一種用納米金檢測dna突變的方法
2023-05-04 02:29:31
專利名稱：一種用納米金檢測dna突變的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測DNA突變的方法，尤其是涉及一種用納米金探針檢測DNA突變的 方法。
背景技術：
基因突變是指基因組DNA分子在結構功能上發生鹼基對組成或排列順序的改變，主要 包括鹼基的替換、缺失或插入。由於基因突變與多種遺傳性疾病、腫瘤的發生具有密切的關 系，因此檢測基因突變對於遺傳性疾病或者腫瘤的早期發現和診斷具有重要的意義。
檢測基因突變的方法主要有凝膠電泳法、DNA測序法和DNA晶片技術。凝膠電泳法 的基本原理是不同構象的DNA在凝膠中的遷移率不同，根據遷移率的改變與否，可以判 斷是否存在基因突變。這種方法雖然簡單，但是其靈敏度易受到電泳條件和DNA片段大小 等因素的影響，重現性較差，也不易實現自動化。DNA測序法是檢測基因突變最直接最準確 的方法，它既可以確定突變的類型，又可以確定突變的位置。但是該種方法需要特殊的儀器 設備，且耗時費力，測序時需要同位素或者螢光標記，花費昂貴。DNA晶片技術是20世紀 90年代發展起來的一項新技術，其基本原理是許多已知序列DNA被排列在集成電路板上， 彼此之間重疊一個鹼基，並覆蓋整個所需檢測的基因，螢光標記的正常DNA和突變DNA分 別與兩塊DNA晶片雜交，由於至少存在一個鹼基的差異，正常DNA和突變DNA將會得到 不同的雜交圖譜，通過共聚焦顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產生的螢光信號，即可確定是 否存在突變。這種方法自動化程度高，可以檢測大量的樣品，但是需要特殊的儀器，成本也 較高。因此尚需找到更加簡單快捷、高效靈敏、成本低廉的檢測基因突變的方法。
納米物質所表現出獨特的光學性質、電學性質、磁學性質和熱學性質受到了廣泛的關注 和研究。美國西北大學Mirkin CA領導的研究小組，利用納米金優良的光學性質，在檢測DNA 方面做了大量卓有成效的研究。他們將巰基化的DNA序列固定在納米金的表面，然後與目 標DNA進行雜交，雜交後納米金的顏色和紫外可見吸收光譜會發生明顯改變，據此可以判 斷是否存在目標DNA序列(1. Elghanian R,Storhoff JJ, Mucic RC， et al. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science, 1997， 277(5329):1078-1081; 2. Taton TA, Mirkin CA， Letsinger RL.Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes. Science, 2000, 289(5485):1757-1760)。
發明內容
本發明的目的是提供一種用納米金探針檢測DNA突變的方法。 本發明的具體步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置後 加入氯化鈉溶液，混勻後靜置，得到的體系稱為體系l;
2) 將突變型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置後 加入氯化鈉溶液，混勻後靜置，得到的體系稱為體系2;
3) 往步驟1所得的體系1中加入氯化鈉溶液，混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的 520 nm處的吸光值稱為吸光值1;
4) 往步驟2所得的體系2中加入氯化鈉溶液，使氯化鈉的終濃度與步驟3中氯化鈉的終 濃度相同，混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2;
5) 當吸光值2與吸光值1有明顯差異時，可以判斷有突變存在。 所述的納米金的粒徑範圍為5 50nm。
野生型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金的加入量最好為野 生型單鏈DNA :納米金=(10 50) pmol : (40 50) pL，與野生型單鏈DNA序列完全互 補的探針與野生型單鏈DNA等量，氯化鈉的終濃度最好為0.05 0.1 mol/L。
突變型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金的加入量最好為突 變型單鏈DNA :納米金=(10 50) pmol : (40 50) ^L，與野生型單鏈DNA序列完全互 補的探針與突變型單鏈DNA等量，氯化鈉的終濃度最好為0.05~0.1 mol/L。
在步驟3)中，氯化鈉的終濃度最好為0.2 0.3mol/L。
本發明的技術方案所涉及的原理是納米金在水溶液中可穩定分散，呈酒紅色，但高鹽 溶液對納米金的穩定性影響很大，加入高鹽溶液後，納米金的穩定性被破壞，納米金顆粒互 相聚結沉澱，納米金的顏色和紫外可見吸收光譜最大吸收峰發生改變。納米金對單鏈DNA 和雙鏈DNA的吸附能力不同，在高鹽溶液中單鏈DNA和雙鏈DNA對納米金的穩定性具有 顯著不同的保護作用。單鏈DNA能結合到納米金表面形成保護層，'使納米金在高鹽溶液中 聚集程度較小，520 nm處的吸光值變化不大；而雙鏈DNA幾乎不能附著在納米金表面，無 法阻止納米金在高鹽溶液中發生聚集，520nm處的吸光值發生明顯的改變。將探針分別與野 生型DNA和突變型DNA雜交，由於突變型DNA不能與探針完全互補，因此其雜交效率將 低於野生型DNA，其雜交體系中殘留的游離單鏈DNA將高於野生型DNA雜交體系，從而
對納米金的穩定產生更強的保護作用。因此，通過比較520nm處吸光值的改變程度可以判斷 是否存在突變。本發明中DNA和納米金均無需作任何修飾，大大簡化樣品的處理過程和操 作步驟，只需檢測As2o的不同，即可判定DNA是否存在突變，最低檢出限為10pmol，在40min 左右獲得檢測結果，具有簡便快速、成本低廉、高度靈敏等特點，具有較大的臨床應用潛力。
圖1為本發明實施例所使用納米金的透射電鏡圖。在圖1中，標尺為50nm。
圖2為野生型單鏈DNA與完全互補的探針雜交後，再加入氯化鈉溶液，納米金聚沉的 透射電鏡圖。在圖2中，標尺為50nm。
圖3為人p53基因密碼子245處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結果。
圖4為人p53基因密碼子245處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結果。
圖5為人p53基因密碼子245處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結果。
圖6為人p53基因密碼子282處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結果。
圖7為人p53基因密碼子282處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結果。
圖8為人p53基因密碼子282處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結果。
在圖3 8中，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為吸光值。曲線a為納米金的紫外可見吸收光 譜，b為突變型單鏈DNA與納米金探針體系的紫外可見吸收光譜，c為野生型單鏈DNA與 納米金探針體系的紫外可見吸收光譜。
具體實施例方式
下面通過實施例結合附圖對本發明作進一步說明。 實施例1
將該檢測方法應用於檢測人p53基因密碼子245處的點突變，鹼基G突變為鹼基A^(參 見文獻Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R， Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005， 15(8):1-13)，具體操作步驟如下 1) 將野生型單鏈DNA 50 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和50 7.54 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置lOmin後 加入3pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.057，混勻後室溫靜置30min，得到的體 系稱為體系1。
2) 將突變型單鏈DNA 50 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和50 7.54 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置lOmin後 加入3^L lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.057，混勻後室溫靜置30min，得到的體 系稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入10 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.206， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1。
