用於定量測定1,5－失水葡糖醇的方法

2023-05-03 19:31:21

專利名稱：用於定量測定1,5－失水葡糖醇的方法
技術領域：
本發明涉及用於酶促測定1，5-失水葡糖醇(anhydroglucitol)的方法、在這種方法中所用的試劑、適宜用於1，5-失水葡糖醇酶促測定方法的新海藻糖酶以及產生新海藻糖酶的方法。1，5-失水葡糖醇濃度的測定在糖尿病的診斷中是有用的。
背景技術：
已知1，5-失水葡糖醇存在於人腦脊髓液和血漿中，在患某些疾病(尤其是糖尿病)的患者中1，5-失水葡糖醇的水平有變化，因此它作為糖尿病的一個診斷標誌是重要的。先前用於1，5-失水葡糖醇定量測定的方法是包括使用特定的分析儀器(如氣相色譜)的方法、使用特異性地氧化1，5-失水葡糖醇的酶的方法(日本出版的未審查的專利申請79780/87)以及一種包括下列步驟的方法通過使用各種酶把在樣品中的物質(如葡萄糖)轉化成為其它物質，然後通過使用吡喃糖氧化酶或L-山梨糖氧化酶測定留在樣品中1，5-失水葡糖醇的量(日本出版的未審查的專利申請185397/88)。
通常，儀器分析(如液相色譜和氣相色譜)要對樣品進行複雜的預處理，並需要昂貴的特定儀器，同時是非常耗時的；因此，這種方法不適合於大量樣品的分析。在使用特異性地作用於1，5-失水葡糖醇的酶的方法中，不易於製備酶並將其用於適當的檢測系統。使用吡喃糖氧化酶的方法的缺陷在於吡喃糖氧化酶的底物特異性較低。
發明描述本發明涉及下列方面一種用於定量測定樣品中1，5-失水葡糖醇的方法，該方法包括使樣品與活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶共存，然後測定所說酶的活性；定量測定1，5-失水葡糖醇的試劑，該試劑包括活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶、所說酶的底物以及定量測定由所說酶活性形成的物質的試劑；對1，5-失水葡糖醇具有0.33mM或更小的Ki值的新海藻糖酶，該海藻糖酶具有下列理化性質(1)作用它催化如通式(I)所示的反應，其中在水的存在下1分子的海藻糖被水解成2分子的D-葡萄糖海藻糖+水—————→2D-葡萄糖 (I)(2)底物特異性它特異性地作用於海藻糖，(3)底物親和對海藻糖的Km值是6.7mM，(4)最適pH和穩定pH值酶的最適pH是5-6，在50℃處理30分鐘時，酶在5-10的pH範圍中是穩定的，(5)最適溫度和耐熱性最適溫度在45℃左右，在pH5.0下處理30分鐘時，酶在達到50℃時是穩定的，(6)抑制劑可被金屬螯合劑(如，1，10-菲繞啉、乙二胺四乙酸(下文中稱為EDTA)和2，2-二吡啶)、SH封閉劑(如p-汞苯甲酸和碘乙醯胺、羥胺、硫酸鎳等)抑制，(7)分子量通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的酶的亞單位的分子量是大約90,000，通過凝膠過濾方法測得的酶的分子量是大約400,000；和一種產生具有上述理化性質的新海藻糖酶的方法，該方法包括在培養基中培養屬於諾卡氏菌屬並具有產生所說海藻糖酶能力的微生物，並從培養物回收所說海藻糖酶。
本發明可用於測定任何包含1，5-失水葡糖醇的樣品，例如，生物樣品如腦脊髓液、血清、血漿和尿樣以及這些樣品的處理液體。
作為活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶，任何來源於昆蟲、動物、植物、微生物等的酶都可使用，只要其活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制。優選的實例是催化作為底物的海藻糖的酶，如海藻糖酶和海藻糖磷酸化酶。這些酶可作為商業產品獲得，或可通過培養微生物製備。
產生海藻糖酶的微生物包括屬於鏈黴菌屬、諾卡氏菌屬或紅球菌屬的微生物。
屬於鏈黴菌屬的微生物的例子是金黴素鏈黴菌ATCC 10762和色褐鏈黴菌ATCC 23896。屬於諾卡氏菌屬是微生物的例子是南非諾卡氏菌ATCC6865。屬於紅球菌屬的微生物的例子是圓紅球菌ATCC 14898、圓紅球菌ATCC 15076和玫瑰色紅球菌ATCC 17895。
產生海藻糖磷酸化酶的微生物包括屬於鏈孢菌屬或動孢囊菌屬的微生物。
屬於鏈孢菌屬的微生物的例子是鏽色鏈孢菌FERM BP-4329。屬於動孢囊菌屬的微生物的例子是桔橙動孢囊菌ATCC 29727。
在下列文獻中描述了以上微生物所屬的種的菌學性質。金黴素鏈黴菌Bergeys細菌系統分類學手冊，vol.4，P.2478(1989)色褐鏈黴菌Bergey s細菌系統分類學手冊，vol.4，P.2472(1989)南非諾卡氏菌Bergey s細菌系統分類學手冊，vol.2，P.1469(1986)和vol.4，P.2359(1989)圓紅球菌Bergeys細菌系統分類學手冊，vol.2，P.1479(1986)和vol.4，P.2369(1989)玫瑰色紅球菌Bergeys細菌系統分類學手冊，vol.4，P.2365-2367(1989)鏽色鏈孢菌Int.J.Sys t.Bacteriol.，36，512-517(1986)桔橙動孢囊菌Bergeys細菌系統分類學手冊，vol.4，P.2504-2506(1989)用於培養上述微生物的方法和純化由它們產生的酶的方法描述如下。
對於產生海藻糖酶的微生物(例如，屬於鏈黴菌屬、諾卡氏菌屬或紅球菌屬的微生物)和產生海藻糖磷酸化酶的微生物(例如，屬於鏈孢菌屬或動孢囊菌屬的微生物)的培養，使用培養放線菌、細菌等的常規方法。
作為培養基，可以使用天然或合成培養基，只要它包含碳源、氮源、無機鹽等。
作為碳源，可以使用碳水化合物、糖醇、有機酸等。碳水化物的例子是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、澱粉和糖蜜。糖醇的例子是甘油、山梨醇和甘露醇。有機酸的例子是醋酸、乳酸、乙醯甲酸和檸檬酸。
作為氮源，可以使用無機或有機銨鹽、含氮有機物質等。無機或有機銨鹽的例子是氨、氯化銨、碳酸銨、磷酸銨和乙酸銨。含氮有機物質的例子是尿素、胺基酸、腖、NZ-胺、肉膏、玉米漿、酪蛋白水解產物和酵母抽提物。
作為無機鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵等。
作為培養方法，優選地使用液體培養，具體來說是浸沒攪拌培養。培養通過靜態培養或充氣和攪拌在pH值6.0至8.0於25至37℃的溫度下進行1至7天。
通過按照上述的方式培養微生物，形成了主要在微生物細胞中的海藻糖酶或海藻糖磷酸化酶。從培養物中回收海藻糖酶或海藻糖磷酸化酶可以，例如，按下列方式進行。
