一種梅花鹿角盤小分子蛋白多肽的製備方法與流程
2023-05-04 07:48:41
本發明涉及生物蛋白質技術領域，尤其涉及一種梅花鹿角盤小分子蛋白多肽的製備方法。
背景技術：
鹿角盤指的是雄性鹿在鋸茸後殘留在角柄上的骨化物，到了第二年新茸長出前自動脫落的盤狀物質，也命名為「鹿花盤」、「鹿角帽」，主要含有多種必需胺基酸及多種礦物質元素。鹿角盤呈盔狀或扁盔狀，直徑2-5cm，高2-4.5cm，表面為灰黃色或灰褐色，呈蜂窩狀，底面較平並富有一定光澤，上部呈現出不規則的半球形形狀，質地較為堅硬，顏色呈灰白色。近些年來，對於鹿角盤的成分主要從以下幾個部分進行研究，主要是胺基酸、無機元素、蛋白多肽類物質等等，同時也有少量報導稱鹿角盤中含有甾體類、多糖類等物質。
相比於分子量較大的蛋白，小分子蛋白及多肽更容易被機體所吸收從而具有更加明顯的醫療保健效果，而蛋白質或多肽單體的研究及胺基酸序列的獲得可以為蛋白質工程研究與基因工程研究之間搭建橋梁並為蛋白質組學的發展做出貢獻，因此，近年來，越來越多的人把對梅花鹿角盤研究的目光集中在了小分子多肽、蛋白多肽單體上。姜薇用5mM的預冷醋酸鈉溶液對梅花鹿角盤粉末中的可溶性蛋白進行攪拌提取，並通過醇沉、旋蒸、凍幹、葡聚糖凝膠除鹽、離子交換層析和高效液相法得到純化的蛋白單體，電泳檢測(SDS-PAGE)顯示其相對分子質量大小為17.2kDa，經MALDI-TOF-MS鑑定，確定其為肽聚糖識別蛋白1(PGRP 1)，匹配的序列為RLYEIIQ KWPHYRA，將其命名為cnPGRP1，並通過抑菌試驗證明其具有明顯的抑菌活性(志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、大腸桿菌、枯草桿菌)。黃鳳傑等人通過pH3.5稀醋酸緩衝液勻漿提取、色譜柱Resource S純化、Superdex 75凝膠柱層析、反相高效液相等方法得到相對分子質量大小為7.1276kDa的梅花鹿角盤多肽單體，將其給藥於KK-ay小鼠觀察其降糖活性，並建立胰島素抵抗模型(利用高胰島素誘發HepG2細胞)，研究該多肽對胰島素抵抗HepG2細胞糖消耗的影響，結果顯示，該多肽既可降低KK-ay小鼠血糖水平，又可顯著促進胰島素抵抗模型的糖消耗，說明該蛋白單體具有一定的降糖活性。唐任能通過超濾(中空纖維膜)、離子交換層析、凝膠過濾層析等手段純化出一個相對分子質量大小為17.0kDa的小分子蛋白單體，經MALDI-TOF-MS分析發現其與哺乳動物的肽聚糖識別蛋白同源性較高，並發現該小分子蛋白單體對L929等細胞的增殖有顯著影響。王志兵等人通過酶解得到梅花鹿角盤蛋白CPP，電泳檢測(SDS-PAGE)其相對分子質量在8-15kDa之間，活性試驗證明CPP能夠抗大鼠乳腺增生，並對小鼠的吞噬功能產生顯著影響。邱芳萍等人將梅花鹿角盤低溫粉碎成粒度0.01mm的微粉後，45℃蒸餾水浸提並抽濾浸提液，上清液進行鹽析得到蛋白沉澱並對蛋白沉澱進行復性，再通過透析及層析(Sephadex G-100)手段得到鹿角盤蛋白APPB，電泳檢測(SDS-PAGE)其相對分子質量在20.1-31.0kDa之間，並對其進行醋酸致小鼠扭體實驗，結果顯示其具有鎮痛作用。
技術實現要素：
為了獲得小分子蛋白多肽並保持小分子多肽的結構完整，使其活性好，更易於被人體吸收，本發明提供一種梅花鹿角盤小分子蛋白多肽的製備方法。
一種梅花鹿角盤小分子蛋白多肽的製備方法，按照下述步驟進行：
步驟一：鹿角盤總肽的提取；
步驟二：總肽粗提物的除鹽；
步驟三：總肽的分級分離；