4) 往步驟2所得的體系2中加入10 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.206， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520 nm處的吸光值稱為吸光值2。
結果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液後，吸光值1為1.16 (圖3c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液後，吸光值2為1.64 (圖3b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據此可以判 斷存在突變。
實施例2
將該檢測方法應用於檢測人p53基因密碼子245處的點突變，鹼基G突變為鹼基AP](參 見文獻Rangel-Lopez A， Maldonado-Rodriguez R, Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005, 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA42 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和45 4.81 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置12min後 加入4pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.082，混勻後室溫靜置33min，得到的體 系稱為體系1。
2) 將突變型單鏈DNA42 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和45 7.54 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置12min後 加入4pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.082，混勻後室溫靜置33min，得到的體 系稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入11 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.25， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1。
4)往步驟2所得的體系2中加入11 nL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.25， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2。
結果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液後，吸光值1為0.78 (圖4c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液後，吸光值2為0.97 (圖4b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據此可以判 斷存在突變。
實施例3
將該檢測方法應用於檢測人p53基因密碼子245處的點突變，鹼基G突變為鹼基A^(參 見文獻Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R， Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol， 2005, 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1)將野生型單鏈DNA 35 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 、對生型單鏈ONA完全互補的序列)和40 2.8 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置9min後加 入4pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.091，混勻後室溫靜置35min，得到的體系 稱為體系1。
.、2)將突,，.^^i)NA.35q)mok:等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 "野生型單鏈DNA完全互樸的序列)'和40 2.8 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置9min後加 入4nLlmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.091，混勻後室溫靜置35min，得到的體系 稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入6 nL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.2，混 勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1。
4) 往步驟2所得的體系2中加入6 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度先0.2，混 勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2。
結果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液後，吸光值1為0.39 (圖5c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液後，吸光值2為0.58 (圖5b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據此可以判 斷存在突變。
實施例4
將該檢測方法應用於檢測人p53基因密碼子282處的點突變，鹼基C突變為鹼基T[3](參 見文獻Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R, Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005, 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA 28 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和42 7.4 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置16min後加 入3^iLlmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.067，混勻後室溫靜置29min，得到的體系 稱為體系l。
2) 將突變型單鏈DNA28 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和42 7.4nmol/L的納米金混勻，室溫靜置16min後加 入3^L lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.067，混勻後室溫靜置29min，得到的體系 稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入10 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.236， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1。
4) 往步驟2所得的體系2中加入10 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.236， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2。
結果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液後，吸光值1為1.02 (圖6c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液後，吸光值2為1.57 (圖6b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據此可以判 浙存在突變。
實施例5