在完成培養之後，通過離心或過濾從培養物中收集微生物細胞，然後通過超聲處理或類似的方法破壞細胞以獲得粗製酶提取物。按照通常用於酶純化的方法(如鹽析、用有機溶劑沉澱、透析、離子交換色譜法、凝膠過濾和凍幹法)處理粗製酶提取物，由此可獲得純化的海藻糖酶或純化的海藻糖磷酸化酶。
本發明的新海藻糖酶的理化性質如下。
(1)作用本發明的酶催化如通式(I)所示的反應，其中在水的存在下1分子的海藻糖被水解成2分子的D-葡萄糖海藻糖+水—————→2D-葡萄糖 (I)(2)底物特異性和抑制特異性對100mM磷酸緩衝液(pH5.5)中的1.75mM的底物濃度測定了酶對各種底物的活性。結果作為相對活性在表1中顯示，把對海藻糖的活性定義為100。
表1糖 相對活性(％)海藻糖 100海藻糖胺 0.5曲二糖0Nigerose 0麥芽糖0乳糖 0蔗糖 0從表1中可明顯地看出，所述酶特異性地作用於海藻糖。本發明也使用海藻糖作為底物測定了所述酶對1.75mM各種糖的抑制特異性。結果在表2中顯示。
表2糖 抑制率(％)1，5-失水葡糖醇80.7曲二糖 0Nigerose 0麥芽糖 0乳糖 0蔗糖 0(3)底物親和性在pH5.5時通過Lineweaver-Burk圖[J.Am.Chem.、Sec.，56，658(1934)]測定的所述酶對海藻糖的Km值是6.7mM。
(4)抑制親和性在pH5.5時通過Lineweaver-Burk圖測定的所述酶對1，5-失水葡糖醇的Ki值是0.33mM。
(5)最適pH使用pH5.0-8.0的磷酸緩衝液測定酶活性以確定最適pH值。獲得了如

圖1所示的pH-活性曲線。酶的最適pH是5-6。
(6)pH穩定性在50℃下於pH2.6-12.0的通用緩衝液中(Johnson-Lindsay緩衝液，生物化學基本方法，vol.6，Maruzen)處理30分鐘之後，測定了殘留的酶活性。如圖2所示，酶在5-10的pH值範圍內是穩定的。
(7)耐熱性通過把酶於不同的溫度下在pH5.0的磷酸緩衝液中保持30分鐘並測定剩餘的活性來研究酶的耐熱性。如圖3所示，酶在達50℃時是穩定的。
(8)最適溫度使用pH5.5的磷酸緩衝液測定酶的最適溫度。如圖4所示，最適溫度在45℃左右。
(9)抑制劑和金屬離子的影響在1mM的濃度下研究各種金屬螯合劑、酶抑制劑和金屬離子對酶的影響。結果如表3中所示。
表3化合物 抑制率(％)二乙基二硫代氨基甲酸 51.02，2-二吡啶 60.0EDTA 67.61，10-菲繞啉 88.5p-汞苯甲酸94.7N-乙基馬來醯亞胺21.9碘乙醯胺83.6N-溴代琥珀醯亞胺23.4羥胺 81.2疊氮化鈉22.8CoCl220.4NiSO462.1
ZnSO453.4BaCl240.7酶可被金屬螯合劑(如，1，10-菲繞啉、乙二胺四乙酸和2，2-二吡啶)、SH封閉劑(如p-汞苯甲酸和碘乙醯胺、羥胺、硫酸鎳等)抑制。
(10)分子量通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的酶的亞單位的分子量是大約90,000，通過使用高效液相色譜的凝膠過濾方法測得的酶的分子量是大約400,000。
(11)均一性通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳酶作為單一的帶分離。也就是說，蛋白質的單一帶通過在Tris-甘氨酸緩衝液(pH8.3)中電泳60分鐘、其後通過以考馬斯染色液染色觀察到。
(12)酶活性的測定方式酶活性以下列方式測定。
1)試劑(i)底物溶液把海藻糖溶解在100mM磷酸緩衝液(pH5.5)中以形成12.5mM的濃度。
(ii)生色劑把葡糖氧化酶(Toyobo有限公司，等級II)、過氧物酶(Toyobo有限公司，等級III)、4-氨安替比林和酚溶解在水中以形成分別為0.04mg/ml、1.2mM和21mM的最終濃度。
2)步驟向1ml的底物溶液添加0.02ml的酶溶液，反應在37℃下進行30分鐘。反應通過在100℃下加熱3分鐘停止。向反應混合物添加1ml生色劑，反應在37℃下進行20分鐘，其後測定在500nm的吸光度。通過在上述步驟中使用水代替酶溶波製備對照溶液。
3)活性計算海藻糖酶活性以單位表達，一個單位定義為在37℃下1分鐘內水解1μmol海藻糖的酶的量。可按照下列等式從吸光度淨差(酶溶液-對照溶液)計算每毫升酶溶液的活性(U/ml)。

產生本發明的新海藻糖酶的方法描述如下。在該方法中，使用以上所述的屬於諾卡氏菌屬並具有產生新海藻糖酶能力的微生物。適合的菌株典型的例子是Nocardia sp.NK-2067，這是由本發明的發明者從土壤中分離的菌株。菌株的菌學性質如下所示。研究菌學性質的實驗主要按照TakejiHasegawa微生物的分類和鑑定，東京大學出版社(1975)中的說明進行。菌株的分類和鑑定參考Bergeys細菌分類學手冊，vol.1-4(1986-1989)等進行。
本發明的發明者發現新從土壤中分離的屬於諾卡氏菌屬的放線菌NK-2067能產生對1，5-失水葡糖醇高度敏感的海藻糖酶。
上述放線菌NK-2067的形態、培養和生理學特徵描述如下。1.形態特徵1)菌絲氣生菌絲的形成單分枝氣生菌絲的裂殖可觀察到底部菌絲的裂殖可觀察到2)孢子孢子的形成和位置在氣生菌絲上的形成孢子囊的形成和定位未觀察到在孢梗的末端形成的鏈狀孢子數目10或10個以上孢子的特徵表面結構光滑形狀和大小杆狀，ca.0.7-1.0μm×0.7-2.0μm孢子的遊動性和鞭毛的存在未觀察到3)其它厚垣孢子未觀察到菌絲束未觀察到假孢子囊未觀察到菌絲分枝方式單分枝2.培養特徵NK-2067菌株在通常使用的合成培養基和天然培養基上顯示出適中或良好的生長。底物菌絲的顏色是白到淺粉紅色。可溶性棕色色素的形成可在一些培養基上觀察到。
培養特徵(如在28℃培養14天之後在各種培養基上觀察到的NK-2067菌株的生長和顏色)如下所示。顏色名字按照顏色調和手冊[美國Container公司，第4版(1958)]給定。1)蔗糖-硝酸鹽瓊脂培養基生長不良底部菌絲的顏色白(a)氣生菌絲的形成和顏色；不形成可溶性色素無2)葡萄糖-天冬醯胺瓊脂培養基生長良好底部菌絲的顏色肉粉紅色(4ca)-類桃色(dusty peach)(5ec)氣生菌絲的形成和顏色適中，白色(a)可溶性色素無3)甘油-天冬醯胺瓊脂培養基生長良好底部菌絲的顏色肉粉紅色(5ca)-淺玫瑰褐色(4ec)氣生菌絲的形成和顏色淺白色(a)可溶性色素無4)澱粉-無機鹽瓊脂培養基生長不良底部菌絲的顏色燕麥色(2ec)氣生菌絲的形成和顏色不形成可溶性色素無5)酪氨酸瓊脂培養基生長良好底部菌絲的顏色nude茶色(4gc)-木栓茶色(4ie)氣生菌絲的形成和顏色淺白色(a)可溶性色素；形成(微紅的棕色)6)瓊脂培養基生長良好底部菌絲的顏色淺芥茶色(2ie)氣生菌絲的形成和顏色不形成可溶性色素無7)瓊脂培養基生長良好底部菌絲的顏色樟色(31e)氣生菌絲的形成和顏色不形成可溶性色素少量形成(ocher)8)燕麥瓊脂培養基生長不良底部菌絲的顏色燕麥色(2ec)氣生菌絲的形成和顏色不形成可溶性色素無3.生理特徵NK-2067菌株的生理特徵如下所示。在28℃下培養14天之後測定生長溫度範圍，培養2至3周後獲得其它結果。1)生長溫度範圍6-36℃2)明膠液化陽性3)澱粉水解陰性4)脫脂奶粉的聚沉和腖化陰性5)類黑色素的色素的產生(i)腖-酵母-鐵瓊脂培養基陽性(ii)酪氨酸瓊脂培養基陽性6)碳源的可同化性作為基本培養基，使用了Pridham Gottlieb瓊脂培養基在下面，+表明菌株可使用該碳源，-表明菌株不使用該碳源。
