抗cd3免疫毒素及其治療用途的製作方法

2023-05-03 19:22:51 3

專利名稱：抗cd3免疫毒素及其治療用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含CD3結合域和假單胞菌外毒素A突變體的重組免疫毒素。
每個成熟T細胞表面是由α和β(或者γ和δ)多肽鏈的異二聚體組成的T細胞受體(TCR)分子。每個細胞上有約30000個TCRαβ異二聚體，它們與抗原呈遞細胞表上(APC)的主要組織相容性複合體(MHC)銜接，導致所有功能性T細胞種類對抗原的識別。TCRαβ異二聚體本身並不涉及TCR與特定MHC-肽抗原複合體銜接後的信號傳導。實際情況是，此功能是由與所有外周T細胞和成熟胸腺細胞表面的TCRαβ或TCRγδ異二聚體穩定結合的蛋白複合體即CD3複合體完成的。人CD3複合體通常包含四種不同的鏈γ、δ、ε和ζ，共六種多肽。三種不同的二聚體組成CD3複合體(γε、ζε和ζζ)，[Kishimoto等(Eds.)，《白細胞分類VI》(Leukocyte Typing VI)，Garland出版公司，(1998)44]。CD3蛋白對細胞表面T細胞受體鏈的表達是絕對必要的。缺失任何TCR鏈或者CD3複合體的γ、ε或δ鏈的突變體都不能在細胞表面表達任何TCR複合體[Janeway和Travers，《免疫學》(Immunobiology)。健康和疾病狀態下的免疫系統，第4章(「T淋巴細胞的抗原識別」)，當代生物學有限公司London and Garland出版有限公司，紐約(1996)]。
當APC向靜息的T淋巴細胞傳遞兩種信號時，發生抗原特異性T細胞活化和克隆擴增。第一個信號給免疫反應賦予特異性，在識別在MHC環境中呈遞的抗原肽後通過TCR介導。通過TCR的最適宜的信號傳導需要TCR與輔助受體CD4或CD8的聚集。繼而引起胞液中的酪氨酸激酶與TCR和CD3的胞漿尾端以及CD45的結合增加。CD3ε和ζ的胞漿區的磷酸化導致其與酪氨酸激酶的結合，引發一系列細胞內的反應，導致T細胞的增殖和分化。第二信號被稱為「共刺激」信號，它既不是抗原特異性的也不是MHC限制性的，它由APG表達的一個或多個不同的表面分子提供的[Janeway和Travers，同上第4-28頁]。T細胞接受抗原特異性信號和共刺激信號後活化，這可包括T細胞增殖和細胞因子分泌。抗原和共刺激信號的結合誘導原初T細胞表達IL-2和IL-2受體。IL-2誘導原初T細胞的克隆增殖，並使它的子代細胞分化成效應T細胞，效應T細胞能夠合成行使輔助、炎症和細胞毒性T細胞等的特化功能所需要的所有蛋白，參見，例如Janeway和Travers，同上§§7-8，7-9。
上述的獲得性免疫機制是器官移植成功的主要障礙。當把包含有核細胞的組織從供體向移植物接受者移植時，接受者體內T細胞對移植物中典型的高多態性MHC分子的反應幾乎總是引發T細胞介導的即刻抗移植器官的反應。有效的免疫抑制劑如環胞素A和FK-506的抑制T細胞活化的應用已使移植物的存活率明顯增加，但這同時伴有某些缺點，包括移植物接受者終生對藥物的依賴。
尋找針對接受器官移植或患T細胞介導的免疫性疾病的患者的更好的免疫抑制方法已經成為移植領域長期的目標。此領域工作者的具體目標是開發能在患者體內誘導供體特異的免疫耐受的治療劑，使患者擺脫對免疫抑制劑的持續依賴。
術語「免疫耐受」是指受到誘發耐受的抗原攻擊的患者的免疫系統的無應答狀態。具體地，在移植情況下它指移植物接受者發動免疫反應的能力受到抑制，否則，移植物中非自身MHC抗原輸注到接受者體內可引起免疫反應。免疫耐受的誘發涉及體液機制、細胞機制或兩者兼有。