步驟四：冷凍乾燥。
優選的，鹿角盤總肽的提取，包括以下步驟：
步驟一：稱取450-550g鹿角盤粉末，加入3000mL於4℃冰箱充分預冷的pH為3.2-3.8的醋酸-醋酸鈉緩衝液，磁力攪拌器充分攪拌後，對勻漿液進行離心，取上清；向其中緩慢加入4℃冰箱充分預冷的95％乙醇直至上清液終濃度達到55％後，4℃冰箱放置並每隔1h攪拌一次，3.5-5h後離心，取上清；以上操作除旋轉蒸發外均在4℃條件下進行；
步驟二：上清液用真空旋轉蒸發儀在40℃-45℃條件下旋轉蒸發至濃縮液體積為400mL左右；
步驟三：濃縮液過濾後置於大培養皿內，真空冷凍乾燥機凍幹，得梅花鹿角盤總肽粗提物，裝於自封袋後於-20℃冰箱保存待用；
所述的步驟一中的兩次離心的速度為5000-6500rpm，時間為25min。
優選的，總肽粗提物的除鹽，包括以下步驟：
步驟一：取梅花鹿角盤總肽粗提物1.2-1.8g，用10mL去離子水溶解充分後，過0.45μm濾器，為上樣液；
步驟二：用膠頭滴管將上樣液沿柱內壁緩緩滴入層析柱內並注意不要衝擊膠面，用去離子水洗脫，並通過調節蠕動泵轉速控制流速穩定在0.8-1.2mL/min，核酸蛋白檢測儀在280nm處檢測吸光值，出峰後用乾淨燒杯收集，待吸光值回歸基線時停止收集，並繼續用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫後關閉出水口(洗脫後的層析柱可以再次使用)；
步驟三：收集液凍幹，裝於自封袋後於-20℃冰箱保存待用。
優選的，總肽的分級分離，包括以下步驟：
步驟一：取梅花鹿角盤總肽除鹽品80-125mg，用2mL去離子水溶解充分後，過0.45μm微孔濾器，為上樣液；
步驟二：用膠頭滴管將上樣液沿柱內壁緩緩滴入層析柱內並注意不要衝擊膠面，用去離子水洗脫，並通過調節蠕動泵轉速控制流速穩定在0.3-0.6mL/min，核酸蛋白檢測儀在215nm處檢測吸光值，自動收集器收集並標記收集各峰的試管，待吸光值回歸基線時停止收集，並繼續用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫後關閉凝膠柱出水口(洗脫後的凝膠柱可以二次使用)。
優選的，冷凍乾燥，包括以下步驟：將收集液置於大培養皿內，真空冷凍乾燥機凍幹，得梅花鹿角盤小分子蛋白多肽。
本發明所提供的梅花鹿角盤小分子蛋白多肽的製備方法，包括鹿角盤總肽的提取；總肽粗提物的除鹽；總肽的分級分離和冷凍乾燥四個步驟，從而得到分子量集中在5kDa以下的小分子多肽混合物，通過對傳統的製備方法的改進，得到的小分子蛋白多肽，分子量小，並可以保持小分子多肽的結構完整，活性好，易於被人體吸收。
附圖說明
圖1為實施例1中組分3的SDS-PAGE電泳圖。
具體實施方式
實施例
一種梅花鹿角盤小分子蛋白多肽的製備方法，按照下述步驟進行：
步驟一：鹿角盤總肽的提取：稱取500g鹿角盤粉末，加入3000mL於4℃冰箱充分預冷的pH 3.6的醋酸-醋酸鈉緩衝液，磁力攪拌器充分攪拌後，對勻漿液進行離心(4℃，6000rpm，25min)，取上清，向其中緩慢加入4℃冰箱充分預冷的95％乙醇直至上清液終濃度達到55％後，4℃冰箱放置並每隔1h攪拌一次，4h後離心(4℃，6000rpm，25min)，取上清；上清液用真空旋轉蒸發儀在45℃條件下旋轉蒸發至濃縮液體積為400mL左右；濃縮液過濾後置於大培養皿內，真空冷凍乾燥機凍幹，得梅花鹿角盤總肽粗提物，裝於自封袋後於-20℃冰箱保存待用；以上操作除旋轉蒸發外均在4℃條件下進行，兩次離心得到的沉澱分別於37℃烘箱中烘乾後裝於自封袋，低溫保存；