L-阿拉伯糖-D-木糖-D-葡萄糖+蔗糖+棉子糖-D-果糖+鼠李糖-肌醇+D-甘露醇-7)降解能力作為基本培養基，使用了瓊脂培養基。在下面，+表明菌株降解該物質，-表明菌株不降解該物質。
酪氨酸-腺嘌呤-黃嘌呤+次黃嘌呤+尿素+8)酸的可產生性作為基本培養基，使用腖液體培養基(使用溴麝香草酚藍作為指示劑)。在下面，+表明菌株產生酸，-表明菌株不產生酸。
葡萄糖+
半乳糖-肌醇-甘露糖-鼠李糖-山梨醇-阿拉伯糖-福壽草醇-9)NaCl抗性作為基本培養基，使用了瓊脂培養基。在下面，+表明菌株生長，-表明菌株不生長。
0％NaCl+1％NaCl+2％NaCl+4％NaCl-6％NaCl-10％NaCl-4.化學分類學特徵1)菌株中的二氨基庚二酸的旋光異構體內消旋形式2)細胞脂類的主要的醌組分MK(甲基萘醌類)-8(II，III-H4，ω-環)3)細胞脂類中的黴菌酸包含4)整個細胞的主要糖組分阿拉伯糖和半乳糖通過形態特徵(這些特徵是可觀察到底部菌絲的裂殖，在氣生菌絲上形成孢子鏈)和化學分類學特徵(可在細胞壁中檢測到內消旋的二氨基庚二酸、阿拉伯糖和半乳糖，不能檢測到甘氨酸，主要的醌組分是四氫化甲萘醌-8，ω環[MK-8(II，III-H4，ω-環)]，而且在其中包含黴菌酸)確認所述菌株屬於放線菌中的諾卡氏菌屬。
該菌株命名為Nocardia sp.NK-2067，在1996年1月11日保藏在國際貿易和工業部，工業科學和技術局，國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305日本)，保藏號為FERM BP-5359。
為了使用上述的諾卡氏菌屬的微生物產生新海藻糖酶，使用類似於以前所述的方法的方法培養微生物並純化所形成的酶。
用於定量測定樣品中1，5-失水葡糖醇的方法(該方法包括使樣品與活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶共存，然後測定所說酶的活性)描述如下。
通過使用預先從在已知濃度的1，5～失水葡糖醇存在下測得的所說酶的活性和1，5-失水葡糖醇濃度所製備的校準曲線，可以從活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶的活性確定在樣品中1，5-失水葡糖醇的濃度。
另外，在無1，5-失水葡糖醇存在時(A)和有1，5-失水葡糖醇存在時(B)所說酶的活性之間的差別或按照下列等式計算的抑制率用於校準曲線，替代在1，5-失水葡糖醇存在時測定的所說酶的活性。
抑制率(％)＝[(A-B)/A×100]A在無1，5-失水葡糖醇存在時的酶活性B在1，5-失水葡糖醇存在時的酶活性可通過測定酶活性的通常方法測定活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶活性。酶反應在通過把酶、酶的底物和酶活性慢化劑(如果需要)添加到含水的培養基中製備的反應混合物中於10-50℃下進行1-60分鐘，優選地是1-20分鐘，更優選地是在25-40℃下進行5-15分鐘。通過測定在一定的條件下形成的產物或作為酶反應的結果留下的底物的濃度進行酶活性的測定；或通過轉化形成的產物或留在其它物質中的底物，然後測定其濃度進行酶活性的測定。
作為含水的培養基，可以使用含水液體如緩衝液和生理鹽水。優選地使用緩衝液。
緩衝液的例子是乳酸鹽緩衝液、檸檬酸緩衝液、醋酸鹽緩衝液、琥珀酸緩衝液、鄰苯二甲酸鹽緩衝液、磷酸緩衝液、三乙醇胺緩衝液、二乙醇胺緩衝液、賴氨酸緩衝液、巴比妥緩衝液、三(羥甲基)氨基甲烷緩衝液、咪唑緩衝液、蘋果酸緩衝液、草酸緩衝液、甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液以及Good s緩衝液。
酶活性慢化劑的例子是金屬螯合劑，如EDTA和1，10-菲繞啉、糖醇(如甘露醇和甘油)、金屬離子(如鋅和銅)以及甾類激素封閉劑(如碘乙酸和碘乙醯胺)。
測定1，5～失水葡糖醇的方法(其中海藻糖酶用作活性受1，5-失水葡糖醇抑制的酶)描述如下。
海藻糖酶催化由式(I)代表的反應，其中2分子D-葡萄糖從1分子海藻糖和1分子水形成。
海藻糖酶+H2O—————→2D-葡萄糖 (I)酶反應在通過把海藻糖、海藻糖酶和酶活性慢化劑(如果需要)添加到上述的含水的培養基中所製備的反應混合物中於10-50℃下進行1-20分鐘，優選地是在25-40℃下進行5-15分鐘。
可通過用於D-葡萄糖測定的化學或生物化學方法測定酶活性。所增加的D-葡萄糖的量可通過直接方法(通過化學方法測定還原力的增加等)或其中D-葡萄糖轉化為另一種測定物質的方法測定。尤其優選的是使用對D-葡萄糖具有高度特異性和可用於廣泛使用的自動生化分析儀的酶的方法。
這樣的方法的例子是1)其中D-葡萄糖由葡萄糖氧化酶氧化，反應形成的過氧化氫由比色測定的方法；2)其中D-葡萄糖由吡喃糖氧化酶氧化，反應形成的過氧化氫由比色測定的方法；3)一種這樣的方法，其中D-葡萄糖通過在輔酶煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(下文中作為NAD)或煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文作為NADP)存在下使用葡萄糖脫氫酶脫氫，反應形成的還原型的兩種輔酶(NADH或NADPH)的吸光度通過分光光度計測定；4)一種這樣的方法，其中D-葡萄糖通過在腺苷三磷酸存在下使用己糖激酶或葡糖激酶磷酸化，所形成的D-葡萄糖-6-磷酸通過在輔酶NADP存在下使用6-磷酸脫氫酶脫氫，反應形成的NADPH的吸光度以分光光度計測定。
如上所述，可通過把D-葡萄糖酶促轉化成易於測定的中間體，如過氧化氫和輔酶(例如，上述的NADH和NADPH)並測定中間體的量進行D-葡萄糖的測定。可通過方法如比色、X線測量法、化學發光分析和電極方法測定過氧化氫，可通過，例如，比色測定NADP和NADPH。