在用供體細胞進行骨髓移植以前，全身或整個淋巴系統用射線照射，通過嵌合方式動物模型和人體可獲得系統的供體特異性的免疫耐受[Nikolic和Sykes，《免疫學研究》(Immunol.Res.)16217-228(1997)]。然而，迫切需要在不使用射線照射時也可產生多細胞系混合的同種異體穩定嵌合體和長時間供體特異耐受的同種異體骨髓移植的調節方法。血液異常包括地中海貧血和鐮刀狀細胞病、自身免疫疾病和幾種類型的酶缺乏疾病已經不使用骨髓移植策略，因為建立完全同種異體骨髓重建體的調節方法可導致與此相關的某些疾病的發生。不涉及射線照射的調節方法可以很明顯地擴大骨髓移植對非惡性疾病的應用範圍。
包含與毒素連接的抗體的免疫毒素已被推薦用於器官移植排斥的預防和治療和免疫耐受的誘導。例如，一種直接針對恆河猴CD3ε的化學結合的白喉免疫毒素，即FN18-DT390，已經用於靈長類同種異體移植耐受模型和靈長類胰島異種移植模型[Knechtle等，《移植》(Transplantation)631(1997)；Neyille等，《免疫治療雜誌》(J.Immunother.)1985(1996)；Thomas等，《移植》64124(1997)；Contreras等，《移植》651159-1169(1998)]。另外，化學偶聯的假單胞菌免疫毒素，LMB-1B3(Lys)-PE38，已經用於臨床實驗治療嚴重的實體腫瘤[Pai和Pastan，Curr.Top.Microbiol.Immunol.23483-96(1998)]。然而，產物異質性是化學結合的免疫毒素所面臨的明顯的實際困難。
包含抗CD3抗體UCHT-1的可變區和白喉毒素的單鏈重組免疫毒素，已經推薦作為治療劑(WO96/32137，WO98/39363)。然而，對普通人群進行的早期抗白喉接種引起人們對業已存在的抗體對許多患者體內毒素的作用的關心。另外，包含與PE38連接的抗Tac的重組免疫毒素也被推薦作為抗器官移植和自身免疫病的預防和治療劑[Mavroudis等，《骨髓移植》(Bone Marrow Transplant.)17793(1996)]。
人們的目標是獲得對T細胞有高水平的定向毒性作用的重組免疫毒素，從而對移植排斥的預防和治療、免疫耐受的誘導、以及移植物抗宿主疾病(GVHD)、自身免疫病和其它T細胞介導的疾病的預防和治療提供改進。
提供一種免疫毒素，在正常情況下，接受者不存在針對它的抗體，這也是人們的目標。
目前，我們已發現CD3結合域和假單胞菌外毒素A突變體的重組融合提供了一種具有有效抗T細胞作用的免疫毒素。本發明的免疫毒素能改善對下列疾病的臨床治療和預防，這些疾病是移植物排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、T細胞介導的自身免疫病、T細胞白血病、或攜帶CD3表位的淋巴瘤、獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)和其它T細胞介導的疾病或病症。
本發明指向包含CD3結合域和假單胞菌外毒素A成分的分離的重組免疫毒素和它們可藥用鹽；用免疫毒素或它們可藥用鹽治療和預防器官移植排斥和移植物抗宿主疾病、和誘導免疫耐受、以及治療或預防自身免疫疾病、AIDS和其它T細胞介導的免疫疾病、和T細胞白血病或淋巴瘤的體內和離體方法；和包含該新的免疫毒素或它們的可藥用鹽的藥物組合物。
