延胡索酸酶轉化底物生產l-蘋果酸的技術的製作方法
2023-05-13 15:38:51 3
專利名稱：延胡索酸酶轉化底物生產l-蘋果酸的技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用延胡索酸酶轉化底物生產L-蘋果酸(下稱LMA)的技術。
L-蘋果酸主要應用於食品工業，它是一種優良的酸味劑和保鮮劑，在各種果子酒，果子露、乳酸菌發酵飲料、人造奶油中添加LMA可保持天然果汁的風味。LMA由於其特殊的酸味特點(酸味刺激較為緩慢，保留時間較長)越來越為許多消費者所偏愛，近年來在食品工業上的應用有逐漸取代檸檬酸的趨勢。LMA直接參與人體的新陳代謝，可用於治療貧血、肝功能不全和肝衰竭等疾病輔助劑，在醫藥工業上有重要的應用價值。此外，LMA在印染工業和建築業上也有其特殊用途。因此，當前國際市場上對LMA的需求量逐漸地增加。
早在1921年，Yuill就報導過，在培養黃麴黴菌時，有少量蘋果酸伴隨琥珀酸和富馬酸產生；1951年，Kitaharo等報導了核盤菌的蘋果酸發酵試驗，1953年，Goodin報導了短密青黴具有產生蘋果酸的能力；日本學者從50年代末起，對蘋果酸發酵進行了大力研究，阿部重雄等研究的發酵法生產蘋果酸最高濃度達50g/l。目前，蘋果酸的生產方法主要有以下幾種①馬來酸或延胡索酸通過水合反應的化學合成法；②以延胡索酸為原料的酶轉化法；③直接發酵法(包括混合發酵和一步發酵技術)和固定化法。但是從相關資料檢索表明目前LMA採用固定化酶法和發酵法，其中(1)固定化法不足之處LMA生產之前先進行細胞培養、過濾或離心、洗滌、細胞破碎，獲得延胡索酸酶，然後再進行包埋等，工藝操作程序繁雜。而且由於延胡索酸酶離開生物體又易於變性失活，造成轉化不徹底，殘餘底物量大，易於超標，產品出口受到限制。所以固定化技術對環境條件要求較高，成本居高不下，影響工業化生產；(2)發酵技術中的混合發酵法劣勢生產LMA時採用兩個菌株混合發酵，因為各菌株要求的營養和培養條件不同而使生長和合成代謝不易控制，致使轉化率和LMA產量均不高，最終也難以實現大規模工業化生產；(3)一步發酵法的缺點是在培養基中接入菌種的同時加入底物(延胡索酸)進行共同發酵，由於菌體生長、延胡索酸酶合成及底物轉化為LMA三個階段的生物學過程各自都需要最適的營養和培養條件，因為在一個培養液中同時發酵和轉化而得不到滿足和難以控制，造成LMA合成水平低(8.5％)，轉化率不高(88％)、生產周期長(90h)、成本高，限制工業化生產。(4)目前國內外也見到純細胞轉化延胡索酸為LMA的報導，但該法不足之處發酵結束後，需將發酵液離心或過濾、細胞洗滌、重新懸浮、再與延胡索鹽溶液混合，調節pH，轉化操作工藝繁瑣，轉化條件不成熟，因此轉化率低(90.8％)、LMA合成水平低(10.96％)、發酵周期長(96h)、成本仍然居高不下。
本發明的目的在於克服現有技術的不足之處而提供高效轉化底物為LMA的新技術。
本發明通過以下技術方案實現首先將延胡索酸溶於NH4OH溶液中，製備成延胡索酸銨溶液(底物)；將黴菌接入培養基後，進行培養、繁殖，合成延胡索酸酶，當發酵液菌體內酶活達到120-200u/100ml時，將不經離心、洗滌，重懸浮和過濾的發酵液與底物一一延胡索酸銨溶液按1∶0.5-1.2直接混合，調節pH7.2-8.0，控制攪拌轉速60r/min，保持溫度30℃，經20h轉化即完成LMA的合成。
下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的說明。