可通過在酶(如過氧物酶)的存在下過氧化氫與生色劑反應以顯色進行比色，其後用分光光度計測定。作為生色劑，可以使用Trinder s試劑和leuco試劑。
Trinder s試劑的例子是4-氨基安替比林和酚化合物(如酚)以及3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸的組合、4-氨基安替比林和苯胺化合物(如N-乙基-N-(2-羥基-3-硫代丙基)-間甲苯胺，N-乙基-N-(2-羥基-3-硫代丙基)-3，5-甲氧苯胺，N-(2-羥基-3-硫代丙基)-3，5-甲氧苯胺鈉，N-乙基-N-(3-甲苯基)-N-琥珀醯次乙基二胺(下文作為EMSE)的組合。
leuco試劑的例子是10-N-羰甲基氨基甲醯基-3，7-二(二甲胺)-10N-吩噻嗪，10-N-甲基氨基甲醯基-3，7-3，7-二(二甲胺)-10N-吩噻嗪，N-(羰甲基氨基氨基甲醯基)-4，4-(二甲氨基)二苯胺、4，4-二(二甲氨基)二苯胺以2及二[3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨苯基]胺。
可通過在酶(如過氧物酶)的存在下過氧化氫和螢光試劑反應以形成螢光物質，其後用螢光光度分析測定進行X線測量法。作為螢光試劑，可以使用p-羥苯乙酸、p-羥苯丙酸、香豆素等。
可通過在酶(如過氧物酶)的存在下過氧化氫和發光試劑反應以顯色，其後用發光計測定進行化學發光分析法。作為發光試劑，可以使用魯米諾、異構魯米諾、lucigenin、吖啶酸酯等。
可通過吸光度直接測定輔酶如NADH和HADPH。另外，它們可在轉化為其它物質之後測定。例如，可通過使NADPH和四唑鹽反應並通過使用分光光度計測定反應所形成的甲惚(formazan)色素的量測定NADPH。
按照上述方法1)測定酶活性的步驟如下所述。通過進行式(II)所示的反應以形成醌亞胺色素並用分光光度計測定色素的濃度測定海藻糖酶的酶活性。
(II)按照這種方法通過把海藻糖酶、葡糖氧化酶、過氧物酶、海藻糖、4-氨基安替比林、EMSE等添加到緩衝液(如磷酸緩衝液)中製備用於測定的反應混合物。磷酸緩衝液的pH值優選地是5.0-8.0，更優選地是6.0-7.0，其濃度優選地是10-500mM，更優選地是50-250mM。
添加至緩衝液中的物質的濃度如下海藻糖酶，優選地是0.001-10U/ml，更優選地是0.01-1U/ml；葡糖氧化酶，優選地是1-100U/ml，更優選地是10-50U/ml；過氧物酶，優選地是1-50U/ml，更優選地5-20U/ml；海藻糖，優選地是1-100mM，更優選地是10-50mM；4-氨基安替比林，優選地是0.5-50mM，更優選地是1-10mM；EMSE，優選地是0.5-50mM，更優選地是1-10mM。
向上述反應混合物中添加包含1，5-失水葡糖醇的樣品，反應在10-50℃下進行1-20分鐘，優選地是在25-40℃下進行5-15分鐘。可通過反應所形成的醌亞胺色素的濃度測定酶活性，而在550nm下測定吸光度來測定醌亞胺色素的濃度。
在D-葡萄糖存在於樣品中的情況下，優選地是以下列方式提前除去樣品中的D-葡萄糖。包含D-葡萄糖的樣品的例子是血液、血清和血漿。
可通過物理方法(其中吸附D-葡萄糖並使用層析柱等除去)和化學或生物化學方法(其中把D-葡萄糖轉化成另一種物質)進行樣品中D-葡萄糖的除去。使用酶的生物化學轉化方法優選地用於使用自動生物化學分析儀的測定中。
D-葡萄糖可通過上述的用於D-葡萄糖測定的轉化方法轉化成另一種物質。這樣的方法的例子是1)一種其中使用葡糖氧化酶把D-葡萄糖轉化成D-葡糖酸-δ-內酯的方法；2)一種其中使用吡喃糖氧化酶把D-葡萄糖轉化成2-脫氫-D-葡萄糖的方法；3)一種其中使用葡萄糖脫氫酶把D-葡萄糖轉化成D-葡糖酸-δ-內酯的方法；4)一種其中使用己糖激酶或葡糖激酶以及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶把D-葡萄糖轉化成D-葡糖酸-δ-內酯-6-磷酸的方法。
包含D-葡萄糖的樣品的測定可以按照下列方式進行。例如，通過上述1)或2)的方法把樣品中的D-葡萄糖轉化成另一種物質，通過在日本出版的未審查的專利申請83287/82中描述的方法除去所形成的過氧化氫，進行使用海藻糖酶作用的反應，測定通過反應形成的D-葡萄糖的量。另外，通過上述3)或4)的方法把樣品中的D-葡萄糖轉化成另一種物質，通過使用NADH氧化酶、NADPH氧化酶等把形成的NADH或NADPH轉化成另一種物質。在使用方法4的情況下，通過使用心肌黃酶、腺苷三磷酸酶等把留在反應混合物中的腺苷三磷酸轉化成另一種物質。然後，進行使用海藻糖酶作用的反應，通過，例如，上述1或2的方法測定由反應形成的D-葡萄糖的量。
測定作用於除去樣品中D-葡萄糖的1，5-失水葡糖醇的代表性的方法包括以下步驟通過使用葡糖氧化酶把D-葡萄糖轉化成D-葡糖酸-δ-內脂和過氧化氫；通過在過氧物酶的存在下和除過氧化氫化合物(如EMSE)反應除去形成的過氧化氫；按照上述式(II)所示的方法測定海藻糖酶活性。
在這個方法中，使通過把葡糖氧化酶、過氧物酶、EMSE等添加到緩衝液(如磷酸緩衝液)中製備的反應混合物和樣品在10-50℃下反應1-20分鐘，優選地是在25-40℃下反應5-15分鐘以除去樣品中的D-葡萄糖。向反應混合物中添加包含海藻糖、海藻糖酶、4-氨基安替比林等的試劑，通過上述方法測定海藻糖酶活性。試劑的組分濃度同上。
另一個代表性的方法包括以下步驟在腺苷三磷酸存在下使用葡糖激酶把D-葡萄糖轉化成D-葡萄糖-6-磷酸；使用6-磷酸脫氫酶把D-葡萄糖-6-磷酸鹽和NADP轉化成D-葡糖酸-δ-內酯-6-磷酸和NADPH；使用腺苷三磷酸酶分解腺苷三磷酸；按照上述式(II)所示的方法測定海藻糖酶活性。
在這個方法中，使通過把葡糖激酶、ATP、6-磷酸脫氫酶和NADH添加到緩衝液(如磷酸緩衝液)中製備的反應混合物和樣品在10-50℃下反應1-20分鐘，優選地是在25-40℃下反應5-15分鐘以除去樣品中的D-葡萄糖。在留在反應混合物中的腺苷三磷酸通過添加腺苷三磷酸酶分解後，向反應混合物中添加包含海藻糖、海藻糖酶、過氧物酶、4-氨基安替比林、EMSE等的試劑，通過上述的方法測定海藻糖酶活性。包含在反應混合物中的物質的濃度如下葡糖激酶，優選地是0.1-100U/ml，更優選地是1-10U/ml；6-磷酸鹽脫氫酶，優選地是0.1-100U/ml，更優選地是1-10U/ml；腺苷三磷酸酶，優選地是0.1-100U/ml，更優選地是1-10U/ml；NADP，優選地是1-100mM，更優選地是10-50mM；腺苷三磷酸，優選地是1-100mM，更優選地是10-50mM。其它化合物與酶以與上述濃度相同的濃度使用。
