鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的VIGS沉默體系的製作方法

2024-04-01 13:17:05

本發明涉及生物技術領域，特別涉及鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的vigs沉默體系。

背景技術：

牡丹(paeoniasuffruticosa)為芍藥科(paeoniaceae)芍藥屬(paeonia)牡丹組(sectionmoutan)落葉亞灌木，是我國傳統名花。牡丹花色形成的化學基礎研究較為深入，花瓣中含有12種花青苷，即天竺葵素3-葡萄糖苷(pg3g)、天竺葵素3,5-二葡萄糖苷(pg3g5g)、矢車菊素3-葡萄糖苷(cy3g)、矢車菊素3,5-二葡萄糖苷(cy3g5g)、芍藥花素3-葡萄糖苷(pn3g)、芍藥花素3,5-二葡萄糖苷(pn3g5g)、矢車菊素3,5-二己糖苷(cy-3,5-di-hexoside)、矢車菊素3-葡萄糖-5-阿拉伯糖苷(cy3g5ara)、矢車菊素3-阿拉伯糖苷(cy3ara)、矢車菊素3-沒食子醯葡萄糖苷(cy3galloylg)；芍藥花素3-阿拉伯糖苷(pn3ara)和芍藥花素5-沒食子醯葡萄糖苷(pn5galloylg)，其中pg3g、pg3g5g、cy3g、cy3g5g、pn3g和pn3g5g是主要的花青苷(wangls,shiraishia,hashimotof,aokin,shimizuk,sakatay.2001.analysisofpetalanthocyaninstoinvestigateflowercolorationofzhongyuan(chinese)anddaikonisland(japanese)treepeonycultivars.jplantres，114：33-43.；wangls,hashimotof,shiraishia,aokin,lijj,sakatay.2004.chemicaltaxonomyofthexibeitreepeonyfromchinabyfloralpigmentation.jplantres，117：47-55.；李崇暉，2010.牡丹花瓣類黃酮成分分析及其對花色的影響，中國科學院植物研究所博士學位論文)，栽培品種尤其是西北牡丹品種群花瓣基部具有鮮豔、碩大的色斑，不僅增加了觀賞價值，而且常作為品種分類的重要依據之一，這些非斑部分花青苷主要由pn3g5g、cy3g5g和cy3g組成，pn3g含量很低，幾乎不含pg型色素，推測花瓣基部cy的糖苷化、甲基化和高含量是形成色斑的主要原因。zhangetal.(2007)分析了35個西北牡丹品種花瓣的花青苷組成，斑中以cy3g為主，非斑以pn3g5g為主，斑中色素含量明顯高於非斑中的色素含量(zhangjj,wangls,shuqy,liuza,lich,zhangj,weixl,tiandk.2007.comparisonofanthocyaninsinnon-blotchesandblotchesofthepetalsofxibeitreepeony.scihortic，114：104-111.)。可見花青苷的糖基化修飾在牡丹花色素的合成與積累過程中佔有重要的地位(wangls,shiraishia,hashimotof,aokin,shimizuk,sakatay.2001.analysisofpetalanthocyaninstoinvestigateflowercolorationofzhongyuan(chinese)anddaikonisland(japanese)treepeonycultivars.jplantres，114：33-43.)。