附
圖1中，首先將延胡索酸溶於NH4OH溶液中，製成延胡索酸銨溶液(底物)；其次利用常規的培養基培養，培養菌種種子，然後移入大罐進行發酵培養，當發酵液菌體內酶活達到產酶高峰期後(120-200u/100ml)，將發酵液與延胡索酸銨溶液按1∶0.5-1.2混合，在pH7.2-8.0、攪拌轉速60r/min、溫度30℃的條件下進行混合轉化，即完成LMA的合成。
實施例1
首先取30公斤的延胡索酸溶於30立升40％NH4OH溶液中，製成延胡索酸銨溶液；培養菌種種子，然後移入大罐進行發酵培養，當發酵液菌體酶活達到120u/100ml時，將發酵液與底物——延胡索酸銨溶液混合，混合比例為1∶0.5，調節pH8.0，攪拌轉速60r/min，邊加邊攪拌，溫度保持30℃，酶對底物作用時間20h，即完成LMA的合成。
實施例2首先取30公斤的延胡索酸溶於30立升50％NH4OH溶液中，製成延胡索酸銨溶液；培養菌種種子，然後移入大罐進行發酵培養，當發酵液酶活達到140u/100ml時，將發酵液與底物——延胡索酸銨溶液混合，混合比例為1∶0.8，調pH7.5，攪拌轉速60r/min，邊加邊攪拌，溫度保持30℃，酶對底物作用時間20h，即完成LMA的合成。
實施例3首先取30公斤的延胡索酸溶於30立升60％NH4OH溶液中，製成延胡索酸銨溶液；培養菌種種子，然後移入大罐進行發酵培養，當發酵液酶活達到200u/100ml，將發酵液與底物——延胡索酸銨溶液混合，混合比例為1∶1.2，調pH7.2，攪拌轉速60r/min，邊加邊攪拌，溫度保持30℃，酶對底物作用時間20h，即完成LMA的合成。
本發明主要優點和效益(1)本發明是單菌發酵，培養方式採用菌種培養和底物轉化分開進行，菌種生長和延胡索酸酶合成過程無底物的幹擾，使延胡索酸酶大量合成(增加2-3倍)，加入底物的數量可以根據產酶量由舊工藝10％增加到25-33％，由於滿足各自生物學階段的最適條件，發酵周期由原來的90h縮短至35h。(2)轉化技術發酵液(含菌體酶)與底物溶液直接混合，免去純細胞轉化法中的離心、洗滌、細胞重新懸浮或細胞包埋等繁瑣工藝，操作簡便，工藝簡單，耗能少，周轉率高。(3)酶對底物轉化過程可以在最優化條件下進行，沒有其他生物學反應的幹擾，轉化率高，由舊工藝的88％提高到100-106％，LMA產量可達30％以上。(4)由於轉化徹底，殘留延胡索酸少、產品質量符合出口標準。
權利要求
1.一種利用延胡索酸酶轉化底物生產L-蘋果酸的技術，其特徵在於首先將延胡索酸溶於NH4OH溶液中製備成延胡索酸鹽溶液，按1∶0.5-1.2的比例直接與含有足夠延胡索酸酶的發酵液混合轉化，製備L-蘋果酸。
2.根據權利要求1所述的生產技術，其特徵在於發酵液中菌體細胞內含延胡索酸酶為120-200u/100ml。
3.根據權利要求1所述的生產技術，其特徵在於發酵液與延胡索酸鹽溶液混合前不經離心、洗滌，重懸浮和過濾，混合時邊加邊攪拌，控制攪拌轉速60r/min，調節pH至7.2-8.0，溫度保持在30℃，轉化時間20h。
全文摘要
本發明涉及利用延胡索酸酶轉化底物生產L－蘋果酸(下稱LMA)的技術。本發明將延胡索酸溶於濃度為40－60％NH
文檔編號C12P7/40GK1523115SQ0315922
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月4日 優先權日2003年9月4日
發明者施巧琴, 吳松剛, 周曉蘭, 謝必峰, 黃建忠 申請人:福建師範大學