一種提高乙型腦炎病毒效價的方法

2023-05-03 21:48:36

專利名稱：一種提高乙型腦炎病毒效價的方法
技術領域：
本發明涉及一種乙型腦炎病毒增殖的方法，以及製備乙型腦炎病毒疫苗。特別涉及一種能顯著提高乙型腦炎病毒效價的方法。
背景技術：
流行性乙型腦炎(epidemic encephalitis B,簡稱為「乙腦」)又稱日本腦炎(Japanese encephalitis, JE)，是由乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitis virus, JEV,簡稱為「乙腦病毒」)引起的，經蚊蟲傳播的急性傳染病。這種病可嚴重侵犯和感染中樞神經系統，引起臨床發病而呈現神經症狀。同時，該病是一種自然疫源性疾病，不僅可以感染人，還可以感染馬、豬等其他動物。近年來，該病的暴發範圍已由亞洲開始向澳洲等其他地區蔓延。蚊蟲是乙型腦炎病毒的主要傳播媒介，在目前尚無治療乙型腦炎疾病的特效藥物和方法的情況下，控制蚊蟲傳播和進行疫苗免疫接種是現階段控制乙型腦炎疾病的主要防禦手段。目前，乙型腦炎疫苗主要包括三大類:經鼠腦組織培養製備的滅活疫苗、地鼠腎原代細胞或Vero細胞培養製備的滅活疫苗和地鼠腎原代細胞培養製備的減毒活疫苗。其中，應用地鼠腎原代細胞製備的乙 型腦炎滅活疫苗和減毒活疫苗在乙型腦炎病的預防方面起到了重要作用。但另一方面，由於地鼠腎原代細胞在製備過程中受到了胰酶消化條件、培養條件以及病毒本身生物特性等諸多方面的影響，導致乙型腦炎病毒在增殖過程中的效價還不是很好，每批次之間的差異比較大，生產周期長，因此影響免疫原性，甚至還能導致臨床免疫失敗。

發明內容
為了解決以上問題，本發明的發明人通過優化乙型腦炎病毒增殖的條件、改進生產工藝而總結出乙型腦炎病毒增殖的方法及其疫苗的製備方法。通過該方法可以顯著提高乙型腦炎病毒的效價，同時縮短了生產周期，並能由此製備具有更高、更穩定、免疫原性更好的乙型腦炎疫苗。根據本發明的乙型腦炎病毒增殖的方法，該方法包括培養細胞後，向長滿單層的細胞接種乙型腦炎種毒，其中，接種後，待細胞病變達到75-95%時直接收穫病毒液。根據本發明，所接種的乙型腦炎種毒是細胞維持液量的0.5-1體積％。根據本發明，所述細胞為地鼠腎細胞，所述培養細胞的方法包括對採集到的地鼠腎組織進行胰酶消化，分離細胞移入培養液後進行轉動培養；所述胰酶消化包括向採集到的地鼠腎組織中加入胰酶後，置於6_12°C下消化9-12小時。根據本發明，所加入的胰酶與地鼠腎組織的體積比為2-3.5:1，進行胰酶消化的溫度為8-10°C，時間為9.5-10.5小時。根據本發明，進行胰酶消化前，用7-8質量％NaHC03將胰酶的PH調節為7.2—7.4。根據本發明，進行培養的溫度為35.5-38.5 °C，進行培養的細胞濃度為1.8-2.5 X IO8個/L的細胞數量。根據本發明，所述培養液為含10%犢牛血清和100單位/ml的雙抗的乳漢液。根據本發明，所述培養液還含有RPMI1640，且乳漢液與RPMI1640的體積比為1:0.8_1.2。本發明還提供了一種製備乙型腦炎疫苗的方法，該方法包括用乙型腦炎病毒進行配苗，其中，該乙型腦炎病毒由根據本發明的對乙型腦炎病毒進行增殖的方法製得。根據本發明的方法，所述乙型腦炎疫苗為滅活疫苗和/或減毒活疫苗。