類黃酮是植物中一類重要的次生代謝產物，通常需要在合成的最後一步進行糖苷化修飾，以增加其在細胞內的穩定性、溶解性並影響對花的顯色(田鵬，劉佔林.2011.糖基轉移酶超家族[j].2011.生命的化學，31：732–736)。類黃酮糖苷化由糖基轉移酶(udp-glucose:flavonoidglycosyltransferases，ufgts)完成，其糖基供體通常是核苷酸糖(nucleotidesugar,uridinediphosphate,udp)如udp-葡萄糖等。最早發現的是控制玉米黑色素的基因bronze1，其編碼類黃酮udp-糖基轉移酶(doonerhk,nelsonoe.1997.controllingelement-inducedalterationsinudpglucoseflavonoidglucosyltransferase,theenzymespecifiedbythebronzelocusinmaize.procnatlacadsciusa，74：5623-5627.)。之後，在很多植物中發現了類黃酮糖基轉移酶基因(ufgt)如玉米、金魚草、龍膽和牽牛等的uf3gt(schiefelbeinjw,raboyv,fedoroffnv,nelsonjroe.1985.deletionswithinadefectivesuppressor-mutatorelementinmaizeaffectthefrequencyanddevelopmentaltimingofitsexcisionfromthebronzelocus.procnatlacadsciusa，82：4783-4787.)及龍膽和葡萄的uf5gt等(yangyz,labateja,liangzc,cousinsp,prinsb,preeceje,aradhyam,zhonggy.2014.multipleloss-of-function5-o-glucosyltransferaseallelesrevealedinvitisvinifera,butnotinothervitisspecies.theorapplgenet，127：2433-2451.)。此外，在月季中還有一種糖基轉移酶先將花青苷5-o糖苷化後再繼續將3-o修飾形成3,5-雙-o-糖苷，聚類分析表明其與花青苷3gt-和5gt-糖基轉移酶亞家族明顯不同(ogataj,kannoy,itohy,tsugawah,suzukim.2005.plantbiochemistry:anthocyaninbiosynthesisinroses.nature，435：757-758.；purkayasthaa,dasguptai.2009.virus-inducedgenesilencing:aversatiletoolfordiscoveryofgenefunctionsinplants[j].plantphysiolbiochem，47：967-976)，可見在不同物種中，類黃酮糖苷化修飾基因存在多樣性並由超家族基因組成。牡丹花瓣中類黃酮(包括花青苷)合成途徑中部分相關酶基因已有克隆和表達分析(duh,wuj,jikx,zengqy,bhuiyadmw,sus,shuqy,renhx,liuza,wangls.2015.methylationmediatedbyananthocyanino-methyltransferase,isinvolvedinpurpleflowercolorationinpaeonia.jexpbot，66：6563-77.)，而類黃酮糖基轉移酶基因相關研究尚未見報導，因此開展相關基因功能研究對於理解其花色形成具有重要意義。

牡丹再生和遺傳轉化很困難，尚未見其遺傳轉化體系的報導，利用轉基因技術驗證牡丹基因的功能存在技術瓶頸。此外，牡丹從實生苗到開花需要3年左右的時間，開花相關基因的表型鑑定困難較大。

病毒誘導的基因沉默vigs(virus-inducedgenesilencing)是近年來發現的一種轉錄後基因沉默現象，可引起內源mrna序列特異性降解(ratclifff,martin-hemandezam,baulcombedc.2001.tobaccorattlevirusasavectorforanalysisofgenefunctionbysilencing.plantj，25：237-245.)。

技術實現要素：

為了彌補以上領域的缺陷，本發明提供了鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的vigs沉默體系。

本發明所提供的鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的vigs沉默體系，包含：在vigs沉默載體上插入目的基因得到的重組載體；所述目的基因為序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。

所述vigs沉默載體為菸草脆裂病毒trv2載體。

本發明還提供了所述鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的vigs沉默體系的構建方法。

本發明所提供的所述鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的vigs沉默體系的構建方法，包括如下步驟：

(1)利用添加了bamhi酶切位點和xhoi酶切位點的特異性引物進行目的基因片段的pcr擴增，分別得到用於vigs沉默的psuf3gt靶片段、psuf5gt靶片段；

所述psuf3gt靶片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示；擴增所述psuf3gt靶片段的特異性引物如下：

3gt-vf1：aaggatcccatggctcaatgaccaaaaggctaa；

3gt-vr1：ttactcgagcattcttcgtaaatactccaccgtcg；

所述psuf5gt靶片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示；擴增所述psuf5gt靶片段的特異性引物如下：

5gt-vf1：aaggatcctttggaaaagcaaggaatggtggtg；

5gt-vr1：acgctcgagtcacaaatcaccacctttccccacc；

(2)用bamhi酶和xhoi酶將所述psuf3gt靶片段或psuf5gt靶片段和trv2載體進行雙酶切，酶切完成後將psuf3gt靶片段或psuf5gt靶片段與菸草脆裂病毒trv2載體進行連接，連接之後轉化e.colidh5α感受態細胞，篩選陽性單菌落，然後轉化到農桿菌gv3101中，即得到所述vigs沉默體系。

所述鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的vigs沉默體系在鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因psuf3gt和/或psuf5gt中的應用也屬於本發明的保護範圍。

一種鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的方法也屬於本發明的保護範圍。

本發明所提供的使用鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的方法，使用所述的vigs沉默體系。