將該檢測方法應用於檢測人p53基因密碼子282處的點突變，鹼基C突變為鹼基T (參 見文獻Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R, Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005， 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA 19 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和48 5.49 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置8min後加 入4nL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.077，混勻後室溫靜置36min，得到的體系 稱為體系l。
2) 將突變型單鏈DNA 19 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和48 5.49 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置8min後加 入4pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.077，混勻後室溫靜置36min，得到的體系 稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入13 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.261， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520 nm處的吸光值稱為吸光值1 。
4)往步驟2所得的體系2中加入13 pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.261， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2。
結果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液後，吸光值1為0.82 (圖7c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液後，吸光值2為1.21 (圖7b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據此可以判 斷存在突變。
實施例6
將該檢測方法應用於檢測人p53基因密碼子282處的點突變，鹼基C突變為鹼基T[3](參 見文獻Rangel-Lopez A， Maldonado-Rodriguez R, Salcedo陽Vargas M， et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005, 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA 10 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和46 3.87 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置7min後加 入5pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.098，混勻後室溫靜置31min，得到的體系 稱為體系1。
2) 將突變型單鏈DNA 10 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和46 3.87 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置7min後加 入5nL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.098，混勻後室溫靜置31min，得到的體系 稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入14 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.292， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520 nm處的吸光值稱為吸光值1 。
4) 往步驟2所得的體系2中加入14 lmol/L的氧化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.292， 混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520 nm處的吸光值稱為吸光值2。
結果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液後，吸光值1為0.66 (圖8c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液後，吸光值2為0.83 (圖8b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據此可以判 斷存在突變。
權利要求
1.一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特徵在於其具體步驟如下1)將野生型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置後加入氯化鈉溶液，混勻後靜置，得到的體系稱為體系1；2)將突變型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置後加入氯化鈉溶液，混勻後靜置，得到的體系稱為體系2；3)往步驟1所得的體系1中加入氯化鈉溶液，混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1；4)往步驟2所得的體系2中加入氯化鈉溶液，使氯化鈉的終濃度與步驟3中氯化鈉的終濃度相同，混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2；5)當吸光值2與吸光值1有明顯差異時，可以判斷有突變存在。
2. 如權利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特徵在於所述的納米金 的粒徑範圍為5 50nm。
3. 如權利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特徵在於野生型單鏈 DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金的加入量為野生型單鏈DNA :納米 金=(10 50) pmol: (40 50) pL。
4. 如權利要求1或3所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特徵在於與野生型 單鏈DNA序列完全互補的探針與野生型單鏈DNA等量。
5. 如權利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特徵在於在步驟l)中， 氯化鈉的終濃度為0.05~0.1 mol/L。
6. 如權利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特徵在於突變型單鏈 DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金的加入量為突變型單鏈DNA :納米 金=(10 50) pmol : (40 50) nL。
7. 如權利要求1或6所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特徵在於與野生型 單鏈DNA序列完全互補的探針與突變型單鏈DNA等量。
8. 如權利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特徵在於在步驟2)中， 氯化鈉的終濃度為0.05~0.1 mol/L。
9. 如權利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特徵在於在步驟3)中， 氯化鈉的終濃度為0.2-0.3 mol/L。
全文摘要
一種用納米金檢測DNA突變的方法，涉及一種檢測DNA突變的方法。提供一種用納米金探針檢測DNA突變的方法。將野生型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置後加入氯化鈉溶液後靜置得體系1；將突變型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置後加入氯化鈉溶液後靜置得體系2；往體系1加入氯化鈉溶液，混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1；往體系2加入氯化鈉溶液，混勻後作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2；當吸光值2與1有明顯差異時，可判斷有突變存在。DNA和納米金無需作任何修飾，簡化樣品的處理。
文檔編號C12Q1/68GK101344481SQ20081007160
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月18日 優先權日2008年8月18日
發明者孫莉萍, 張其清, 張召武, 張建鋒, 輝 李, 霜 王 申請人:廈門大學