具體實施例方式本發明提供了一種乙型腦炎病毒增殖的方法，該方法包括向已長滿單層的細胞接種乙型腦炎種毒，其中，接種後，待細胞病變達到75-95%時直接收穫病毒液。常規的對乙型腦炎病毒進行增殖的過程中，接種了乙型腦炎種毒的細胞病變達到一定程度後，還需要經過至少一次凍融操作後再收穫病毒液。這是因為，一般理論均認為必須通過反覆的凍融才能使細胞破碎釋放出病毒離子，病毒效價得已提高，由此可製備出高品質的疫苗。而本發明人發現，根據本發明的方法不經過凍融直接收穫得到的病毒液反而具有更高的效價，並能製備出均一、穩定、免疫原性好的乙型腦炎疫苗。根據本發明，所述細胞優選為地鼠腎細胞，所述培養細胞的方法包括對採集到的地鼠腎組織進行胰酶消化，分離細胞移入培養液後進行轉動培養。—般而言,胰酶指的是胰蛋白酶(Trypsin),可商購自GIBC0,西格瑪(Sigma)等品牌。根據本發明的方法優選在進行胰酶消化前將胰酶的PH值調整為中性。例如，可以用7-8質量％ (例如7.5質量％)的NaHCO3將胰酶的PH調節至7.2 — 7.4。所加入的胰酶與組織的體積比為2-3.5:1，例如胰酶與地鼠腎組織的體積比為2:U2.2:1、2.4:1、2.6:1、2.8:1、
3:U3.1:U3.2:U3.3:1、3.5:1等。進行消化的溫度為可以是6_12°C，例如可以為6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C等，優選為 8_10°C，例如可以為 8.30C>8.60C>8.90C>9.2°C、
9.6°C>9.8。。、10。。等。在進行胰酶消化的過程中可以輕輕搖晃消化培養液，以使地鼠腎組織塊與胰酶更充分地接觸。進行消化的時間可以是9-12小時，優選為9.5-10.5小時。待地鼠腎組織塊變得膨鬆，並在上層出現絮狀層時，即可倒出胰酶停止消化。隨後，可以進一步對組織進行至少一次脫酶操作，優選用乳漢液進行2-3次脫酶操作。所述乳漢液為加入了 5%。乳蛋白(與漢克氏液質量比)的漢克氏液，其中，乳蛋白和漢克氏液均可商購GIBCO品牌。培養液以乳漢液為溶劑，含有10%犢牛血清(可商購自濟南勁牛生物科技有限公司)和100單位/ml的雙抗。優選培養液中還含有RPMI1640 (商購GIBCO品牌)，乳漢液與RPMI1640的體積比沒有特別的限定，優選為1:0.8-1.2，更優選為1:0.9-1.1。雙抗指的是青黴素和鏈黴素，對本發明中使用的雙抗沒有特別的限制，以能實現本發明的方法為限，可以從例如GIBCO等公司商購獲得。進行培養的溫度和細胞濃度沒有特別的限定，以實現本發明的方法為限。作為一種實施方式，培養的溫度為35.5-38.5°C，進行培養的細胞濃度為1.8-2.5 X IO8個/L的細胞數量。在培養細胞的過程中用肉眼觀察細胞生長情況，待細胞長滿單層(貼壁)時，可以倒出培養液，加入2%的犢牛血清的細胞維持液，所述細胞維持液沒有特別的限定，可以是向乳漢液中加入的2%犢牛血清和100單位/ml的雙抗。對維持液的量沒有特別的限定，一般用量沒過細胞即可。隨後，按照細胞維持液量的0.5-1%體積接種乙型腦炎病毒。對所述乙型腦炎病毒沒有特別的限制，只要能滿足本發明的目的即可。作為一種示例性的實施方式，本發明的乙型腦炎病毒可以為乙型腦炎病毒SA14_14_2株、P3株、Nakayama株(可商購自武漢生物製品研究所)和乙型腦炎病毒的其他分離株中的任意株。接種乙型腦炎病毒後，通過顯微鏡觀察細胞病變的程度，依據生產的需要來確定可收穫病毒液的細胞程度。通常，按照行業內的標準，待細胞病變率達到75-100%即可收穫病毒液。所述地鼠腎組織優選在無菌操作下採集自10-14日齡的地鼠，地鼠可商購自北京維通利華實驗動物有限公司等。隨後，用胰酶對所採集到地鼠腎組織進行胰酶消化，該方法包括向採集到的地鼠腎組織中加入胰酶後，置於6-12°C下消化9-12小時。本發明還提供了一種製備乙型腦炎疫苗的方法，乙型腦炎病毒進行配苗，其特徵在於，該乙型腦炎病毒由根據本發明的對乙型腦炎病毒進行增殖的方法製得。