本發明也涉及作為主題重組免疫毒素製備過程中的中間物質的多核苷酸和生理功能相同的多肽；包含所述多核苷酸的重組表達載體、原核和真核表達系統和用所述表達系統合成免疫毒素的方法；和純化本發明的免疫毒素的方法。
具體地，本發明涉及新的重組免疫毒素scFv(UCHT-1)-PE38，它是小鼠抗人CD3單克隆抗體，UCHT-1，的單鏈(「sc」)Fv片段與綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A的截短的片段，即PE38，融合形成的。例如，我們已發現上述scFv(UCHT-1)-PE38在體外對T細胞的殺傷是高效的；並且，我們也進一步發現該免疫毒素在人CD3ε轉基因小鼠體內能以劑量依賴方式高水平消除小鼠CD3/人CD3雙陽性T細胞。
1.CD3結合域術語「CD3結合域」是指能與哺乳動物，更優選靈長類，甚至更優選人的T細胞或淋巴細胞上的CD3抗原結合或以其它關式關聯的胺基酸序列。
本發明免疫毒素的CD3結合域優選抗CD3多克隆或單克隆抗體，更優選單克隆抗CD3抗體。甚至更優選抗CD3抗體是能與人CD3ε鏈上的表位或由人CD3ε鏈和γ鏈形成的表位結合的單克隆抗體。
此處所用術語「抗體」包括完整的免疫球蛋白和各種形式已修飾過或改變了的抗體，包括抗體的片段，如Fv片段，由二硫鍵連接的Fv片段，或Fab或(Fab)』2片段，單鏈抗體，和保持親代抗體的抗原結合功能和特異性的其它片段。抗體可以是動物(尤其是小鼠或大鼠)或人來源的，或是嵌合的或人源化的。能與CD3抗原，尤其是人CD3抗原特異結合的抗體可以用雜交瘤製備，雜交瘤可以用人們熟知的來源於Kohler和Milstein[《自然》(Nature)256495-97(1975)]工作的方法製成。本領域熟知抗體的「重」或「輕」鏈有N末端可變區(V)和C末端恆定區(C)。可變區是抗體分子中結合與抗體有關聯的抗原的部分，而恆定區決定抗體的效應功能。免疫球蛋白全長或抗體的重鏈包含大約116個胺基酸的可變區和大約350個胺基酸的恆定區。免疫球蛋白全長或抗體的輕鏈包含一個大約110個胺基酸的N末端可變區，和大約110個胺基酸的COOH末端恆定區。重鏈可變區被稱作VH而輕鏈可變區被稱作VL。典型的VL包括VL和J1(即結合區)基因片段編碼的輕鏈部分[Sakans等，《自然》280288-294(1979)]，VH包括由VH、DH(即多變區)和JH基因片段編碼的重鏈部分[Early等，《細胞》(Cell)19981-92(1980)]。VH和VL片段一起被稱為Fv。完整抗體的Fv區是VH和VL域的異二聚體(即在不同鏈上包含VH和VL域)。
上述「(Fab)2」術語是指抗體的二價片段，包括鉸鏈區和重鏈、輕鏈的可變區和第一個恆定區，它可通過胃蛋白酶消化天然的抗體分子產生，或通過重組方式產生。術語「Fab」是指抗體的單價片段，包括重鏈和輕鏈的可變區和第一個恆定區，可通過(Fab』)2片段的二硫鍵橋還原產生，或通過重組方式產生。
本領域熟知，免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區包含三個高變區，也稱為互補決定區(CDR’s)，其側翼有四個相對保守的「構架區」(FR’s)。輕鏈和重鏈構成的組合構架區起到定位和對齊CDR’s的作用。CDR’s主要負責結合抗原表位，並且典型地稱為CDR1、CDR2和CDR3，從可變區鏈的N末端開始順序編號。構架區同樣編號。許多構架區和CDR’s已有描述[Kabat和Wu，有免疫學興趣的蛋白質序列，美國Government PrintingOffice，NIH出版號91-3242(1991)]。CDR和FR多肽片段是基於對已存在的抗體或編碼這些抗體的DNA的Fv區的序列分析憑經驗確定的。通過對感興趣的抗體序列和在Kabath和Wu和它處公布的抗體序列進行比對，可以確定抗體或其它感興趣的CD3結合域的構架區和CDRs。
