紅景天苷及其雜質的分離方法和紅景天苷及其雜質的rp-hplc分析法的製作方法

2023-05-03 23:31:36

專利名稱：：紅景天苷及其雜質的分離方法和紅景天苷及其雜質的rp-hplc分析法的製作方法
技術領域：
：本發明涉及紅景天苷和其三個雜質的分離及其高效液相色譜分析法。
背景技術：
：紅景天苷，英文名salidroside,化學名"對羥苯乙基-p-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydroxyphenethyl-p-D-glucoside)",系統命名l-(4-羥基)苯乙基-J3-D-吡喃葡萄糖苷，主要從高原藥用植物"紅景天"(朋ocfe/asacAa/fne;w的和常用中藥"女貞子"("gw掛Mw/wc!Www)中提取獲得[徐寶軍，鄭毅男，李向高.紅景天屬植物研究新進展.中藥材，2000，23(9):580-584;石力夫，蔡溱，曹穎瑛，等.中藥女貞子的化學成分及其藥理作用.藥學實踐雜誌，1997,15(4):197-200]。藥理實驗表明，紅景天提取物紅景天苷有良好的心血管系統作用[甄志軍，李志華，李劍.紅景天苷對大鼠血管平滑肌細胞增殖和TGF-B表達的影響.心臟雜誌，2002，14(5):458;鄒琛，吳翔，姜敏輝，等.紅景天苷對乳鼠心肌細胞過氧化損傷的保護作用.南通醫學院學報，2003，23(4):193-195;王曉松，房家智，張曉豔，等.紅景天苷，酮對大鼠心血管功以有的影響.白求恩醫科大學學報，1996，22(1):7-9]，在腦缺血、缺氧，神經元細胞凋亡方面均有一定的保護作用[宋月英，齊剛，李亞萍，等.紅景天苷對全腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織腫瘤壞死因子-a表達的影響.中草藥，2006,37(6):907-908;王華，姚文兵，錢雲飛，等.紅景天苷對NaCN及缺糖誘導PC12細胞凋亡的保護作用.中國藥科大學學報，2007，38(3》273-276;陳宏，陳建宗，厚榮榮.紅景天苷對百草枯所致PC12細胞凋亡的抑制作用及相關機制.中國藥理學與毒理學雜誌，2007，21(3):190-196]。因此，大力開發紅景天苷的藥用價值，生產紅景天苷原料藥已成為一種趨勢。目前，國內外對紅景天屬植物的化學成分研究較多，已先後從各種紅景天中分離得到40多種化學成分，其主要成分為紅景天苷(salidroside)及其苷元酪醇(Ptyrosol)、酪薩維(Rosavin或Rosavidine)、二苯甲基六氫吡啶(Pyridrde)、紅景天素即草質素-7-氧-(3-氧-j3-D吡喃葡萄糖基)-a-L-吡喃鼠李糖苷(Rhodiosin)和草質素-7-氧-a-L-吡喃鼠李糖苷(Rhodionin)[張曉丹，餘自雲，張茹.紅景天屬植物的化學成分研究進展.航空航天醫藥，2006，17(1):61-63]。其中大花紅景天的主要化學成分為紅景天苷、酪醇、大花紅景天素、異戊烯-3-O-p-D-葡萄糖苷、6-0-galloysalidroside、沒食子酸、1，2，3，4，6-penta-0-galloyl-卩-D-glucopyranoside、草質素-7-0-D-L-吡喃鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖[駱傳環，舒融.紅景天中糖組份的分析.中國醫藥工業雜誌，1997,28(10):463-464;王曙，王鋒鵬.大花紅景天化學成分的研究.藥學學報，1992，27(2):117-120]。紅景天苷含量測定的方法主要有高效液相色譜法、薄層色譜法、比色法、高效毛細管電泳法、氣相色譜法和極譜法[趙慧，賈凌雲，孫長山，等.RP-HPLC法測定複方紅景天片劑中紅景天苷的含量.瀋陽藥科大學學報，2005，22(1):23-25;徐曉瑩，李寶明，何麗一.紅景天中紅景天苷的薄層光密度測定法的研究.