所述配苗的方法沒有特別的限定，可採用本領域公知的方法，指的是將乙腦病毒與凍幹保護劑按照一定比例(例如6-8:1)進行混合，所述明膠保護劑中可以含有8質量％明膠和40質量％蔗糖，明膠和蔗糖均購自中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。根據本發明的製備乙型腦炎疫苗方法，由於在對乙型腦炎病毒進行增殖的過程中省略了凍融操作，使收穫得到的病毒液的效價得到明顯提高，因此，可以用其通過配苗製備效價高、穩定、免疫原性好的乙型腦炎病毒疫苗。作為一種實施方式，所述乙型腦炎疫苗為滅活疫苗和/或減毒活疫苗。綜上，本發明的方法通過省去常規方法中的凍融操作，待細胞達到所需的病變程度後不經過凍融直接收穫病毒液，並對其進行配苗進而製備乙型腦炎疫苗。這樣一方面可以通過顯著提高病毒效價來製得質量更高、更穩定的乙型腦炎病毒。另一方面，該方法能顯著地縮短工藝周期，降低了生產成本，提高了生產效率。實施例下面將結合實施例，以乙型腦炎病毒(SA14_14_2)為例詳細地闡述本發明的方法。需要理解的是，本實施例僅用於示例性地解釋和本發明的內容，本發明並不局限於此。製備實施例1:地鼠腎的處理:將採集的10-14日齡的地鼠腎(商購自北京維通利華實驗動物有限公司)用500ml的含400單位/ml雙抗(商購GIBCO品牌)的漢克氏液(商購GIBCO品牌)清洗兩次。按20隻地鼠的腎組織一個萬毫升細胞瓶為宜。用剪刀將組織剪碎，剪勻。然後用含400單位/ml雙抗的漢克氏液反覆衝洗燒杯內組織，直至燒杯內上清液清澈為止，最後充分沉澱，倒去上清液。胰酶消化:用7.5質量％的NaHC03調節胰酶的PH為7.2—7.4，在將以上沉澱好的組織倒入消化瓶中(無菌操作)。按胰酶:地鼠腎組織為2:1的的體積比加入0.25質量％胰酶(商購GIBCO品牌)，放入6°C冰箱中進行11小時消化。中間可輕搖幾次。使組織塊與胰酶充分接觸，待組織塊變得膨鬆，並在上層出現絮狀層，結束消化。細胞分散和培養:在細胞收集瓶中按培養液量加入含10%犢牛血清(商購自濟南勁牛生物科技有限公司)、 100單位/ml雙抗的乳漢液和RPMI1640 (商購自GIBC0)的培養液，其中乳漢液與RPMI1640的體積比為1:0.8。將消化瓶的胰酶輕輕倒去，用500ml左右的乳漢液進行脫酶，每次脫酶時振搖分散瓶，搖勻沉澱後，將上層分散細胞倒入收集瓶中，重複三次。在進行第三次脫酶，先用力振搖消化瓶，再加液搖勻沉澱，倒入收集瓶，如此進行多次，直至上清液變清，消化瓶中僅剩少量絮狀殘渣為止並棄掉殘渣。使收集瓶中的細胞以IOOOrpm離心IOmin後棄掉上清液。用含10%犢牛血清和100單位/ml的雙抗的培養液重懸細胞並計數，以1.8X IO8個/L的細胞數量接種到轉瓶內，置37°C溫室、轉數為7-8轉/小時轉瓶機上培養。病毒接種和收穫:待細胞長滿單層後，倒出培養液，加入含2%犢牛血清的細胞維持液，沒過細胞。然後按維持液量的0.5體積％接種乙腦種毒，接種後置於35.5°C下進行培養，待細胞病變達到95%時收穫病毒液。所收穫的病毒液不經過凍融，直接應用到配苗中去。製備實施例2:按照與製備實施例1相同的方法進行製備，不同的是:在胰酶消化步驟中，胰酶:地鼠腎組織體積比為2.5:1，置於7°C進行12小時的消化。細胞分散培養步驟中，乳漢液與RPMI1640的體積比為1:0.9進行培養的細胞濃度為2X IO8個/L的細胞數量。病毒接種和收穫中，按維持液量的0.8體積％接種乙腦種毒後，在37°C下進行培養，待細胞病變達到100%時收穫病毒液。製備實施例3:按照與製備實施例1相同的方法進行製備，不同的是:在胰酶消化步驟中，胰酶:地鼠腎組織體積比為3.5:1，置於12°C進行9小時的消化。細胞分散培養步驟中，乳漢液與RPMI1640的體積比為1:1.2進行培養的細胞濃度為2.5 X IO8個/L的細胞數量。