步驟二：總肽粗提物的除鹽：取梅花鹿角盤總肽粗提物1.5g，用10mL去離子水溶解充分後，過0.45μm濾器，為上樣液；用膠頭滴管將上樣液沿柱內壁緩緩滴入層析柱內並注意不要衝擊膠面，用去離子水洗脫，並通過調節蠕動泵轉速控制流速穩定在1mL/min，核酸蛋白檢測儀在280nm處檢測吸光值，出峰後用乾淨燒杯收集，待吸光值回歸基線時停止收集，並繼續用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫後關閉出水口(洗脫後的層析柱可以再次使用)；收集液凍幹，裝於自封袋後於-20℃冰箱保存待用；
所述的步驟二的層析柱在使用前需進行平衡，包括以下步驟：稱取30g Sephadex G-25凝膠乾粉置於1000mL燒杯中，向其中加入500mL去離子水，於沸水浴中溶脹2h，期間用玻璃棒輕輕攪拌促使凝膠溶脹充分，並觀察是否有不均一的細小顆粒或雜質，如有需傾倒除去，使上清不再渾濁；待凝膠充分溶脹且上清不再渾濁後，真空減壓除氣泡，裝柱；層析柱(Φ16mm×40cm)在裝柱前需用0.2M氫氧化鈉洗滌一遍，再用水衝洗乾淨，最後用蒸餾水和去離子水各清洗三遍；將柱子垂直固定於層析冷櫃中，按順序依次連接蠕動泵、核酸蛋白檢測儀；在距離柱頂端5cm處做一標記為衡量灌裝凝膠床體高度的依據；封住層析柱出水口，向柱底灌入1/4柱體積的去離子水，將盛裝凝膠的燒杯中多餘的去離子水緩慢傾倒出去直至剩餘去離子水與凝膠體積的比為1∶1，玻璃棒輕輕攪拌使凝膠均勻懸浮在去離子水中後，將凝膠勻漿緩緩灌入柱中，待柱底部出現1～2cm左右的凝膠沉降後，打開層析柱出水口，蠕動泵控制流速為1mL/min；不斷將凝膠勻漿緩緩灌入柱中以補充流出的去離子水直至凝膠沉降高於標記處2cm左右時停止，去離子水為流動相，使層析柱平衡12h；
步驟三：總肽的分級分離：取梅花鹿角盤總肽除鹽品100mg，用2mL去離子水溶解充分後，過0.45μm微孔濾器，為上樣液；用膠頭滴管將上樣液沿柱內壁緩緩滴入層析柱內並注意不要衝擊膠面，用去離子水洗脫，並通過調節蠕動泵轉速控制流速穩定在0.5mL/min，核酸蛋白檢測儀在215nm處檢測吸光值，自動收集器收集並標記收集各峰的試管，待吸光值回歸基線時停止收集，並繼續用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫後關閉凝膠柱出水口(洗脫後的凝膠柱可以二次使用)；
所述的步驟三層析柱在使用前需進行平衡，包括以下步驟：層析柱規格為Φ20mm×100cm。稱取20g Sephadex G-50凝膠乾粉並置於1000mL燒杯中，向其中加入1000mL去離子水，於沸水浴中溶脹2h，期間用玻璃棒輕輕攪拌促使凝膠溶脹充分，並觀察是否有不均一的細小顆粒或雜質，如有需傾倒除去，使上清不再渾濁。待凝膠充分溶脹且上清不再渾濁後，真空減壓除氣泡，裝柱，層析柱在裝柱前需用0.2M氫氧化鈉洗滌一遍，再用水衝洗乾淨，最後用蒸餾水和去離子水各清洗三遍；將柱子垂直固定於層析冷櫃中，按順序依次連接蠕動泵、核酸蛋白檢測儀；在距離柱頂端5cm處做一標記為衡量灌裝凝膠床體高度的依據；封住層析柱出水口，向柱底灌入1/4柱體積的去離子水，將盛裝凝膠的燒杯中多餘的去離子水緩慢傾倒出去直至剩餘去離子水與凝膠體積的比為1∶1，玻璃棒輕輕攪拌使凝膠均勻懸浮在去離子水中後，將凝膠勻漿緩緩灌入柱中，待柱底部出現1-2cm左右的凝膠沉降後，打開層析柱出水口，蠕動泵控制流速為1mL/min；不斷將凝膠勻漿緩緩灌入柱中以補充流出的去離子水直至凝膠沉降高於標記處2cm左右時停止；以去離子水為流動相，平衡層析柱24h；