藥物分析雜誌，1996,16(4):272-273;鄧昌國，孫殿甲，堵年生.重氮鹽比色法測定紅景天膠囊中酚性成分的含量.中成藥，1995，17(6》36-37;王洪倫，明永飛，李玉林，等.紅景天中紅景天苷和酪醇的毛細管電泳法分析.分析實驗室，2005，24(1):40-41;康勝利，王晉，張堅，等.氣相色譜法測定紅景天屬植物中紅景天苷及百脈根苷的含量.中國中藥雜誌，1998，23(6):365-366;熊曉燕，向仕學，湯曉勤.保健酒中功效成分紅景天苷的極譜分析.中國公共衛生，1998，14(12):749]，其中應用最廣泛的仍為高效液相色譜法。但大多數含量測定主要針對的是單味藥材或複方製劑中紅景天苷的含量，同時測定紅景天苷原料藥中紅景天苷及其共存雜質含量的方法尚未見報導。紅景天苷已被開發上市的劑型主要有片劑(聖蓮牌紅景天片劑)、膠囊劑(中脈紅景天膠囊)、注射劑(大株紅景天注射液)、口服液(雪山紅景天口服液)及功能性飲料。本發明所用的紅景天苷主要用於凍乾粉針的原料，根據當前歐美國家的GMP要求，所有在歐美國家申請銷售的藥品，包括原料藥和生產中間體均應有它的雜質列表，對生產製造和精製的工藝中產生的，含量超過0.1%的雜質需要進行結構確證，因此分離紅景天苷原料藥中雜質並對其進行結構確證是非常有必要的。一般藥物雜質的分離多採用矽膠柱色譜法，但此法分離效果較差。本發明首先採用矽膠柱色譜對紅景天苷原料藥中雜質進行富集，然後再用高效液相色譜對其製備純化，所得3個雜質單體經過紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質譜(MS)、核磁共振譜0HNMR、13CNMR、COSY、DEPT、HSQC和HMBC)表徵，分別推測為對羥乙基苯基-4-氧-p-D-葡萄糖苷(4-(2-hydroxylethyl)-phenol-l-0-p-D-glucopyranoside,HEPG),對羥苯乙醯氧基-卩-D-P比喃葡萄糖苷(4'-hydroxyphenacyip-D-gluopyranoside，HPAG)及對乙醯基苯基-4'-氧-p-D-葡萄糖苷(paraacetylphenyl-O-p-D-glucopyranoside，PAPG)，與淫羊藿次苷、對羥苯乙醯氧基-13-D-吡喃葡萄糖苷、雲杉素比較，結構得到確認，且均為從紅景天屬植物中首次發現。
發明內容本發明的目的是提供分離紅景天苷原料藥中三個雜質的方法，及其紅景天苷和三個雜質的高效液相色譜分析法。本發明的技術方案如下-一種分離紅景天苷原料藥中紅景天苷和三個雜質的方法，它由下列步驟組成步驟1.用矽膠柱色譜分離步驟l丄拌樣稱取100目矽膠倒入蒸發皿中，再倒入含量約97%的紅景天苷的甲醇飽和溶液以正好覆蓋為宜(紅景天苷樣品與矽膠比為1:0.68,w/w),攪拌均勻蒸去大部分甲醇，在60'C的真空乾燥箱中乾燥至恆重，步驟1.2.裝柱將200-300目矽膠225g用氯仿溼法裝柱，平衡，步驟1.3.上樣取拌樣矽膠(約含有相當於5g樣品)，加於色譜柱頂端，步驟1.4.洗脫氯仿甲醇梯度洗脫(M:1—10:1—6:i),流速為3—4滴/秒，分4段收集，步驟2.用半製備型髙效液相色譜分離純化紅景天苷及其雜質，其中半製備型高效液相色譜條件為-色譜柱ODSCis,5拜，250xl0.0mm(I.D.),流動相組成體積比甲醇水=11:89,流速3.0mL/min,柱溫25'C,檢測波長UV275nm，進樣量50pL。分段收集流出液，HPLC跟蹤檢測。一種紅景天苷及其雜質的高效液相色譜分析法，其特徵是採用反相高效液相色譜法，高效液相色譜條件為-色譜柱ODSC18,5nm，150x4.6mm(I.D.),流動相組成體積比甲醇水=15:85,流速1.0mL/min,柱溫25'C,檢測波長UV275nm,進樣量20pL。測定主成分含量時，溶液濃度太大會導致主峰超線性而使定量不準，故將樣本稀釋4倍後測定。採用本發明的紅景天苷及其雜質的高效液相色譜分析法可以同時準確測定紅景天苷樣品中salidroside及其雜質HEPG、HPAG及PAPG的含量。