接著，關於海藻糖磷酸化酶描述如下。海藻糖磷酸化酶催化式(III)所示的可逆反應。
海藻糖+磷酸_D-葡萄糖+β-D-葡萄糖-1-磷酸 (III)可通過直接方法(其中通過已知方法測定D-葡萄糖、β-D-葡萄糖-1-磷酸、海藻糖或磷酸的濃度變化)或通過其中物質轉化成可測定的其它物質的方法測定海藻糖磷酸化酶的酶活性。例如，在式(III)的反應中向右的酶活性可通過進行式(IV)的反應並選擇性地測定反應形成的NADPH濃度測定。D-葡糖酸-δ-內酯-6-磷酸+NADPH(IV)通過把海藻糖脫氫酶、海藻糖、NADP等添加至緩衝液(如磷酸緩衝液)中製備用於測定這種酶活性的反應混合物。磷酸緩衝液的pH值優選地是5.0-8.0，更優選地是6.0-7.0，其濃度優選地是10-500mM，更優選地是50-250mM。
添加至緩衝液的物質的濃度如下海藻糖磷酸化酶，優選地是0.001-10U/ml，更優選地是0.01-1U/ml；磷酸葡糖變位酶，優選地是0.1-50U/ml，更優選地是1-10U/ml；6-磷酸鹽脫氫酶，優選地是0.1-50U/ml，更優選地是1-10U/ml；海藻糖，優選地是1-100mM，更優選地是10-50mM；NADP，優選地是1-50mM，更優選地是5-20mM。
向上述反應混合物中添加包含1，5-失水葡糖醇的樣品，反應在10-50℃下進行1-20分鐘，優選地是在25-40℃下進行5-15分鐘。可通過反應所形成的NADPH的濃度測定酶活性，而在340nm下測定吸光度來測定NADPH的濃度。
可通過，例如，進行式(V)的反應並選擇性地測定反應形成的醌亞胺色素濃度測定在式(III)的反應中向左的酶活性。
(V)通過把嘌呤-核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧物酶、葡萄糖、β-葡萄糖-1-磷酸、次黃苷、4-氨基安替比林、EMSE等添加至緩衝液(如咪唑緩衝液)中製備用於測定這種酶活性的反應混合物。咪唑緩衝液的pH值優選地是5.0-8.0，更優選地是6.0-7.0，其濃度優選地是10-200mM，更優選地是50-100mM。
添加至緩衝液中的物質的濃度如下嘌呤-核苷磷酸化酶，優選地是0.1-10U/ml，更優選地是1-5U/ml；黃嘌呤氧化酶，優選地是1-50U/ml，更優選地是5-20U/ml；過氧物酶，優選地是U/ml，更優選地是1-50U/ml；葡萄糖，優選地5-200mM，更優選地是20-100mM；葡萄糖-1-磷酸，優選地是5-200mM，更優選地是20-100mM；次黃苷，優選地是0.5-50mM，更優選地是1-10mM；4-氨基安替比林，優選地是0.5-50mM，更優選地是1-10mM；EMSE，優選地是0.5-50mM，更優選地是1-10mM。
向上述反應混合物中添加包含1，5-失水葡糖醇的樣品，反應在10-50℃下進行1-20分鐘，優選地是在25-40℃下進行5-15分鐘。可通過反應所形成的醌亞胺色素的濃度測定酶活性，而在550nm下測定吸光度來測定醌亞胺色素的濃度。
定量測定本發明的1，5-失水葡糖醇的試劑(包括活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶、所說酶的底物以及定量測定通過酶活性形成的物質的試劑)描述如下。
當海藻糖酶用作活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶時，底物是海藻糖，用於測定形成的物質的試劑是測定D-葡萄糖的試劑。
當海藻糖磷酸化酶用作活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶時，底物是海藻糖和磷酸，或D-葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸。在每個反應中形成的物質分別是D-葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸，或海藻糖和磷酸。也就是說，測定形成的物質的試劑是測定海藻糖、磷酸、D-葡萄糖或β-葡萄糖-1-磷酸的試劑。
用於海藻糖酶活性測定的試劑包括海藻糖和測定D-葡萄糖的試劑。它還可包含緩衝液、其它酶、其底物和輔酶(如果需要)。用於海藻糖磷酸化酶活性測定的試劑包括海藻糖、磷酸和測定D-葡萄糖的試劑或測定β-葡萄糖-1-磷酸的試劑；或D-葡萄糖，β-葡萄糖-1-磷酸和測定海藻糖的試劑或測定磷酸的試劑。它還可包含緩衝液、其它酶、其底物和輔酶(如果需要)。
分別測定D-葡萄糖、β-葡萄糖-1-磷酸、海藻糖和磷酸的試劑包括例如那些用於測定這些物質的上述方法的物質。
用於除去D-葡萄糖的試劑包括例如那些用於通過使用酶把D-葡萄糖轉化成為其它物質的上述方法的物質。
例如，按照上述方法1)除去D-葡萄糖的試劑可包括葡糖氧化酶、過氧物酶、EMSE，如果需要，還包括上述緩衝液、其它酶、其底物和輔酶。按照上述方法4)除去D-葡萄糖的試劑可包括葡糖激酶、6-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸酶、腺苷三磷酸、NADP，如果需要，還包括上述緩衝液、其它酶、其底物和輔酶。用於除去D-葡萄糖的試劑可與上述測定1，5-失水葡糖醇的試劑混合以形成試劑盒。
要使用的酶(如葡糖氧化酶、葡糖脫氫酶、吡喃糖氧化酶、葡糖激酶、己糖激酶、β-磷酸葡糖變位酶、嘌呤-核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧物酶和腺苷三磷酸酶)可作為商業產物獲得，或可以通過培養能產生這些酶的微生物製備。就緩衝液、底物、輔酶、酶的底物、生色劑、螢光劑和發光劑而言，都可以使用市售的試劑。
下列試驗實施例通過使用得自圓紅球菌ATCC 14898的海藻糖酶顯示了1，5-失水葡糖醇對酶活性抑制的例子。
試驗實施例1(由1，5-失水葡糖醇抑制的特異性)通過把在參考實施例3製備的10mU/ml海藻糖酶、0.81mg/ml4-氨基安替比林、1mg/ml EMSE、30U/ml葡糖氧化酶、10U/ml過氧物酶和表4中所示的1mM試驗糖添加到100mM磷酸緩衝液(pH7.0)中製備反應混合物。在向反應混合物中添加10mg/ml海藻糖並攪拌之後，用分光光度計測定在550nm時的吸光度變化。
在反應開始之後測定10分鐘的吸光度的增加，按照下列等式從無試驗糖(A)和1mM試驗糖存在下(B)的吸光度增量計算抑制率(％)[(A-B)/A×100]。結果如表4所示。
表4試驗糖(1mM) 抑制率(％)1，5-失水葡糖醇 45.0D-葡糖胺 0N-乙醯-D-葡糖胺 0D-甘露糖0.5D-半乳糖0.2D-果糖 0D-墨角藻糖0L-墨角藻糖0D-木糖 0麥芽糖 0蔗糖 0得自圓紅球菌ATCC 14898的海藻糖酶活性特異性地受1，5-失水葡糖醇抑制。
