禾草花粉過敏原的分離和提純方法
2023-05-04 01:41:11 3
專利名稱：禾草花粉過敏原的分離和提純方法
技術領域：
本發明涉及從禾草花粉中快速而有效地分離和提純1、2、3、10和13型這5種過敏原的方法。用來提純過敏原的天然原料是甜草類，例如梯牧草(Phleum pratense)的花粉。其提純基於疏水作用色譜法、凝膠過濾和陽離子交換色譜法的新型組合。如此獲得的蛋白質可用於改進花粉過敏的診斷並可用於花粉過敏疾病治療的藥物製劑。
1型過敏具有世界範圍的重要性。工業化國家人口中高達20％的人受到諸如過敏性鼻炎、結膜炎或支氣管哮喘的困擾，這都是由存在於空氣中的各種過敏原(空氣過敏原)所致，這些過敏原是由各種各樣的來源釋放的，例如植物、蟎蟲、貓或狗。這些1型過敏患者中，高達40％又表現出在禾草花粉過敏原情況下的特異IgE反應(Freidhoff等人，1986，J Allergy Clin Immunol 78，1190～201)。
誘發1型過敏的物質是蛋白質、糖蛋白或多肽。經黏膜攝入之後，這些過敏原便與過敏者的肥大細胞表面上鍵合的IgE分子起反應。如果兩個或更多個IgE分子通過一個過敏原彼此連接起來，則導致由效應細胞分泌出遞質(例如組胺、前列腺素)和細胞因子，並從而產生相應的臨床症狀。
根據具有抗特定過敏原的IgE抗體的過敏患者的相對頻率，可劃分為主要和次要過敏原。在梯牧草的情況下，Phl p1(Petersen等人，1993，J Allergy Clin.Immunol.92，789～796)、Phl p 5(Matthiesen和Lwenstein，1991，Clin.Exp.Allergy，21，297～307；Petersen等人，1992)、Phl p 6(Petersen等人，1995，Int.Arch.AllergyImmunol，108，49～54)以及Phl p 2/3(Dolecek等人，1993)迄今已被表徵為主要過敏原；而Phl p 4(Lwenstein，1978，Prog.Allergy25，1～62)和來自黑麥草(Lolium perenne)的10及11型(Ansari等人，1987，J.Allergy Clin.Immunol.80，229～235)則作為次要過敏原。另外，最近又公開了另一種高分子量主要過敏原，被命名為Phlp 13。1和13型過敏原是被糖基化的。
聯繫到本發明，1、2、3、10和13型過敏特別重要。天然過敏原的現行提純方法基於在每種情況下個別蛋白質的分離。藉助採用特異抗體的親和色譜法，目前已提純出，例如來自黑麥草(Boutin等人，1996，Int.Arch.Allergy Immunol.112，218～225)和梯牧草(Grobe等人，1999，Eur.J.Biochem.263，33～40)的1型過敏原。然而該方法的能力有限，並且是採用極端pH值條件實施的，因此不能保證獲得天然構象。其它方法是基於色譜步驟的各種多級組合順序。此時可獲得每種情況的個別過敏原，例如10型(Ansari等人，1987，J.Allergy Clin.Immunol.80，229～235)或3型(Ansari等人，1989，Biochemistry，28，8665～8670)。其它過敏原則被丟失或者不能用這類方法製備純淨形式。
DNA序列數據是現成的，尤其是關於Phl p 1的(Laffer等人，1994，J.Allergy Clin.Immunol.94，1190～98；Petersen等人，1995，J.Allergy Clin.Immunol.95(5)，987～994)、Phl p 5的(Vrtala等人，1993，J.Immunol.151(9)，4773～4781)、Phl p 6的(Petersen等人，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108(1)，55～59)以及Phl p2的(Dolecek等人，1993，FEBS 335(3)，299～304)。藉助cDNA序列，就可能生產出在診斷和治療中使用的重組過敏原(Scheiner和Kraft，1995，Allergy 50，384～391)。