「嵌合的」一般指基因工程抗體，其包含來自一個以上的天然抗體的序列。在嵌合抗體的一個實例中，構架和CDRs是不同來源的，比如，非人的可變區連接到人的恆定區上。作為它們的亞類，「人源化」抗體應通常被理解為包含這樣一種抗體，其中，把非人CDRs整合到至少一部分是人源的構架區中。
本文所用「單鏈抗體」術語(或術語「單鏈免疫毒素」)是指CD3結合域在單個多肽鏈上的一種分子。單鏈抗體的典型的製備方法是確定和分離結合的抗體的每個重鏈和輕鏈的結合域，然後，提供允許保持結合功能的連接部分。這樣，大體本質上形成了在一條多肽鏈上僅存在結合抗原所必需的那部分可變區的大大簡短的抗體。製備單鏈抗體的方法在美國4,946,778，中有描述，其併入此文作為參考。
根據本發明的單鏈免疫毒素包含這樣一種單鏈抗體片段。毒素成分優選與CD3結合域融合，任選通過一個連接肽進行，但它也可以作為單獨的多肽鏈存在，通過一個或多個二硫鍵與包含CD3結合域的鏈連接。
本發明的免疫毒素可以是「單價的」，它是指免疫毒素的多肽鏈上包含一個CD3結合域(例如，一種抗體的VH和VL結合在一起的可變區)。
本發明的免疫毒素也可以是「二價的」，它是指免疫毒素包含二個CD3結合域。這兩個抗原結合區可位於單獨的一條鏈上，或位於二條或多條由二硫鍵連接或由於吸引力(例如氫鍵)而緊密關聯的鏈上。當兩個CD3結合域位於一條多肽鏈上時，它們可以以串聯形式存在(即在鏈中前後連續存在，通過肽鍵或接頭連接在一起)，或者被插入的PE突變體或其它的功能區分開。
依賴不同的表達系統，通過和其它的單鏈(或雙鏈)分子形成鏈間二硫鍵，或通過域與它們的配偶體之間的固有親和力，單鏈抗體(或單鏈免疫毒素)可以在表達後多聚化。這些鏈可形成同型二聚體或異型二聚體。
本發明免疫毒素的CD3結合部分優選「重組」抗體。同樣，本發明的免疫毒素是「重組的」免疫毒素。術語「重組的」理解為抗體(或免疫毒素)是由基因工程產生的核酸(例如DNA)片段在細胞中合成的。術語「分離的」是指多肽已離開它的天然環境。在本發明中，在重組宿主細胞中產生和/或包含的多肽被認為是分離的。也存在「分離的多肽」的稱謂，它是指已經部分或基本上從重組宿主細胞中純化的多肽本發明免疫毒素的CD3結合部分優選為單鏈(「sc」)抗體。本發明免疫毒素優選單價的。
最優選的情況是本發明的CD3結合部分包含抗體的單鏈Fv區(或它們的CD3結合片段)，即，其中VH區(或它們的CD3結合部分)與VL區(或它們的CD3結合部分)融合，任選通過連接肽融合。
VL區優選通過它的羧基端與VH區的氨基端連接；或者，VH區通過它的羧基端與VL區的氨基端連接。
優選連接VL和VH區的任何連接肽允許CD3結合域獨立的摺疊和保持活性；沒有產生可能干擾CD3結合域或在患者體內引起免疫反應的有序二級結構的傾向，並且存在可能與CD3結合域相互作用的最小的疏水性或電荷特徵。
連接肽優選含有1-500個胺基酸；更優選含有1-250個胺基酸；甚至更優化僅含有1-100個(例如，約1-25或10-20個)胺基酸。
對於上述每種優選情況，優選的連接肽是線性的。
通常，包含甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的連接肽可以期望滿足此類肽的標準。例如，在scFv(UCHT-1)-PE38中，連接VL域的羧基末端和VH域氨基末端的連接肽，是[GGGS]4(SEQ ID NO5)。