所述方法包括如下步驟：

以牡丹帶花柄的花朵為材料，浸沒在含有所述vigs沉默載體的菌液，真空滲透，負壓處理，放氣；

將真空滲透後的花瓣用去離子水漂洗，去除多餘菌液；

將所述花柄採用水培方式進行培養，之後檢測目的基因的表達水平以及花青苷積累量的變化。

所述帶花柄的花朵的花發育時期為全開或花苞。

抽真空滲透的持續時間為10min-15min。

將所述花柄採用水培方式進行培養的條件為：將花柄浸於去離子水中，在溫度為8℃、溼度60％的條件下暗培養1天；之後轉移至溫度為23-25℃、溼度60％的條件下正常光照培養3天。

所述含有權利要求1或2所述重組載體的菌液為：含有在菸草脆裂病毒trv2載體上插入序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列得到的重組載體菌液以及含有菸草脆裂病毒trv1載體的菌液。

本發明利用同源克隆技術克隆了牡丹類黃酮糖基轉移酶基因psuf3gt和psuf5gt保守區段作為靶基因構建trv2載體，成功建立了vigs沉默體系，有效地降低了這兩個基因的表達量和總花青苷含量。本研究結果對牡丹基因功能研究具有重要意義，也為解析牡丹色斑形成的分子機制奠定了基礎。

影響vigs沉默效果的因素很多。首先是沉默基因片段長度和位置的選擇，本發明利用擴增保守區段長度在400-450bp的片段來沉默同源家族基因，取得了較好的沉默效果。如針對某一特異基因進行沉默時，則需考慮序列的特異性，可以通過沉默非翻譯區或者特異區段的辦法，確保沉默特異目標基因。本發明採用菸草脆裂病毒trv為載體，其能有效地將目標基因在生長點或分生組織中沉默，並獲得系統的沉默效果。此外，利用trv沉默基因後的植物材料對溫度比較敏感，本發明在光照培養箱控溫(25℃)控溼(相對溼度60％)的條件下進行，獲得了較好的實驗結果。因此，成功沉默基因需要嚴格掌控好每個技術環節。

針對牡丹遺傳轉化困難、無法驗證基因功能等問題，本發明通過vigs技術，採用二因素三水平共9個試驗處理，利用vigs技術成功沉默了psuf3gt和psuf5gt基因。建立了psufgts最佳vigs體系，用psufgts基因保守區段為靶片段，以s4或者s2期帶花柄的花朵為材料，抽真空滲透10min-15min後置於去離子水中，暗培養1d(8℃，溼度60％)；之後轉移至23-25℃、溼度60％的環境，正常光照培養3d後進行檢測和分析。本結果為驗證牡丹ufgts基因的功能奠定了基礎，也為驗證牡丹中其他重要功能基因提供了研究思路和技術依據。

附圖說明

圖1為psuf3gt靶片段核苷酸及推測編碼的胺基酸序列；下劃線表示pspg-box。

圖2為psuf5gt靶片段核苷酸及推測編碼的胺基酸序列；下劃線表示udpg特徵序列。

圖3為含有trv載體的菌液凝膠電泳檢測結果；m為分子量標準從上到下分別為1000bp、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp。

圖4不同處理沉默花瓣中psuf3gt基因的表達量分析；小寫字母表示顯著性程度的差異。

圖5不同處理沉默花瓣中psuf5gt基因的表達量分析；小寫字母表示顯著性程度的差異。

圖6不同處理沉默psufgts的花斑中的花青苷含量和成分分析。

具體實施方式

用於本發明的紫斑牡丹品種『青海湖銀波』(p.suffruticosa『qinghaihuyinbo』)栽植於中國科學院植物研究所牡丹芍藥種質資源圃，其斑為紫紅色，非斑為白色，非斑部分未檢測出花青苷，斑部花青苷有四種：pn3g、pn3g5g、cy3g和cy3g5g(記載過該紫斑牡丹品種『青海湖銀波』(p.suffruticosa『qinghaihuyinbo』)的非專利文獻是：zhangjj,wangls,shuqy,liuza,lich,zhangj,weixl,tiandk.2007.comparisonofanthocyaninsinnon-blotchesandblotchesofthepetalsofxibeitreepeony.scihortic，114：104-111)。

本發明所用vigs載體來自菸草脆裂病毒載體(tobaccorattlevirus，trv)，trv1/trv2為中國農業大學觀賞植物採後和逆境生理實驗室馬男教授饋贈(記載過該載體的非專利文獻是：tianj,peihx,zhangs,chenjw,chenw,yangry,mengyl,youj,gaojp,man.2014.trv-gfp:amodifiedtobaccorattlevirusvectorforefficientandvisualizableanalysisofgenefunction.jexpbot，65：311-322.)，其帶有卡那篩選標記和35s啟動子，ptrv2帶有bamhi和xhoi等多克隆位點。