病毒接種和收穫中，按維持液量的I體積％接種乙腦種毒後，在38.5°C下進行培養，待細胞病變達到75%時收穫病毒液。對比試驗1:胰酶消化條件優化將200隻10-14日齡的地鼠隨機分成5組，每組40隻。無菌採集5組地鼠的腎組織，並在無菌燒杯內將組織剪碎，剪勻，然後用含400單位/ml雙抗的漢克氏液反覆衝洗燒杯內組織,直至燒杯內上清液清澈為止。進行充分沉澱後，倒去上清液，按胰酶:地鼠腎組織為3:1的體積比加入0.25質量％的胰酶。將 5組腎組織分別置於37°C、8°C、9°C、10°C和4°C冰箱內進行消化。待組織塊變得膨鬆，並在上層出現絮狀層，結束消化，記錄各組的消化時間。取出消化瓶，輕輕倒去胰酶，並用500ml左右的乳漢液脫酶，棄掉上清，再加入乳漢液，搖勻沉澱後，將上層分散細胞倒入收集瓶中，重複進行三次。最終將收集瓶中的細胞液經IOOOrpm離心IOmin後，棄上清液。用含10%犢牛血清和100單位/ml的雙抗的培養液重懸細胞並計數，用臺盼藍染色檢查細胞活力。按照以上分組和消化方法將該試驗再重複兩次，得到的試驗結果列於下表I中。
權利要求
1.一種乙型腦炎病毒增殖的方法，該方法包括培養細胞後，向已長滿單層的細胞接種乙型腦炎種毒，其特徵在於，接種後，待細胞病變達到75-95%時直接收穫病毒液。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所接種的乙型腦炎種毒是細胞維持液量的0.5-1體積％。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述細胞為地鼠腎細胞，所述培養細胞的方法包括對採集到的地鼠腎組織進行胰酶消化，分離細胞移入培養液後進行轉動培養；所述胰酶消化包括向採集到的地鼠腎組織中加入胰酶後，置於6-12°C下消化9-12小時。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所加入的胰酶與地鼠腎組織的體積比為2-3.5:1，進行胰酶消化的溫度為8-10°C，時間為9.5-10.5小時。
5.根據權利要求3所述的方法，其中，進行胰酶消化前，用7-8質量％NaHC03將胰酶的PH 調節為 7.2—7.4。
6.根據權利要求3所述的方法，其中，進行培養的溫度為35.5-38.5°C，進行培養的細胞濃度為1.8-2.5 X IO8個/L的細胞數量。
7.根據權利要求3-6中任意一項所述的方法，其中，所述培養液為含10%犢牛血清和100單位/ml的雙抗的乳漢液。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述培養液還含有RPMI1640，且乳漢液與RPMI1640 的體積比為 1:0.8-1.2。
9.一種製備乙型腦炎疫苗的方法，該方法包括用乙型腦炎病毒進行配苗，其特徵在於，該乙型腦炎病毒由前述任意一項權利要求所述的方法製得。
10.根據權利要求9所述的方法，其中，所述乙型腦炎疫苗為滅活疫苗和/或減毒活疫 苗。
全文摘要
本發明提供了一種乙型腦炎病毒增殖的方法，該方法包括培養細胞後，向已長滿單層的細胞接種乙型腦炎種毒，其中，接種後，待細胞病變達到75-95%時直接收穫病毒液。還提供了製備乙型腦炎疫苗的方法。本方法可以顯著提高乙型腦炎病毒的效價，同時縮短了生產周期，並能由此製備具有更高、更穩定、免疫原性更好的乙型腦炎疫苗。
文檔編號A61K39/12GK103160477SQ20131005850
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月25日 優先權日2013年2月25日
發明者張桂紅, 陶柏輝, 徐雷, 王和平, 黃嵐芬 申請人:湖南中岸生物藥業有限公司