為生產進程中的質量控制分析提供了簡單可靠的方法。圖1為紅景天苷及其雜質的紫外圖譜，其中(A)紅景天苷；(B)HEPG;(C)HPAG;(D)PAPG。圖2為不同製備色譜條件的色譜圖，其中色譜柱(A)KromasilC18;(B)LichrospherC18;(C)PhenomenexC18;色譜柱PhenomenexCi8流動相(D)12%甲醇-88%水；(E)11%甲醇-89%水；(F)10%甲醇-90%水；色譜柱Phenomenexds柱溫(G)3(TC;(H)25。C;(I)20。C;進樣量(J)50pL;(K)lOOnL。圖3為分離後的3個雜質純品的色譜圖，其中(A)HEPG;(B)HPAG;(C)PAPG。圖4為紅景天苷的標準曲線。圖5為HEPG的標準曲線。圖6為HPAG的標準曲線。圖7為PAPG的標準曲線。圖8為紅景天苷的對照品的色譜圖。圖9為樣品中主成分紅景天苷含量測定的色譜圖。圖10為HEPG、HPAG、PAPG對照品混合液的色譜圖。圖11為樣品中雜質HEPG、HPAG、PAPG含量測定的色譜圖。具體實施例方式實驗儀器及色譜條件UV-2450型紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)。島津半製備型高效液相色譜儀，配備LC-6AD，SPD-10Avp，CTO-10ASvp,(日本島津公司)。色譜分離系統的控制和記錄由HW-2000色譜工作站完成。色譜柱選用的是PhenomenexC18(Phenomenex公司)，5nm,250x10.0mm(I.D.)。流動相甲醇水-ll:89(vZv);流速3.0mL/min;柱溫25'C;檢測波長UV275nm。島津分析型高效液相色譜儀，配備LC-10ATyp，SPD-10Ayp,CTO-10ASyp(日本島津公司)。色譜分離系統的控制和記錄由HW-2000色譜工作站完成。色譜柱選用的是Shim-packds(島津公司)，5^un,150x4.6mm(I.D.)。流動相甲醇水=15:85(v/v);流速1.0mL/min;柱溫25°C;檢測波長UV275nm。試劑與藥品紅景天苷原料藥由四川恆星生物醫藥有限公司提供，紅景天苷，HEPG，HPAG及PAPG對照品為自製。所有的對照品均經過紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質譜(MS)、核磁共振譜(NMR)表徵，並與紅景天苷、淫羊藿次苷、對羥苯乙醯氧基-p-D-吡喃葡萄糖苷、雲杉素比較，結構得到確認。氯仿(分析級)，甲醇(分析級)，甲醇(色譜級)購自江蘇漢邦科技股份有限公司。實驗中流動相和溶液用水均為雙蒸水。實施例1.矽膠柱色譜富集雜質拌樣稱取適量IOO目矽膠倒入蒸發皿中，再倒入適量含量約97%的紅景天苷的甲醇飽和溶液以正好覆蓋為宜(樣品與矽膠比為1:0.68，w/w)，攪拌均勻蒸去大部分甲醇，在6(TC的真空乾燥箱中乾燥至恆重。裝柱將200—300目矽膠225g用氯仿溼法裝柱，平衡。上樣取8.5g拌樣矽膠(約相當於5g樣品)，加於色譜柱頂端。洗脫氯仿甲醇梯度洗脫(14:1—10:1—6:i)，流速為3—4滴/秒，分4段收集。實施例2.高效液相色譜製備雜質2.1半製備型高效液相色譜條件的選擇供試品溶液製備取含量約97%紅景天苷原料藥適量，加甲醇製成每lmL含有0.2g的溶液，作為供試品溶液，微孔濾膜過濾，分別在不同條件下進樣。2丄1檢測波長用UV-2450型紫外-可見分光光度儀在200-400nm進行連續掃描，可知紅景天苷在275nm處有最大吸收，HEPG、HPAG及PAPG分別在270、280及265處有較強的吸收。兼顧三者測定的靈明度，故選擇檢測波長為275nm(見圖1)。2.1.2色譜柱不同廠家的色譜柱由於採用的填料不同，柱效相差較大。即使流動相條件一致，用不同填料的色譜柱重複測試時，不僅分離效果大不相同，而且保留時間的遷移也比較明顯。