其全部或片段適合用作本發明CD3結合域的特異抗-CD3抗體的實例是(1)UCHT-1[Beverley和Callard，《歐洲免疫學雜誌》(Eur.J.Immunol.)11329(1981)；Burns等，《免疫學雜誌》(J.Immunol.)1291451(1982)]，它的scFv序列包括在SEQ ID NO2中。UCHT-1是有IgGl，κ同種型的小鼠抗人單克隆抗CD3抗體。此抗體與胸腺、骨髓、外周淋巴組織和血液中的T細胞反應。完整的抗體可從Biomeda(分類號為K009，V1035)或Coulter公司購得。可變區包含本發明SEQ ID NO2的第3-112(輕鏈)和128-249(重鏈)位殘基。UCHT-1作為Fv片段是非活化的，並且已經用作融合成分與抗HER2雙特異性免疫結合物融合，使T細胞靶向人乳腺和卵巢腫瘤細胞[Shalaby等，《實驗醫學雜誌》(J.Exp.Med.)175217(1992)]。
(2)SP34(由Beth Israel Deaconess醫院的C.Terhorst第一次分離)，可以與靈長類和人的CD3反應。SP34與UCHT-1和BC-3不同在於，SP34識別僅存在於CD3ε鏈上的表位(參見Salmeron等，《免疫學雜誌》(1991)1473047)，而UCHT-1和BC-3識別由ε和γ鏈共同形成的表位。該完整的抗體可以從Pharmingen購得。
(3)BC-3(Fred Hutchinson癌症研究所)(用於GvHD的I/II期實驗)[Anasetti等，《移植》54844(1992)]。
對CD3抗原有特異的親和力並且至少有一些來源於人的序列的其它單克隆抗體被認為是在上述抗體的類似物範圍內。這些抗體包括(1)有與例如UCHT-1(或SP34或BC3)一致的CDRs，並且含有至少一個來源於人的至少5個胺基酸的序列片段的單克隆抗體；和(2)單克隆抗體，其與例如UCHT-1競爭結合至少約80％的人CD3抗原，更優化的情況是至少約90％的人CD3抗原，在摩爾水平上與UCHT-1同樣有效，並且，至少含有5個人源胺基酸的至少一個序列片段。「特異的結合親和力」是指通過結合分子表面非共價相互作用如疏水鍵、鹽鍵和氫鍵確定的結合力。除非另有說明，對雙分子反應，「特異的結合力」指至少約106升/摩爾的結合常數。
有與例如UCHT-1基本同源的CDRs的本發明抗體也在本發明的範圍之內，並且能通過體外突變產生。能插入恆定區或可變區中並能基本保持此同系物的親和力和特異性的突變是那些導致保守胺基酸替代的那些突變例如本領域人員熟知的。對於UCHT-1，這些突變形式的抗體優選含有與UCHT-1的可變區至少80％相同、更優選至少90％相同的可變區。甚至更優選這類突變形式的抗體的每一個CDRs與UCHT-1的相應CDR至少80％、更優選至少90％或至少95％相同。
在實踐方面，任何特定的多肽序列與另一個至少80％、90％或95％多肽「相同」可用已知的電腦程式如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，Wis.53711)常規確定。根據本發明，當用Bestfit或任何其它對照程序確定一特定序列是否與參考序列例如95％相同時，當然，參數的設置使得序列的相同百分比是對參考胺基酸序列的全長計算的，並且允許同源性斷缺區達參考序列中胺基酸殘基總數的5％。