附圖簡述圖1顯示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的pH-活性曲線。
圖2顯示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的pH穩定性曲線。
圖3顯示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的熱穩定性曲線。
圖4顯示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的溫度-活性曲線。
圖5顯示了由使用作為指示(index)的得自鏽色鏈孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶的分解活性獲得的校準曲線。縱坐標的數表示酶活性抑制率(％)，橫坐標上是數表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖6顯示了由使用作為指示的得自鏽色鏈孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶的合成活性獲得的校準曲線。縱坐標的數表示酶活性抑制率(％)，橫坐標上是數表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖7顯示了由使用作為試驗酶的得自金黴素鏈黴菌ATCC 10762的海藻糖酶獲得的校準曲線。縱坐標的數表示酶活性抑制率(％)，橫坐標上是數表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖8顯示了由使用作為試驗酶的得自圓紅球菌ATCC 14898的海藻糖酶獲得的校準曲線。縱坐標的數表示酶活性抑制率(％)，橫坐標上是數表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖9顯示了由使用作為試驗酶的得自Nocardia sp.NK-2 067的海藻糖酶獲得的校準曲線。縱坐標的數表示酶活性抑制率(％)，橫坐標上是數表示1，5-失水葡糖醇濃度(mM)。
圖10顯示了由使用作為指示的抗得自Nocardia sp.NK-2067海藻糖酶的抑制率獲得的在葡萄糖存在下的1，5-失水葡糖醇的校準曲線。在縱坐標上的數表示在無1，5-失水葡糖醇和1，5-失水葡糖醇存在的情況下吸光度之間的差，在橫坐標上的數表示1，5-失水葡糖醇濃度(μg/ml)。
在下列的實施例中說明了本發明的某些實施方案。
實施本發明的最佳方式實施例1使用得自鏽色鏈孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶測定1，5-失水葡糖醇通過把10mU/ml在參考實施例1中製備的得自鏽色鏈孢菌的海藻糖磷酸化酶、2.5U/ml β-磷酸葡糖變位酶(Beekman儀器公司)、5U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Sigma化學公司)、10mM NADP以及包含不同濃度的1，5-失水葡糖醇樣品添加到100mM的磷酸緩衝液(pH7.0)中製備反應混合物，在把10mg/ml海藻糖添加至反應混合物中並攪拌之後，以分光光度計測定在340nm下的吸光度增量。
在反應開始之後測定10分鐘的吸光度增量，按照下列等式從在每種濃度的無1，5-失水葡糖醇(A)和1，5-失水葡糖醇存在下(B)的吸光度增量計算抑制率(％)[(A-B)/A×100]。如圖5所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關關係，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準曲線。
實施例2使用得自鏽色鏈孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶測定1，5-失水葡糖醇通過把10mU/ml在參考實施例1中製備的海藻糖磷酸化酶、50mM葡萄糖、2ml測定無機磷的試劑盒(Kyowa Medex有限公司)、包含不同濃度的1，5-失水葡糖醇1，5-失水葡糖醇樣品添加到50mM的咪唑緩衝液(pH7.0)中。在把50mM的β-葡萄糖-1-磷酸添加至反應混合物中並攪拌之後，以分光光度計測定在550nm下的吸光度增量。
在反應開始之後測定10分鐘的吸光度增量，按照與實施例1的方法相同的方法計算抑制率(％)。如圖6所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關關係，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準曲線。
實施例3使用得自金黴素鏈黴菌ATCC 10762的海藻糖酶測定1，5-失水葡糖醇通過把10mU/ml參考實施例2製備的海藻糖酶、0.81mg/ml 4-氨基安替比林、1mg/ml EMSE、30U/ml葡糖氧化酶、10U/ml過氧物酶以及包含不同濃度的1，5-失水葡糖醇樣品添加到100mM的磷酸緩衝液(pH7.0)中製備反應混合物，在把10mg/ml海藻糖添加至反應混合物中並攪拌之後，以分光光度計測定在550nm下的吸光度增量。
在反應開始之後測定10分鐘的吸光度增量，按照與實施例1的方法相同的方法計算抑制率(％)。如圖7所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關關係，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準曲線。
實施例4使用得自圓紅球菌ATCC 14898的海藻糖酶測定1，5-失水葡糖醇除了使用參考實施例3中製備的得自圓紅球菌的海藻糖酶之外，重複與實施例3相同的步驟。如圖8所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關關係，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準曲線。
實施例5使用Nocardia sp.NK-2067產生海藻糖酶把Nocardia sp.NK-2067接種進在1-1錐形培養瓶中的包含1g/dl蔗糖、0.5g/dl NZ-胺、0.2g/dl腖，0.1g/dl酵母抽提物以及0.1g/dl肉膏的125ml培養基(pH7.2)中並在30℃下振蕩培養48小時。把形成的培養物接種在5-1的發酵罐中的具有與上述相同組合物的2375ml培養基中並在通氣和攪拌的同時在30℃下培養2天。