所用標準品矢車菊素-3-葡糖苷(cy3g)購自法國extrasynthese公司(genay，france)。

實施例1、

一、基因克隆

花瓣總rna的提取參照試劑盒說明書進行(rnapreppureplantkit，fastquantcdna天根生化科技(北京)有限公司)。根據公共資料庫中uf3gt和uf5gt序列設計上下遊引物克隆靶片段。用於vigs沉默的psuf3gt和psuf5gt片段設計上下遊引物並添加bamhi和xhoi酶切位點。擴增引物見表1。

表1本發明所用引物序列相關信息

註：下劃線表示鹼基酶切位點。

(1)psuf3gt靶片段的克隆序列分析

根據上下遊引物擴增psuf3gt靶片段長度為413bp，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。所用的pcr反應體系和程序見表2和表3，所擴增的片段利用凝膠回收試劑盒(easypurequickgelextraction，全式金生物技術有限公司)按照說明書進行回收，並連接到peasy-t3載體(購自全式金生物技術有限公司)，轉化大腸桿菌感受態細胞(trans1-t1phageresistantchemicallycompetentcell，購自全式金生物技術有限公司)。陽性克隆進行測序(由北京博邁德基因技術有限公司完成)。序列用dnaman5.0及在線網絡軟體(http://prosite.expasy.org/mydomains/)分析，其屬於glycosyltransferase_gtb_type超家族，含有pspg基序(plantsecondaryproductglycosyltransferasebox，圖1下劃線表示)。psuf3gt靶片段編碼的psuf3gt蛋白的胺基酸序列如序列表中序列2所示。

表2：pcr反應體系

表3：pcr擴增程序

(2)psuf5gt基因克隆和序列分析

克隆的psuf5gt靶片段長度為418bp，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。所用的pcr反應體系和程序等方法同psuf3gt。序列用dnaman5.0進行分析，並與公共數據可進行blastp分析，其屬於glycosyltransferase_gtb_type超家族，其胺基酸在337-380處有udpg(udp-glycosyltransferases)特徵序列即wcnqlevlshksvgcflthcgwnssleslvcgv.pvvafpqwadq(圖2下劃線所示)。psuf5gt靶片段編碼的psuf5gt蛋白的胺基酸序列如序列表中序列4所示。

二、製備重組載體

首先對含有trv2和trv1的菌液(為中國農業大學觀賞植物採後和逆境生理實驗室馬男教授饋贈；記載過trv1/trv2的非專利文獻是：tianj,peihx,zhangs,chenjw,chenw,yangry,mengyl,youj,gaojp,man.2014.trv-gfp:amodifiedtobaccorattlevirusvectorforefficientandvisualizableanalysisofgenefunction.jexpbot，65：311-322.))進行pcr鑑定，鑑定引物見表1，擴增體系和程序見表4和表5。所擴增長度分別為500bp(trv1)和200bp(trv2)(圖3)。

表4：pcr反應體系

pcr擴增程序如下表5：

表5：pcr擴增程序

含有trv載體的菌液凝膠電泳檢測結果見圖3。trv1所擴增片段大小為500bp左右，trv2大小為200bp左右，證實擴增正確，可以用於後續研究。

上述所克隆的psuf3gt/psuf5gt序列上下遊分別含有bamhi和xhoi酶切位點，含有目的片段和trv2載體的菌液進行質粒提取，採用無內毒素質粒中提試劑盒(endofreeplasmindmidikit，購自康為世紀生物科技有限公司)，提取方法參照試劑盒說明書進行。同時用上述2個酶將靶片段和trv2進行雙酶切(內切酶購自neb)，酶切反應根據試劑說明書進行，並見表6。酶切體系混勻後，置於37℃水浴過夜。

表6：雙酶切體系

酶切完成後將psuf3gt/psuf5gt靶片段與trv2載體進行連接，採用t4dna連接酶，連接體系見表7。

表7：連接體系

連接之後轉化e.colidh5α感受態細胞(購自康為世紀生物科技有限公司)，用含kan抗性的lb培養基篩選陽性單菌落，再進行pcr、質粒酶切鑑定。鑑定正確，將確定含有trv2-psuf3gt和trv2-psuf5gt大腸桿菌菌液進行測序(由北京博邁德基因技術有限公司完成)，確保序列的正確性。測序結果正確，然後轉化到農桿菌gv3101中(農桿菌感受態細胞購自北京博邁德基因技術有限公司)轉化方法為常規凍融法，轉化後的農桿菌培養2-3d後，將單菌落菌液進行測序驗證，對驗證正確的農桿菌進行培養，用於vigs試驗。