對過敏進行有效治療的經典做法是特異性免疫療法或減敏療法(Fiebig，1995，Allergo J.4(6)，336～339；Bousquet等人，1998，J.Allergy Clin Immunol.102(4)，558～562)。在這些方法中，患者接受劑量遞增的天然過敏原提取物的皮下注射。然而，該方法會帶來過敏反應或甚至過敏性休克的危險。為了最大限度減少此種危險，可採用類變應原形式的創新製劑。它們是比未處理提取物明顯減少IgE反應性但T-細胞反應性相同的化學改性過敏原提取物(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377～382)。
若有高度提純的過敏原，可更大程度地達到療效的優化。來自天然過敏原的規定混合物能夠代替上述提取物，因為後者，除了含有各種各樣過敏原之外還含有相對大量的免疫原性但非變應性的伴生蛋白質，該蛋白質並非該特異性免疫療法所必須的。使用過敏原混合物還使得製備對應於患者過敏譜的患者-特異過敏原混合物成為可能。用高純度天然過敏原達到安全減敏目的的現實前景是由改性過敏原提供的，其中IgE抗原決定簇因二級和三級結構的不可逆改性而被破壞，但不會損害療效所必需的T-細胞抗原決定簇。
本發明也可有利地用於過敏性疾病，特別是花粉熱的體外和體內診斷。為此，在用來檢測IgE抗體的成熟方法中，使用各類提純的過敏原。
本發明涉及一種生化提純方法，它通過高效三級提純從水性短期花粉提取物中分離4種主要過敏原和1種次要過敏原。所使用的天然原料是禾本科花粉，例如，梯牧草(Phleum pratense)、黑麥草(Lolium perenne)、鴨茅(Dactylis glomerata)、草地早熟禾(Poa pratensis)、絆根草(Cynodon dactylon)、絨毛草(Holcuslanatus)等。
圖1表示出從禾草花粉提取物中提純所提到的5種過敏原的流程。過敏原名稱Phl p 1～Phl p 13對應於本文中其它地方使用的過敏原1～13的名稱。
因此，本發明涉及一種分離基本純淨的1、2、3、10和13型禾草過敏原的方法，其中製備一種禾本科花粉的水性提取物，然後可溶性組分接受疏水作用色譜法處理、凝膠過濾步驟，以及如果需要的話，陽離子交換色譜法處理。
按照本發明，也可實施一類色譜術的多個步驟，然而一般而言，該方法非常有效，以致每種情況下一個分離步驟就足夠了。
該方法尤其適合從物種梯牧草(Phleum pratense)、黑麥草(Lolium perenne)、鴨茅(Dactylis glomerata)、牛尾草(Festucapratensis)、絨毛草(Holcus lanatus)、草地早熟禾(Poa pratensis)、黑麥(Secale cereale)的花粉中提取所述過敏原。
在優選的實施方案中，利用tris/HCl緩衝水溶液來進行提取。然而，按照本發明也可使用其它已知的緩衝水溶液。
為提純所述過敏原，採用提取物的可溶性組分。為此，提取物在18,000～30,000×g下離心3～8min、優選5min，然後取上清液以做進一步提純。此外也可通過其它方法，例如用過濾，分離掉不溶解組分。
第一色譜提純步驟採用疏水作用色譜法，例如用Sepharose實施。在該步驟中，大量雜質被固定在載體上，而所需要的過敏原則處於流過色譜柱的級分中。也可使用相應的其它載體材料。
因此，本發明涉及一種相應的方法，其中1、2、3、10和13型禾草過敏原藉助於疏水作用色譜法與其它組分分離開來。
在隨後的提純步驟中，禾草過敏原被分成三個級分，其中1型和13型各代表一個級分，而2、3和10型則代表第3級分。因此，本發明特別是涉及這樣一種方法，其中1和13型過敏原在隨後的凝膠過濾步驟中作為單獨的級分得到，並與2、3和10型過敏原分離開來。
然後，按照本發明，後者可以利用隨後的色譜步驟通過陽離子交換劑彼此分離開來。因此，本發明涉及這樣一種方法，其中在凝膠過濾步驟後獲得的2、3和10型過敏原藉助隨後的陽離子交換色譜法彼此分離開來。
所述過敏原，鑑於本身是已知的，故可通過其已知的不同物理、化學、生物學或免疫學性質加以鑑別，特別是利用等電聚焦、紫外吸收測定、SDS-PAGE電泳以及特異性抗體。這些方法和技術是已知的並普遍描述過。
按照本發明獲得的過敏原的得率，以最初使用的禾草花粉總蛋白為基準介於0.5～1.5％。
本發明也可用於改進體內和體外診斷，作為分辨過敏原組分的患者-特異性過敏譜鑑別的一部分。因此，本發明涉及一種利用按權利要求1～6獲得的過敏原來實現花粉過敏體內和體外診斷的方法。