離心(12,000×g，20分鐘)形成的培養物(2.51)以收集細胞。把細胞懸浮在包含10％甘油的500ml 50mM的磷酸緩衝液(pH7.0)(在下文作為GP緩衝液)中並使用Dynomill(W.A.Bachofen)破壞，然後再離心(12,000×g，20分鐘)。向獲得的上清液添加硫酸銨，收集通過70％飽和硫酸銨沉澱的組份並將其溶解在少量的GP緩衝液(大約100ml)中。形成的溶液對5lGP緩衝液透析24小時。將透析的溶液通過用GP緩衝液預平衡的DEAE-Cellulofine柱(Seikagaku Kogyo有限公司)中(1L，直徑5cm)，由此把海藻糖酶吸附在柱上。在用相同的緩衝液洗脫柱以除去沾染的蛋白質後，使用包含0-1M氯化鈉的GP緩衝液用氯化鈉的濃度梯度進行洗脫。合併用ca.0.4-0.6M氯化鈉洗脫的活性組份，向其中添加硫酸銨。通過離心(12,000×g，20分鐘)收集用70％硫酸銨飽和液沉澱的組份並溶解在50ml的GP緩衝液中。形成的溶液對21GP緩衝液透析24小時以獲得純化的海藻糖酶製劑。
酶製劑的比活是21mU/mg。
實施例6使用得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶測定1，5-失水葡糖醇除了使用實施例5製備的得自Nocardia sp.的海藻糖酶之外，重複與實施例3相同的步驟。如圖9所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的線形相關關係，由此獲得1，5-失水葡糖醇的校準曲線。
實施例7製備了由下列試劑1、2和3組成的測定1，5-失水葡糖醇的試劑盒。
試劑1葡糖氧化酶 30U/ml(得自黑麴黴，Toyobo有限公司)過氧物酶 10U/ml(得自辣根，Toyobo有限公司)EMSE 1mg/ml磷酸緩衝液(pH5.5) 100mM試劑2海藻糖酶(在實施例5中製備) 1U/ml4-氨基安替比林 0.8mg/ml磷酸緩衝液(pH5.5) 100mM試劑3海藻糖 2mM實施例8製備包含從0到500μg/ml濃度的1，5-失水葡糖醇和1mg/ml濃度的D-葡萄糖的樣品。向10ml的每個樣品添加300μl在實施例7中製備的試劑1，把混合物在30℃下溫育10分鐘以把D-葡萄糖轉化成D-葡糖酸-δ-內脂並同時除去形成的過氧化氫。然後，添加100μl在實施例7中製備的試劑2，然後添加10μl在實施例7中製備的試劑3。以自動分析儀(Hitachi 7070)測定吸光度增量。
從無1，5-失水葡糖醇時的吸光度減去在每種濃度的1，5-失水葡糖醇存在下的吸光度。如圖10所示，在獲得的絕對值(吸光度差)和1，5-失水葡糖醇濃度之間有很好的相關關係。這說明可以測定在包含葡萄糖的樣品中1，5-失水葡糖醇的濃度。
實施例9製備了由下列試劑4、5、6和7組成的測定1，5-失水葡糖醇的試劑盒。試劑4葡糖激酶 5U/ml
(得自嗜熱脂肪芽孢桿菌，Sigma化學公司)腺苷三磷酸 10mMMgCl220mM葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 10U/ml(得自麵包酵母，Sigma化學公司)NADP 10mM磷酸緩衝液(pH7.0)100mM試劑5腺苷三磷酸酶 3U/ml(得自豬腦，Sigma化學公司)試劑6海藻糖酶 1U/ml葡糖氧化酶 30U/ml過氧物酶 10U/ml4-氨基安替比林 0.8mg/mlEMSE 1mg/ml磷酸緩衝液(pH7.0)100mM試劑7海藻糖 2mM實施例10製備包含500μg/ml濃度的1，5-失水葡糖醇和從1到10mg/ml濃度的D-葡萄糖的樣品。向10ml的每個樣品添加300μl在實施例9中製備的試劑4，把混合物在30℃下溫育10分鐘。然後，添加100μl在實施例9中製備的試劑5，溫育混合物5分鐘以分解腺苷三磷酸。由此停止葡糖激酶反應。通過這些步驟經葡萄糖6-磷酸把葡萄糖轉化成D-葡糖酸-δ-內酯-6-磷酸。
向反應混合物添加100μl在實施例9中製備的試劑6。然後添加10μl在實施例9中製備的試劑7，反應在30℃下進行10分鐘，以自動分析儀(Hitachi 7070)測定吸光度增量。
以與實施例8中的方式相同的方式計算吸光度差，研究獲得的值和在樣品中1，5-失水葡糖醇的濃度之間的關係。如表5所示，無論樣品中葡萄糖濃度的大小，吸光度的差是常量。這說明，可以測定在葡萄糖存在下的1，5-失水葡糖醇濃度。
表5添加的葡萄糖的濃度(mg/ml)吸光度差(mAbs)0 551.0 552.5 565.0 557.5 5410.0 56實施例11使用正常的人血清和通過把從0至500μg/ml濃度的1，5-失水葡糖醇添加至正常血清中製備的添加1，5-失水葡糖醇的血清作為樣品。向20μl的每個樣品添加300μl在實施例9中製備的試劑4，把混合物在30℃下溫育10分鐘。然後，添加10μl在實施例9中製備的試劑5，然後溫育5分鐘。向形成的溶液添加100μl在實施例9中製備的試劑6。然後添加10μl在實施例9中製備的試劑7，反應在30℃下進行10分鐘，以自動分析儀(Hitachi7070)測定吸光度增量。對上述包含0-500mg/ml 1，5-失水葡糖醇的樣品進行如上所述的相同步驟以製備校準曲線。在血清樣品中1，5-失水葡糖醇濃度基於校準曲線計算。結果如表6所示。
表6添加的1，5-失水葡糖醇實測值(μg/ml) 回收率(％)(μg/ml)025-100 124 96200 224 96300 325 100400 426 104
500 526 104所測定的正常人血清中的1，5-失水葡糖醇濃度和文獻中的值十分一致。測得的添加1，5-失水葡糖醇的血清的值顯示出回收率和理論值很接近。這說明，在血清中的1，5-失水葡糖醇濃度可通過按照本發明的方法測定。
參考實施例1使用鏽色鏈孢菌FERM BP-4329產生海藻糖磷酸化酶把鏽色鏈孢菌接種於在2-1錐形培養瓶中的包含3g/dl蔗糖、0.5g/dlNZ-胺、0.2g/dl腖、0.1g/dl酵母抽提物以及0.1g/dl肉膏的300ml培養基(pH7.0)中並在30℃下振蕩培養48小時。把形成的培養物(600ml)接種於在30-1發酵罐中的具有與上述相同組合物的151培養基中並在通氣和攪拌的同時在30℃下培養3天。