三、vigs體系建立

採用二因素三水平試驗體系(表8)進行vigs試驗。因素a：花發育時期，對應的a1(全開，s4)；a2(半開，s3)；a3(花苞，s2)。因素b：真空滲透時間，分別為10min(b1)、15min(b2)和20min(b3)。trv2-3gt和trv2-5gt為目標基因，相應的trv2空載體為對照。轉化方法參照文獻tianj,peihx,zhangs,chenjw,chenw,yangry,mengyl,youj,gaojp,man.2014.trv-gfp:amodifiedtobaccorattlevirusvectorforefficientandvisualizableanalysisofgenefunction.jexpbot，65：311-322.，採用抽真空法。主要細節包括重懸菌液的od600＝1.0，且ptrv2-3/5gt、ptrv1和ptrv2菌液的od600值相同。將ptrv2-3/5gt和ptrv1，ptrv2和ptrv1菌液按體積比1：1分別混合，暗處靜置4h。牡丹花朵帶5cm花柄剪下，隨機分布於不同處理，浸沒在菌液中，抽真空至0.7atm，負壓處理，緩慢放氣。每個處理三朵花即重複3次。將抽吸後的花瓣用去離子水漂洗，去除多餘菌液。花柄浸於去離子水中，8℃，溼度60％左右，暗培養1d；之後轉移至23-25℃，溼度60％左右，正常光照培養3d。侵染4d後採樣，將花瓣的斑與非斑部分分開。選取花瓣作為rna提取檢測樣本和色素抽提樣本，rna檢測樣本置於液氮中速凍並存於-80℃，色素抽提樣本經冷凍乾燥處理後保存於茶色乾燥器中。之後檢測目的基因的表達水平以及花青苷積累量相對於對照的變化。因非斑部分不積累花青苷，所以侵染後僅測斑部花青苷成分及含量。

表8用於vigs體系的二因素三水平試驗處理

四、基因表達分析

基因表達分析參照文獻(duh,wuj,jikx,zengqy,bhuiyadmw,sus,shuqy,renhx,liuza,wangls.2015.methylationmediatedbyananthocyanino-methyltransferase,isinvolvedinpurpleflowercolorationinpaeonia.jexpbot，66：6563-77)，將所有樣品進行總rna的提取，並反轉錄成cdna，作為螢光定量pcr的模板。具體方法參照試劑盒說明進行(fastquantcdna和sybrgreen，天根生化科技(北京)有限公司)並參考文獻(duh,wuj,jikx,zengqy,bhuiyadmw,sus,shuqy,renhx,liuza,wangls.2015.methylationmediatedbyananthocyanino-methyltransferase,isinvolvedinpurpleflowercolorationinpaeonia.jexpbot，66：6563-77)，螢光定量的反應體系和程序見表9和表10。本研究採用2-△△ct(livak)法計算實時螢光定量pcr實驗中基因的相對表達量，pstubulin(accessionno.ef608942)作為內參基因(duh,wuj,jikx,zengqy,bhuiyadmw,sus,shuqy,renhx,liuza,wangls.2015.methylationmediatedbyananthocyanino-methyltransferase,isinvolvedinpurpleflowercolorationinpaeonia.jexpbot，66：6563-77)。將花瓣斑與非斑分開進行表達量分析，分3次生物學和3次技術重複。

表9螢光定量pcr擴增體系

表10螢光定量pcr擴增程序

結果：花瓣中沉默ufgts後基因的表達量分析

利用所擴增保守區片段長分別為413bp和418bp的psuf3gt和psuf5gt基因片段構建trv2載體，用於沉默目的基因。通過二因素三水平9個試驗，尋找ufgt基因沉默的最佳處理，對沉默後的基因表達量進行分析(圖4和圖5)。通過對不同處理的斑與非斑中psuf3gt和psuf5gt基因表達量分析發現，9個處理中psuf3gt基因的表達量在處理2的斑中降低最多，比對照處理1、處理6和處理8分別降低了65.0％、45.0％和71.0％。psuf5gt在處理7的非斑中表達量降低最多，比對照處理1和8分別降低了15.9％和85.0％。