本發明還可用於製備禾草花粉過敏特異性免疫療法用的改良製劑，這是通過分離掉那些雖是致免疫的、但與該療法無關的提取物組分來實現的。此外還可以通過提純後過敏原的化學反應來製取類變應原製劑。因此，本發明還涉及一種藥物製劑，它包含一種或多種按照本發明方法製取的過敏原以及，如果需要的話，相應的助劑和賦形劑。
該方法詳細內容如下
來自梯牧草花粉的天然過敏原按三步法(見圖1)進行提純。將花粉用tris/HCl緩衝溶液(20mM tris/HCl，1mM EDTA，pH8.0)進行30min水相提取之後，通過離心分離提取物，優選20,000×g進行5min。該tris/HCl緩衝溶液(20mM tris/HCl，1mM EDTA，pH8.0)的上清液用1M硫酸銨處理，隨後接受疏水作用色譜法處理(高效苯基-瓊脂糖凝膠(Phenyl-Sepharose High Performance)，Pharmacia出品)。在典型的色譜柱中裝填50～100ml載體材料，並在約5ml/min的流速下進行操作。流過色譜柱的級分包含五種過敏原類別的蛋白質1型(30～35kDa)、2型(11kDa)、3型(12kDa)、10型(13kDa)和13型(55～60kDa)。這之後是減少其體積，優選用超濾或冷凍乾燥。
隨後在第二步中，根據其不同的分子量，採用Superdex75製劑級(Pharmacia出品)或者適合此目的的類似已知載體材料通過凝膠過濾將13和1型過敏原從低分子量過敏原中分離出來。洗脫介質優選是50mM的碳酸氫銨。在約5ml/min的流速下操作色譜柱。獲得3個級分，分別包含過敏原1和13(各一個單獨級分)以及2、3和10(在一個級分中)。
一同洗脫到凝膠過濾的第3級分中的低分子量2、3和10型過敏原，用陽離子交換色譜法彼此分開。為此，凍幹的樣品被溶解在水性緩衝液中，優選20mM的磷酸鹽緩衝液，pH7.2，然後加入到與此種緩衝液(例如，Source S)處於平衡的陽離子交換柱中。流過交換柱的級分包含酸性過敏原2。被結合的過敏原3和10在約20倍於柱體積的洗脫過程中依靠0～500mM NaCl鹽梯度先後被洗脫下來。由此，各類低分子量過敏原被分離為其各自的單獨過敏原。其它陽離子交換劑材料也可用於本發明中。
鑑於本發明方法的特徵在於特定的色譜步驟順序以及色譜介質的選擇，因此憑藉所提供的本發明方法，本發明提供一種提取多個高純度天然禾草過敏原的高級生產方法，它不費事或不費時並且在技術上可行。由於所用提純方法對蛋白質作用非常溫和，因此它們的構象和抗原性得以保留。這是過敏性疾病成功診斷的先決條件。
權利要求
1.一種用來分離基本純淨的1、2、3、10和13型禾草過敏原的方法，其特徵在於，製備一種禾本科花粉的水性提取物，然後此可溶性組分接受疏水作用色譜法處理、凝膠過濾步驟以及，如果需要的話，陽離子交換色譜法處理。
2.權利要求1的方法，其特徵在於，使用物種梯牧草、黑麥草、鴨茅、牛尾草、絨毛草、草地早熟禾、黑麥的花粉來進行提取。
3.權利要求1或2的方法，其特徵在於，提取是利用tris/HCl緩衝水溶液進行的。
4.權利要求1～3之一的方法，其特徵在於，在第一步中，1、2、3、10和13型禾草過敏原利用疏水作用色譜法從其它組分中分離出來。
5.權利要求4的方法，其特徵在於，1和13型過敏原通過隨後的凝膠過濾步驟作為單獨的級分得到，並從2、3和10型過敏原中分離出來。
6.權利要求5的方法，其特徵在於，凝膠過濾步驟後獲得的2、3和10型過敏原通過隨後的陽離子交換色譜法彼此分離開來。
7.一種採用按照權利要求1～6獲得的過敏原對花粉過敏進行體內和體外診斷的方法。
8.一種藥物製劑，它包含按照權利要求1～6之一獲得的一種或多種過敏原以及相應的助劑和賦形劑。
全文摘要
本發明涉及從禾草花粉中將1、2、3、10和13型這5種過敏原快速而有效地分離及提純的方法。所述禾草花粉的提純基於疏水作用色譜法、凝膠過濾和陽離子交換色譜法的新型組合。該新型方法獲得的蛋白質有助於改進花粉過敏的診斷並可用於花粉原疾病治療的藥物製劑。
文檔編號G01N33/53GK1372567SQ00811875
公開日2002年10月2日 申請日期2000年8月18日 優先權日1999年8月24日
發明者R·蘇克, O·克洛姆維爾, H·菲比希 申請人:默克專利股份公司