本實驗比較了3個不同的色譜柱[KromasilC18(250xl0.0mm，5nm);LichrospherCi8(250xl0.0mm，5pm);PhenomenexC18(250xl0.0mm,5nm)〗。見圖2A-圖2C，結果表明PhenomenexCw柱色譜分離較好。2丄3流動相PhenomenexCi8,柱溫25'C，流速3.0mL/min，檢測波長275nm，進樣量50jiL。本實驗比較了3個比例的流動相甲醇水=(12:88，v/v)、甲醇水-(ii:89,v/v)和甲醇水=(10:90，v/v)。見圖2D-圖2F，結果表明甲醇水-ii:89分離效果較好。2.1.4柱溫PhenomenexCis,甲醇水11:89，流速3.0mL/min，檢測波長275nm，進樣量50nL。柱溫往往會影響分離的效果，考慮到苷類物質在高溫下不穩定，易發生水解，因此本實驗柱溫只在2030'C範圍內考察，從試驗了三個溫度(2(TC、25'C和30'C)下的色譜分離情況看，25'C下有較好分離，最終確定柱溫為25'C,見圖2G-圖21。2丄5進樣量PhenomenexCis，柱溫25'C,甲醇水11:89,流速3.0mL/min，檢測波長275nm。在供試品濃度達到0.2g/mL同時增加進樣體積，考察進樣超載情況，從進樣lOOpL的色譜圖看色譜峰峰寬增加，分離效果變差，最終確定進樣量為50pL(0.2g/mL),見圖2J-圖2K。2.2製備雜質色譜條件柱溫25'C，流動相甲醇水11:89,流速3.0mL/min，檢測波長275nm,進樣量50pL。將實施例1所得4部分接收液除去溶劑，用適量甲醇溶解，微孔濾膜過濾，按上述色譜條件分段收集流出液，HPLC跟蹤檢測純度，符合規定要求，見圖3和圖8。實施例3.結構鑑定3個雜質均經過紅外光譜(IR)、質譜(MS)、核磁共振譜('HNMR、13CNMR、^^HCOSY、DEPT、HSQC和HMBC)表徵，其波譜數據與文獻報導的淫羊藿次苷、對羥苯乙醯氧基-P-D-吡喃葡萄糖苷、雲杉素的波譜數據一致[參見ToshioMiyase;AkiraUeno;NobuoTakizawa.戶/^odew/WAy.1989，2&3484-3485.P肌，H,F.iViytoc/ie/msfry1995，39，1423—1428.Roger,A.D.;Lucia,V.H.;Arnold,J.V./%tocAe/msr/7.1986,25,1201-1204],確定其分別為淫羊藿次苷、對羥苯乙醯氧基-(3-D-吡喃葡萄糖苷、雲杉素。實施例4.分析型色譜條件的選擇為了兼顧主成分含量與雜質含量的測定，在測定雜質時，樣品的濃度必須較大，足以使雜質能夠出峰；測定主成分含量時，溶液濃度太大會導致主峰超線性而使定量不準，故將樣品稀釋4倍後測定，試驗準確度(見表l)令人滿意。實施例5.標準曲線對照品溶液的配製取紅景天苷對照品適量，精密稱定，加流動相製成lmL含有l.Omg的對照品儲備液，分別精密移取適量儲備液用流動相配製成系列對照品溶液。，分別取HEPG、HPAG和PAPG對照品適量，精密稱定，加流動相製成lmL含有l.Omg的儲備液。精密移取6.00mLHPEG、l.OOmLHPAG和0.60mLPAPG儲備液加入同一10mL容量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻，得濃度為HEPG、HPAG及PAPG濃度分別為0.60mg/mL、0.10mg/mL、0.06mg/mL的混合對照品儲備液，進行HPLC分析，結果見圖10。再逐級稀釋得系列對照品溶液。