在優選實施方案中本發明的CD3結合部分識別由ε和γ鏈共同形成的人CD3表位，且該結合部分優選為UCHT-1，更優選為UCHT-1的Fv區(或它們的CD3結合片段)。CD3結合部分甚至更優選為UCHT-1的一個單鏈片段，最優選為UCHT-1的單鏈Fv區(或它們的CD3結合片段)。
已發現UCHT-1的Fv區當作為單鏈重構並與缺失了細胞結合區的綠膿假單胞菌外毒素A片段融合時，其在標準體外檢測和體內人CD3ε雜合轉基因小鼠中表現高效的T細胞殺傷作用。
2.假單胞菌毒素成分假單胞菌毒素A(下文稱PE)是一種極具活性的單體蛋白，含613個胺基酸(分子量為66Kd)，由綠膿假單胞菌分泌，該蛋白通過催化延伸因子2的ADP核糖基化(即催化氧化NAD上的ADP核糖基部分轉移到EF-2分子上)，使延伸因子2(EF-2)，一種必需的真核翻譯因子失活，從而抑制真核細胞中的蛋白合成[Kreitan和Pastan《血液》(Blood)83426(1994)]。成熟多肽的胺基酸序列呈現在本發明的SEQ ID NO3中，通常，在它之前有25個胺基酸殘基的信號序列，這個信號肽呈現在SEQ ID NO4中。
在天然PE中有三個結構明顯不同的域，它們協調作用，促進細胞毒性(US4892827，US5696237和US5863745，全部納入本發明作為參考)。域Ia，在氨基端(通常指定在SEQ ID NO3的第1-約252個殘基)，介導細胞的靶向和結合作用。域II(在SEQ ID NO3的第253-364個殘基之間)，負責轉運穿越細胞膜進入細胞質中；域III(在SEQ ID NO3的第405-613個殘基之間)介導延伸因子2的ADP核糖基化，導致該蛋白失活和細胞死亡。域III包含羧基末端序列(REDLK)(SEQ ID NO6)，它指導內吞和加工後的毒素進入胞漿內質網。當域Ib(在SEQ ID NO3的第365-404個殘基之間)與域III協同作用時，此域第365-380殘基的刪減不會引起活性的喪失。
本發明免疫毒素的「PE突變體」或「PE成分」是天然PE的突變體形式，其具有轉運和催化(即ADP-核糖基化)功能，但細胞結合能力已基本消除或缺失。已發現細胞結合域Ia全部或基本上全部的破壞或缺失可相當大程度地降低天然PE的細胞結合能力和非特異的毒性。例如，域Ia的缺失產生40kDa的蛋白，PE40，儘管它仍分別保持了域II和的域III的轉運和ADP核糖基化功能(Kondo等，《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)，2639470-9475(1988))，但它自身已沒有了細胞毒性。
PE38是PE的一個38kDa的片段，基本上不含成熟PE蛋白的域Ia(例如，缺乏SEQ ID NO3的第1-250位胺基酸)，也不含SEQ ID NO3的第365-380位之間的胺基酸殘基，所以具有包含SEQ ID NO3第的251-364和381-613位的胺基酸序列(參見SEQ ID NO2的255-601殘基)。參見例如，US5,608,039，col.10，II.1-20(其中的PE是指截短的毒素，其由天然PE的253-364位和381-613位胺基酸殘基組成)。其優點是PE38不存在天然蛋白第372和379位的半胱氨酸殘基，否則它們在復性過程中可能和其它半胱氨酸形成二硫鍵，導致無活性嵌合毒素的形成。
本發明多肽的PE毒素成分包含與SEQ ID NO2第255-601殘基所確定的序列至少90％，更優選至少95％，甚至更優選至少99％相同的蛋白。術語「相同」具有前面指定的含義。