五、斑部花青苷測定

將乾燥後的花斑進行稱重提取花青苷(lich,duh,wangls,shuqy,zhengyr,xuyj,zhangjj,zhangj,yangrz,geyx.2009.flavonoidcompositionandantioxidantactivityoftreepeony(paeoniasectionmoutan)yellowflowers.jagricfoodchem，57：8496–8503.)，即稱取乾燥花瓣0.1-0.2g，用0.2％甲酸甲醇溶液超聲20min，並黑暗放置2h後12,000rpm離心5min充分提取，各3個重複。使用hplc分析前，取1ml提取液，用0.22μm尼龍微孔濾器過濾到樣品瓶中。所用分析系統為dionexhplc-dad系統，色譜柱為tskgelods-80tsqa，4.6mm(內徑)×150mm(柱長)(日本tosoh株式會社)。花青苷的定性和定量分析參照(zhangjj,wangls,shuqy,liuza,lich,zhangj,weixl,tiandk.2007.comparisonofanthocyaninsinnon-blotchesandblotchesofthepetalsofxibeitreepeony.scihortic，114：104-111.；lich,duh,wangls,shuqy,zhengyr,xuyj,zhangjj,zhangj,yangrz,geyx.2009.flavonoidcompositionandantioxidantactivityoftreepeony(paeoniasectionmoutan)yellowflowers.jagricfoodchem，57：8496–8503.)，即液相色譜分析條件：色譜柱tskgelods-80tsqa，4.6mm(內徑)×150mm(長)；柱溫35℃，流速0.8ml/min，進樣體積10μl。具體a相：10％甲醇水溶液；b相：1％甲酸水；c相：純甲醇；d相：甲酸：乙腈(0.1:99.9v/v)溶液。線性梯度洗脫程序：0-50min，b相5％-20％，c相95％-80％；50-60min，b相20％-5％，c相80％-95％。流速0.8ml/min，柱溫35℃，進樣體積10μl，檢測波長525nm(花青苷分析)。利用agilent1100lc/msdtrapvl液質聯用儀(agilenttechnologies,paloalto,ca,usa)進行hplc-esi-ms2分析。質譜分析條件：電噴霧離子化(esi)，離子阱分析器，毛細管電壓3.5kv，噴霧器壓力241.3kpa，乾燥溫度350℃，乾燥氣(n2)流速6.0ml/min。用lc/msdtrap軟體(v5.2)分析結果。利用agilent1100lc/msdtrapvl液質聯用儀(agilenttechnologies,paloalto,ca,usa)進行hplc-esi-ms/ms2分析。標準品為矢車菊素3-o-葡萄糖苷(cy3g)，通過標準品半定量法計算花青苷含量(wangls,shiraishia,hashimotof,aokin,shimizuk,sakatay.2001.analysisofpetalanthocyaninstoinvestigateflowercolorationofzhongyuan(chinese)anddaikonisland(japanese)treepeonycultivars.jplantres，114：33–43.)，即使用不同濃度包括0.015625mg/ml、0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、1.0mg/ml的標準品，製作的標準曲線公式為：花青苷含量ta(totalanthocyanin)[mau]＝0.0012[cy3g(μg/ml)]+0.0121(r2＝0.994)。花青苷含量以mg/g乾燥花瓣(dw)計。用chameleon軟體(ver.6.60)分析結果。

數據分析方法：

本研究中的序列利用dnaman5.0進行序列分析。螢光定量pcr數據採用軟體spss13.0v(spssinc.,chicago,il)進行顯著性差異分析(p<0.05)，採用excel2007軟體繪製圖表。

結果：沉默後的花斑中花青苷含量的測定和分析

在對基因沉默後不同處理的花瓣斑與非斑中的表達量進行分析的基礎上，對9個處理花斑中花青苷成分和含量進行了測定(圖6)，檢測結果與螢光定量結果基本一致，即：處理2中4種花青苷總量比對照處理1降低了24.2％，其中降低最多的是pn3g佔20.0％，其次為cy3g、pn3g5g、cy3g5g，分別為2.3％、1.4％和0.1％；3g型糖苷降低了92.2％，3g5g型降低了7.8％。處理7中總花青苷比對照處理8降低了28.2％，其中降低最多的是pn3g佔12.5％，其次是pn3g5g、cy3g5g、cy3g分別降低了9.3％、6.1％和0.01％；3g5g型糖苷降低54.9％而3g型糖苷降低45.1％。

中國科學院植物研究所

鑑定牡丹類黃酮糖基轉移酶基因的vigs沉默體系

p170440/zwy

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