步驟四：鹿角盤小分子多肽的冷凍乾燥：含目的物的收集液置於大培養皿內，真空冷凍乾燥機凍幹，得梅花鹿角盤小分子多肽。
分離產物的電泳檢測：採用Tricine-SDS-PAGE三層膠電泳，電泳目的為找到梅花鹿角盤小分子多肽混合物所在峰。具體的方法如下：
(1)垂直凝膠模具的固定：電泳所用玻璃板夾層寬度為1.0mm，用清水清洗玻璃板並用蒸餾水及去離子水潤洗，將玻璃板固定於電泳槽中，坐於制膠夾上。
(2)凝膠的配製：分離膠的配製(5.0mL)：向乾淨的小燒杯中依次加入1.620mL去離子水、1.675mL凝膠緩衝液、1.675mL膠貯備液II、25μL 10％過硫酸銨和2.5μL TEMED，移液槍吹打均勻後灌膠，灌膠高度為4cm左右時停止灌膠，用移液槍向膠面上層灌入1mL異丙醇，室溫下凝固1h。間層膠的配製(2.5mL)：濾紙除去異丙醇。向乾淨的小燒杯中依次加入1.149mL去離子水、0.838mL凝膠緩衝液、0.500mL膠貯備液I、12.5μL 10％過硫酸銨和1.25μL TEMED，移液槍吹打均勻後灌膠，灌膠高度為1.5cm左右時停止灌膠，用移液槍向膠面上層灌入1mL異丙醇，室溫下凝固1h。濃縮膠的配製(2.5mL)：濾紙除去異丙醇。向乾淨的小燒杯中依次加入1.677mL去離子水、0.620mL凝膠緩衝液、0.200mL膠貯備液I、30μL 10％過硫酸銨和1.20μL TEMED，移液槍吹打均勻後灌膠，拆入制膠梳子，室溫下凝固1h。
(3)樣品處理和電泳：取分級分離收集峰液體50μL，加入等體積2×電泳上樣緩衝液，移液槍吹打混勻10s。樣品同電泳Marker共同沸水浴處理5min後，上樣(蛋白Marker 10μL，樣品25μL)。電泳起始電壓為60V，當溴酚藍指示線遷移至濃縮膠與間層膠分界線時將電壓調至100V，待溴酚藍指示線遷移至距離分離膠底0.2cm處時，關閉電泳儀，停止電泳。電泳過程中緩衝液保持冰浴。
(4)固定、染色和脫色：將膠片轉移至乾淨大培養皿中，加入適量固定液，於搖床上固定1h。固定完畢後，倒掉固定液並用蒸餾水清洗膠片，加入染色液(考馬斯亮藍R-250)染色5h。染色完畢後，倒去染色液並用蒸餾水清洗膠片，脫色液脫色至背景乾淨為止。膠片於紫外成像儀中拍照並保存。
經Sephadex G-50凝膠層析分離得到3個組分，對這三個組分進一步進行分析。電泳檢測結果發現，組分1與組分2中的蛋白質大部分為相對分子質量大小在20.0kDa以上的大分子蛋白物質，與本發明的預期目標不符；而組分3中所含的物質為分子量集中在5kDa以下的小分子多肽混合物，符合本發明的預期目標，即獲得梅花鹿角盤小分子多肽(圖1為Tricine-SDS-PAGE三層膠電泳圖)。
以下參考吉林農業大學公開的中國發明專利CN102408477A中的實施例6，檢測鹿角盤蛋白多肽對小鼠乳腺癌細胞周期的影響(檢測方法完全參照該對比例)。
由以上檢測數據可以知道，本發明中的梅花鹿角盤小分子蛋白多肽對小鼠乳腺癌細胞具有顯著的抑制增殖的作用，且這種抑制效果要明顯好於對比例中公開的數據。
我們推測，正是通過本發明對傳統的製備方法的改進，得到的小分子蛋白多肽，分子量小，並可以保持小分子多肽的結構完整，活性好，對小鼠乳腺癌細胞的抑制作用更強。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。