除了毒素羧基末端從原來序列REDLK(SEQ ID NO6)變為KDEL(SEQID NO8)外，PE38KDEL具有上述PE38的胺基酸序列。
為增加融合蛋白針對靶細胞的細胞毒性，或減少針對無相應CD3抗原的細胞的非特異性細胞毒作用，可以對PE進行其它的刪減或改變，或附加一個接頭，如IgG恆定區，給PE連接一個抗體。與使用天然PE分子或在域II進行無顯著缺失的PE分子相比，刪減PE域II氨基末端的一部分可增加細胞毒活性。其它的修飾包括重組PE分子適當羧基末端序列以輔助此分子轉運至靶細胞胞質中。已發現有效的胺基酸序列包括REDLK(SEQ ID NO6)(在天然PE中存在)、REDL(SEQ ID NO7)或KDEL(SEQ ID NO8)(在上面討論的PE38KDEL中存在)，或這些序列的重複，或其它能使蛋白保持進入內質網中或循環使其進入內質網的序列，參見US5,489,525，其納入作參考。其它突變體可以包含單個胺基酸的替代(例如，在第590和606位用穀氨醯胺替代賴氨酸)。
將識別部分插入PE的域III的其它PE突變體在US5,458,878中有描述，該文獻納入作參考。
3.免疫毒素的構建此發明包括CD3結合域與一個或多個假單胞菌突變體的融合；也包括包含兩個或多個CD3結合域和至少一個PE突變體的免疫毒素的融合物。
此處所用術語「融合的」或「融合物」指這樣一些多肽，其中(i)「第一多肽域」在它的羧基末端通過化學鍵(即肽鍵)與「第二多肽域」的氨基末端結合，任選通過肽連接物結合，或相反，其中(ii)(i)中的「第二多肽域」在它的羧基末端通過化學鍵(即肽鍵)與(i)的「第一多肽域」的氨基末端結合，任選通過肽連接物結合。
同樣地，當「融合的」的使用同本發明的多核苷酸中間物相聯繫時是指編碼第一功能域的核苷酸序列的3』-[或，相反5』-]末端與編碼第二功能域的核苷酸序列的相應的5』-[或，相反3』-]末端或者直接通過化學鍵(即共價鍵)或間接通過核苷酸序列連接物結合，這個核苷酸序列連接物本身在其末端通過化學鍵(即共價鍵)與第一功能域的編碼核苷酸序列和第二功能域的編碼核苷酸序列連接。
參與融合的其它肽序列可以從全長或截短的人蛋白(如其可溶性胞外片段)中選擇。這些肽序列的實例包括人免疫球蛋白蛋白域、來自人血清其它蛋白的域、或能被多聚化的其它域[Kostelny等，《免疫學雜誌》1481547-1553(1992)；WO 93/11162；Pack和Pluckthun，《生物化學》(Biochemistry)311579-1584(1992)；Hu等，《癌症研究》(Can.Res.)563055-3061(1996)；WO94/09817；Pack等，《分子生物學雜誌》(J.Mol.Biol.)24628-34(1995)]。所述其它功能域也可作為肽連接物，例如，連接CD3抗原結合域與PE成分；或所述其它域可以位於融合分子任何部位，例如，在它們的氨基端或羧基端。
在本發明的優選實施方案中，抗CD3抗體的Fv單鏈與截短的PE片段融合，此PE片段具有轉運和催化功能但基本沒有細胞結合能力。
識別CD3抗原的抗體結合區優選插入替代PE分子缺失的域Ia。所以，在本發明的各種不同實施方案中，優選CD3結合部分通過它的羧基末端(任選通過肽連接物或其它功能域)與PE毒素成分的氨基末端連接。
或者，PE毒素成分可通過羧基末端與CD3結合部分的氨基末端連接(也任選通過肽連接物或其它功能域)。
如果一條單鏈上存在多個CD3結合域，那麼這些CD3結合域可以通過肽鍵或接頭串聯連接在一起，否則便通過插入的PE成分或其它的功能區彼此分隔。
