負調控蛋白的抑制作用，增強adpA-Η的表達水平，進而提高基因簇轉錄水平，可能是值得嘗試的一種提高井R黴素發酵水平的策略。目前已知所有的A因子受體蛋白都是TetR轉錄調控家族的成員，而TetR在細菌中可以通過抑制轉錄進而調控次級代謝。前期的研究表明通過基因工程的方法對這些TetR基因進行改造可以提高抗生素合成的水平。在鏈黴菌的類A因子調控系統中，通過失活受體蛋白如BarA、FarA和TylP，的確可上調抗生素合成基因簇的轉錄水平，進而有效的提高抗生素的產量。然而對於5008中這種多套A因子受體蛋白同源基因的調控系統而言，是否可以通過多基因的缺失來增加井網黴素合成基因簇的轉錄水平，最終進一步的提高抗生素的發酵水平並不清楚。為此，本發明嘗試通過多基因缺失找到提高井R黴素高產的方法，以助於降低井R黴素工業化生產的成本。
【發明內容】
[0005]本發明的目的，在於提供一種提高井R黴素發酵水平的方法，通過解除轉錄負調控基因的抑制作用，提高井R黴素合成基因簇的轉錄水平來實現井R黴素的高產。
[0006]為了達到上述目的，本發明採用了以下技術方案:[0007]—種提高井R黴素發酵水平的方法，是通過在吸水鏈黴菌井R亞種5008染色體上引入基因突變，導致轉錄負調控基因SHJG7318和SHJG4003的雙失活，使井R黴素在發酵中的產量得以提高；具體步驟如下:
[0008]第一步:設計並構建用於SHJG7318進行失活的同源重組質粒載體I和用於SHJG4003失活的同源重組質粒載體II ；
[0009]第二步:將第一步構建得到的質粒載體I結合轉移導入受體菌吸水鏈黴菌5008井岡亞種中進行同源重組；
[0010]第三步:通過對突變株的篩選和驗證硫鏈絲菌素抗性驗證，並通過PCR產物片段大小的差異篩選得到SHJG7318突變株；
[0011]第四步:將第一步構建得到的質粒載體II結合轉移導入第三步構建得到的SHJG7318突變株中進行同源重組；
[0012]第五步:通過對突變株的篩選和驗證硫鏈絲菌素抗性驗證，並通過PCR產物片段大小的差異篩選得到SHJG7318和SHJG4003的雙缺失突變株。
[0013]所述質粒載體I的構建方法是:在質粒PJTU1278的EcoRI / SacI位點插入來自SHJG7318左臂1.57kb PCR片段和SHJG7318右臂1.47kb PCR片段；所述質粒載體II的構建方法是:在PJTU1278的KpnI / SacI位點插入來自SHJG4003左臂1.48kb PCR片段和SHJG4003 右臂 1.49kb PCR 片段。
[0014]所述發酵是指，將鏈黴菌孢子或者菌絲體在種子培養基中於37攝氏度，220轉/分鐘的轉速下培養15~20小時後轉接發酵培養基發酵120小時。
[0015]所述種子培養基含有以下重量百分含量的成份:玉米粉3%、豆柏粉2.2%、酵母提取物I %、氯化鈉0.2 %、磷酸二氫鉀0.08% ;所述發酵培養基含有以下重量百分含量的成份::玉米粉10 %、豆柏粉2.5%、酵母提取物0.5%、氯化鈉0.1 %、磷酸二氫鉀0.15%。
[0016]種子培養物按10%的接種量轉接於發酵培養基。
[0017]上述SHJG7318基因的序列如SEQ ID N0.1所示；SHJG4003基因的序列如SEQIDN0.2 所示。
[0018]本發明通過在染色體上置換的方法，使得A因子受體蛋白家族轉錄調控基因SHJG7318和SHJG4003雙缺失。本發明所得到的工程菌株其井R黴素的產量都大幅提高。
[0019]本發明具有以下效果:本發明可以解除調控蛋白對井R黴素合成基因簇轉錄的抑制，使井R黴素的合成基因轉錄水平提高，最終井R黴素測發酵產量提高了 50%以上，產率由2.1克/升/天提高到4.1克/升/天，通過本發明可顯著提高井R黴素的發酵效率，同時使發酵成本大幅降低。