離心(12,000×g，20分鐘)形成的培養物(151)以收集細胞。把細胞懸浮在1000ml 200mM的磷酸緩衝液(pH7.0)中並使用Dynomill(W.A.Bachofen)破壞，然後再離心(12,000×g，20分鐘)。向獲得的上清液添加硫酸銨至50％飽和度，收集形成的沉澱並將其溶解在少量的200mM的磷酸緩衝液(大約200ml)中。形成的溶液對5l相同的緩衝液透析24小時。透析的溶液在65℃下加熱15分鐘，然後離心(12,000×g，20分鐘)。將獲得的上清液通過用同樣緩衝液預平衡的凝膠過濾介質的柱(Toyopearl HW65F，Tosoh公司)中(1L，直徑5cm)。合併洗脫的活性組份，向其中添加50％飽和度的硫酸銨。通過離心(12,000r.p.m.，20分鐘)收集形成的沉澱並將其溶解在20ml 200mM的磷酸緩衝液(pH7.0)中。形成的溶液對21相同緩衝液透析24小時以獲得海藻糖磷酸化酶製劑。
酶製劑的比活是100mU/mg。
參考實施例2使用金黴素鏈黴菌ATCC 10762產生海藻糖酶把金黴素鏈黴菌ATCC 10762接種於在1-1錐形培養瓶中的包含1g/dl蔗糖、0.5g/dl NZ-胺、0.2g/dl腖、0.1g/dl酵母抽提物以及0.1g/dl肉膏的125ml培養基(pH7.0)中並在30℃下振蕩培養48小時。把形成的培養物(600ml)接種於在5-1發酵罐中的具有與上述相同組合物的2375ml培養基中並在通氣和攪拌的同時在30℃下培養2天。
離心(12,000×g，20分鐘)形成的培養物(151)以收集細胞。把細胞懸浮在包含10％甘油的500ml 50mM的磷酸緩衝液(pH7.0)(在下文作為GP緩衝液)中並使用Dynomill(W.A.Bachofen)破壞，然後再離心(12,000×g，20分鐘)。向獲得的上清液添加硫酸銨，收集通過70％飽和硫酸銨沉澱的組份並將其溶解在少量的GP緩衝液(大約100ml)中。形成的溶液對51 GP緩衝液透析24小時。將透析的溶液通過用GP緩衝液預平衡的DEAE-Cellulofine柱(Seikagaku Kogyo有限公司)中(1L，直徑5cm)，由此把海藻糖酶吸附在柱上。在用相同的緩衝液洗脫柱以除去沾染的蛋白質後，使用包含0-1M氯化鈉的GP緩衝液用氯化鈉的濃度梯度進行洗脫。合併用ca.0.4-0.6M氯化鈉洗脫的活性組份，向其中添加硫酸銨。通過離心(12,000×g，20分鐘)收集用70％硫酸銨飽和液沉澱的組份並溶解在50ml的GP緩衝液中。形成的溶液對21 GP緩衝液透析24小時以獲得純化的海藻糖酶製劑。
酶製劑的比活是21mU/mg。
參考實施例3使用圓紅球菌ATCC 14898產生海藻糖酶除了使用圓紅球菌ATCC 14898之外，重複在參考實施例2中相同的步驟，由此獲得純化的海藻糖酶製劑。
酶製劑的比活是15mU/mg。
工業應用本發明提供了酶促測定1，5-失水葡糖醇的方法、該方法所用的試劑、適用於酶促測定1，5-失水葡糖醇之方法的新海藻糖酶以及產生新海藻糖酶的方法。測定1，5-失水葡糖醇濃度在糖尿病診斷中是有用的。按照本發明，可快速而精確地測定1，5-失水葡糖醇。
權利要求
1.一種用於定量測定樣品中1，5-失水葡糖醇(anhydroglucitol)的方法，該方法包括使樣品與活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶共存，然後測定所說酶的活性。
2.按照權利要求1的方法，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖酶。
3.按照權利要求1的方法，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖磷酸化酶。
4.對1，5-失水葡糖醇具有0.33mM或更小的Ki值並具有下列理化性質的海藻糖酶(1)作用它催化如通式(I)所示的反應，其中在水的存在下1分子的海藻糖被水解成2分子的D-葡萄糖海藻糖+水—————→2D-葡萄糖 (I)(2)底物特異性它特異性地作用於海藻糖，(3)底物親和性對海藻糖的Km值是6.7mM，(4)最適pH和穩定pH4值酶的最適pH是5-6，在50℃處理30分鐘時，酶在5-10的pH範圍中是穩定的，(5)最適溫度和耐熱性最適溫度在45℃左右，在pH5.0下處理30分鐘時，酶在達到50℃時是穩定的，(6)抑制劑可被金屬螯合劑如，1，10-菲繞啉、乙二胺四乙酸和2，2-二吡啶；SH封閉劑如p-汞苯甲酸和碘乙醯胺、羥胺、硫酸鎳等抑制，(7)分子量通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的酶的亞單位的分子量是大約90,000，通過凝膠過濾方法測得的酶的分子量是大約400,000。
5.一種產生按照權利要求4的海藻糖酶的方法，該方法包括在培養基中培養屬於諾卡氏菌屬並具有產生所說海藻糖酶能力的微生物，並從培養物回收所說海藻糖酶。
6.一種定量測定1，5-失水葡糖醇的試劑，該試劑包括其活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶、所說酶的底物以及定量測定由所說酶活性形成的物質的試劑。
7.按照權利要求1的方法，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是按照權利要求4的酶。
8.按照權利要求6的試劑，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖酶。
9.按照權利要求6的試劑，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖磷酸化酶。
10.按照權利要求6的試劑，其中所說的活性以濃度-依賴性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是按照權利要求4的酶。
11.按照權利要求2或7的方法，其中所說的樣品是包含D-葡萄糖和1，5-失水葡糖醇的樣品，該樣品已進行過除去D-葡萄糖的預處理。
12.按照權利要求8或10的試劑，該試劑還包含除去D-葡萄糖的試劑。
全文摘要
本發明涉及用於定量測定樣品中1,5－失水葡糖醇(anhydroglucitol)的方法,該方法包括使樣品與活性以濃度—依賴性方式受1,5－失水葡糖醇抑制的酶共存,然後測定該酶的活性;本發明也涉及定量測定1,5－失水葡糖醇的試劑,該試劑包括活性以濃度－依賴性方式受1,5－失水葡糖醇抑制的酶、所說酶的底物以及定量測定由所說酶活性形成的物質的試劑。本發明還涉及對1,5－失水葡糖醇具有0.33mM或更小的Ki值的新海藻糖酶以及產生具有上述理化性質的新海藻糖酶的方法,該方法包括在培養基中培養屬於諾卡氏菌屬並具有產生所說海藻糖酶能力的微生物,並從培養物回收所說海藻糖酶。
文檔編號C12Q1/34GK1180378SQ97190096
公開日1998年4月29日 申請日期1997年2月19日 優先權日1997年2月19日
發明者相阪和夫, 田添榮, 安藤勝彥, 落合惠子 申請人:協和發酵工業株式會社