在紅景天苷對照品溶液濃度範圍為0.03~1.0mg/mL，取2(^L進樣，以峰面積對濃度作圖(見圖4)，回歸方程為Asaiidroside(area)=14948+3E6Csalidroside,r=0.9999在HEPG、HPAG及PAPG對照品溶液濃度範圍分別為0.0010.03mg/mL、0.0003~0.005mg/mL及0.0001-0.003mg/mL，取混合對照品溶液20pL進樣，以峰面積對濃'度作圖(見圖5、6、7)，回歸方程分別為AHEPG(area)=-49.071+2E6CHEPG，r=0.9994Ahpag(area"16!3.66+5E6CHPAG,r=0.9990ApAPG(area)=58.623+2E7CPAPG，r=0.9993當信噪比S/N=3時，測得HEPG、HPAG、PAPG及紅景天苷的最低檢測限分別為0.00005mg/mL、0.00001mg/mL、0.00001mg/mL和0.000lmg/mL。實施例6.樣品測定3.1主含量的測定'樣品溶液的製備取紅景天苷試樣適量，精密稱定，加流動相製成lmL含有l.Omg溶液，搖勻備用。移取25mL上述溶液置於100mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻備用。選擇5個批號的樣品，按上述方法配製樣品溶液，在最佳試驗條件下進行HPLC分析,進樣量為20nL(見圖9)。3.1雜質測定樣品溶液的製備取紅景天苷試樣適量，精密稱定，加流動相製成lmL含有l.Omg溶液，搖勻備用。選擇5個批號的樣品，按上述方法配製樣品溶液，在最佳試驗條件下進行HPLC分析，進樣量為20nL(見圖11)。樣品中主成分及雜質的檢測結果見表1。表1.檢測結果tableseeoriginaldocumentpage10權利要求1.一種分離紅景天苷原料藥中紅景天苷和三個雜質的方法，其特徵是它由下列步驟組成步驟1.用矽膠柱色譜分離步驟1.1.拌樣稱取100目矽膠倒入蒸發皿中，再倒入含量約97％的紅景天苷的甲醇飽和溶液以正好覆蓋為宜，攪拌均勻蒸去大部分甲醇，在60℃的真空乾燥箱中乾燥至恆重，步驟1.2.裝柱將200-300目矽膠225g用氯仿溼法裝柱，平衡，步驟1.3.上樣取拌樣矽膠，加於色譜柱頂端，步驟1.4.洗脫氯仿∶甲醇梯度洗脫，流速為3-4滴/秒，分4段收集，步驟2.用半製備型高效液相色譜分離純化紅景天苷及其雜質，其中半製備型高效液相色譜條件為色譜柱ODSC18，5μm，250×10.0mm(內徑)，流動相組成體積比甲醇∶水＝11∶89，流速3.0mL/min，柱溫25℃，檢測波長UV275nm，進樣量50μL，分段收集流出液，HPLC跟蹤檢測。2.—種紅景天苷及其雜質的高效液相色譜分析法，其特徵是採用反相高效液相色譜法，高效液相色譜條件為-色譜柱ODSC18,5拜，150x4.6mm(內徑)，流動相組成體積比甲醇水=15:85,流速'.l.Omiymin，柱溫25'C，檢測波長UV275nm,進樣量20nL。3.根據權利要求2所述的紅景天苷及其雜質的高效液相色譜分析法，其特徵是測定主成分紅景天苷含量時，將測定雜質的試樣稀釋4倍後測定。全文摘要一種紅景天苷雜質的分離方法，它是先用矽膠柱色譜分離，用氯仿-甲醇梯度洗脫，分四段收集，然後用半製備型高效液相色譜分離純化，其中半製備型高效液相色譜條件為色譜柱ODSC18，5μm，250×10.0mm(I.D.)，流動相組成體積比甲醇∶水＝11∶89，流速3.0mL/min，柱溫25℃，檢測波長UV275nm，進樣量50μL。分段收集流出液。紅景天苷及其雜質的高效液相色譜分析法，採用反相高效液相色譜法，色譜條件為色譜柱ODSC18，5μm，150×4.6mm(I.D.)，流動相甲醇∶水＝15∶85，流速1.0mL/min，柱溫25℃，檢測波長UV275nm，進樣量20μL。採用本發明的紅景天苷及其雜質的高效液相色譜分析法可以同時準確測定紅景天苷樣品中salidroside及其雜質HEPG、HPAG及PAPG的含量。為生產進程中的質量控制分析提供了簡單可靠的方法。文檔編號C07H15/18GK101357932SQ20081019616公開日2009年2月4日申請日期2008年9月12日優先權日2008年9月12日發明者豔彭,飛李,偉楊,晶羅,都述虎,慶陸,陳立娜申請人:南京醫科大學