[0020]本發明所涉及的菌株吸水鏈黴菌5008已經SCI資料庫文獻《Bai L，Li L，Xu H，Minagawa K, Yu Y, ZhangY, Zhou X, Floss HG, Mahmud T, Deng Z !Functional analysisof the validamycin biosynthetic gene cluster and engineered production ofvalidoxylamine A.Chemistry and Biology2006,13 (4):387-397.》中公開 [0021]本發明所涉及的質粒pJTU1278已經在SCI資料庫文獻《He Y,Wang Z7Bai L7LiangJ, Zhou X, Deng Z:Two pHZ1358derivative vectors for efficient gene knockout inStreptomyces.Journal of Microbiology and Biotechnology2010,20(4):678-682.》中公開。【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為野生型菌株5008基因失活衍生得到雙缺失菌株的示意圖；
[0023]其中的質粒pLQ204將野生型菌株5008中的SHJG7318基因失活，得到單基因突變株Λ SHJG7318 ;質粒pLQ207將突變株Λ SHJG7318中的SHJG4003基因失活，得到基因雙缺失菌株 ASHJG7318 / 4003 ；
[0024]圖2為雙缺失菌株全局調控基因adpA-Η的轉錄變化示意圖；
[0025]圖3為雙缺失菌株井岡黴素合成基因valABC的轉錄變化示意圖；
[0026]圖4為基因缺失突變株與野生型菌株5008的井R黴素發酵產量示意圖。
【具體實施方式】
[0027]以下實施例將結合附圖對本發明進一步作說明。本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，並給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。下列實施例中未註明具體條件和實驗方法的，按照常規條件或製造廠商的建議條件。
[0028]實施例1
[0029]步驟一:質粒pL Q204和pLQ207的構建
[0030]以吸水鏈黴菌5008的基因組DNA為模板，分別使用兩組引物7318upF / 7318upR、7318dnF / 7318dnR通過PCR擴增得到SHJG7318左側1.29kb的同源臂及右側1.34kb的同源臂，通過基因測序確認同源臂的正確性；在質粒PJTU1278的EcoRI / SacI位點插入來自 SHJG7318 左臂 1.29kb PCR 片段(EcoRI / HindIII)和 SHJG7318 右臂 1.34kb PCR 片段(HindIII / SacI);通過上述方法得到用於SHJG7318基因缺失的質粒pLQ204。在37攝氏度水浴條件下，採用SacI，HindIII和EcoRI三種限制性內切酶進行酶切處理可以觀察到
1.34kb和1.27kb的兩條目標條帶，表明質粒構建正確。
[0031]以吸水鏈黴菌5008的基因組DNA為模板，分別使用兩組引物arp3_up_F / arp3_up_R、arp3_dw_F / arp3_dw_R通過PCR擴增得到SHJG4003左側1.48kb的同源臂及右側1.49kb的同源臂，通過基因測序確認同源臂的正確性；其構建方法是在PJTU1278的KpnI / SacI 位點插入來自 SHJG4003 左臂 1.48kb PCR片段(KpnI / HindIII)和 SHJG4003右臂1.49kb PCR片段(HindIII / SacI);通過上述方法得到用於SHJG7318基因缺失的質粒PLQ207。在37攝氏度水浴條件下，採用SacI和KpnI兩種限制性內切酶進行酶切處理可以觀察到目標條帶，表明質粒構建正確。
[0032]步驟二:將用於和染色體發生重組的質粒pLQ204導入野生型菌株5008，並篩選得到SHJG7318基因缺失突變株。
[0033]圖1A示意了 SHJG7318缺失的過程。具體操作如下:將已構建完成用於基因缺失的質粒PLQ204轉化進入宿主ET12567(含有pUZ8002質粒)中。取ET12567於含有Amp，Kan和Chi三種抗生素的LB中於37°C過夜培養，用相同的培養基，將過夜培養物按10%的比例轉接一次並培養2.5小時，然後用新鮮的LB溶液漂洗菌體以除去培養物中的抗生素。於此同時製備野生型菌株5008的新鮮孢子約109個，用TES溶液漂洗2~3次之後再用2mLTES溶液懸浮孢子，於50°C熱激IOmin後再冷卻至室溫，等體積加入2 X孢子預萌發培養液後於37°C培養3小時。將預萌發的孢子液與之前製備的宿主菌ET12567混合(孢子和宿主菌的比例約為10: I)均勻後塗布於SFM平板，待平板吹乾後轉移至30°C培養箱正置培養16小時後取出平板，分別取Thio和萘啶酮酸兩種抗生素的儲存液40μ L和12yL加入1.5mL無菌水中混勻後覆蓋在SFM平板上，將平板晾乾後轉移至30°C培養箱中培養。一般3~5天後可見平板上有單菌落結合子長出，採用7318YZF / 7318YZR為引物，通過菌絲體PCR和抗性驗證的方法驗證結合子正確後劃線接種至SFM平板，30°C培養至產孢，收集孢子後按稀釋107~108後接種至SFM平板培養2~3天可得到單菌。繼續採用7318YZF /7318YZR為引物，通過菌絲體PCR的方法對單菌落篩選得到SHJG7318基因缺失突變株。
[0034]上述步驟二中所用到的引物序列如表1所示:
[0035]表1
[0036]
【權利要求】
1.一種提高井R黴素發酵水平的方法，其特徵在於:通過在吸水鏈黴菌井R亞種5008染色體上引入基因突變，導致轉錄負調控基因SHJG7318和SHJG4003的雙失活，使井R黴素在發酵中的產量得以提高；具體步驟如下: 第一步:設計並構建用於SHJG7318進行失活的同源重組質粒載體I和用於SHJG4003失活的同源重組質粒載體II ; 第二步:將第一步構建得到的質粒載體I結合轉移導入受體菌吸水鏈黴菌5008井岡亞種中進行同源重組； 第三步:通過對突變株的篩選和驗證硫鏈絲菌素抗性驗證，並通過PCR產物片段大小的差異篩選得到SHJG7318突變株； 第四步:將第一步構建得到的質粒載體II結合轉移導入第三步構建得到的SHJG7318突變株中進行同源重組； 第五步:通過對突變株的篩選和驗證硫鏈絲菌素抗性驗證，並通過PCR產物片段大小的差異篩選得到SHJG7318和SHJG4003的雙缺失突變株。
2.如權利要求1所述的提高井R黴素發酵水平的方法，其特徵在於:所述質粒載體I的構建方法是:在質粒PJTU1278的EcoRI / SacI位點插入來自SHJG7318左臂1.57kb PCR片段和SHJG7318右臂1.47kb PCR片段；所述質粒載體II的構建方法是:在PJTU1278的KpnI / SacI 位點插入來自 SHJG4003 左臂 1.48kb PCR 片段和 SHJG4003 右臂 1.49kb PCR片段。
3.權利要求1所述提高井R黴素發酵水平的方法，其特徵在於:所述發酵是指，將鏈黴菌孢子或者菌絲體在種子培養基中於37攝氏度，220轉/分鐘的轉速下培養15~20小時後轉接發酵培養基發酵120小時。
4.如權利要求3所述的提高井R黴素發酵水平的方法，其特徵在於:所述種子培養基含有以下重量百分含量的成份:玉`米粉3%、豆柏粉2.2%、酵母提取物I %、氯化鈉0.2%,磷酸二氫鉀0.08% ;所述發酵培養基含有以下重量百分含量的成份:玉米粉10%、豆柏粉2.5%、酵母提取物0.5%、氯化鈉0.1 %、磷酸二氫鉀0.15%。
5.如權利要求3所述的提高井網黴素發酵水平的方法，其特徵在於:種子培養物按10%的接種量轉接於發酵培養基。
【文檔編號】C12R1/55GK103740789SQ201410009500
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月9日
【發明者】譚高翼, 白林泉, 鍾建江 申請人:上海交通大學