任何連接CD3結合域和PE成分的肽連接物優選能使CD3結合域獨立摺疊和保持活性；沒有產生可能干擾CD3結合域或在患者體內引起免疫反應的有序二級結構的傾向，並且存在可能與CD3結合域相互作用的最小的疏水性或電荷特徵。該連接物優選為1-500個胺基酸；更優選為1-250個胺基酸；甚至更優選僅1-100(例如，1-25、1-10、1-7或1-4)個胺基酸。
對於上述每種優選情況，優選的肽連接物是線性的。
通常，連接CD3結合域和PE成分的包含小分子量無電荷胺基酸的肽連接物可期望符合這樣的肽連接物的標準。例如，在sc(UCHT-1)-PE38中的肽連接物是賴氨酸-丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸(KASGG)(SEQ ID NO9)。各種長度和序列組合的其它肽也可利用。
本發明的免疫毒素最優選是單鏈多肽，其包含通過羧基末端，任選通過肽連接物與PE38的氨基末端融合的UCHT-1的Fv區(或其CD3結合片段)。
sc Fv(UCHT-1)-PE38是600個胺基酸的蛋白，預計分子量為64，563道爾頓(64.5KD)。
應指出的是在正常情況下Met提供給編碼序列以起始從大腸桿菌(E.coli)的轉錄，由於對Met的不完全切割，上述分子的大腸桿菌的實際翻譯產物可能包括一個N末端附加的甲硫氨酸(Met)殘基。另外，根據實施例1製備的sc Fv(UCHT-1)-PE38多肽可能包含在N末端或在2位上(即甲硫氨酸之後)添加的丙氨酸(ALa)，丙氨酸作為添加在N末端的序列便於克隆。UCHT-1輕鏈可變區的成熟氨基末端在SEQ ID NO2的第3位即天冬氨酸(Asp)開始。因此，根據使用的表達菌株和準確的發酵和純化條件的不同，根據實施例1製備的分子的大腸桿菌表達可產生下列一種或多種功能相同的產物由SEQ ID NO1第1-1803個核苷酸編碼的具有SEQ ID NO2第1-601位序列的多肽；由SEQ ID NO1第4-1803個核苷酸編碼的具有SEQ ID NO2第2-601位序列的多肽；和由SEQ ID NO1第7-1803個核苷酸編碼的具有SEQ ID NO2第3-601位序列的多肽。
應該了解，本文所用的術語「sc Fv(UCHT-1)-PE38」包含這種形式的任何蛋白(或相應的核酸)，除非另有說明。
本發明也包括這樣多肽，它們與具有SEQ ID NO2序列的多肽至少80％相同，更優選至少90％相同，甚至更優選至少95％相同，其中，術語「相同」具有前述的含義。
某些免疫毒素分子可以通過多肽鏈上的域之間的吸引力或通過半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵「二聚化」。例如，二聚體可以由二個多肽鏈形成，或由二對鏈形成。二聚體可以是同源二聚體或異源二聚體(異源二聚體的一個實例是PE毒素只存在於二條鏈中的一條鏈上的結構)。根據本發明的某些二價單鏈免疫毒素結構或二聚化的結構，在

圖1中說明。在圖1A、C、D、E和F中展示的二聚化的免疫毒素結構包含二個(或多個)鏈。在圖1B中展示的結構是二價的單鏈免疫毒素。在1E中展示的分子是與毒素連接的重組製備的全長抗體。圖1F的結構是與毒素連接的重組製備的F(ab』)2片段(即包含二對鏈的二聚體)。在圖1展示的結構中PE毒素優選是PE38，並且抗體的可變域來自UCHT-1。
具體地，本發明二聚體免疫毒素的第一個說明性實施方案是雙倍體(diabody)，其在圖1A中展示。「雙倍體」是指包括二個(優選相同的)單鏈的免疫毒素結構，每個鏈包含VL和VH區及PE突變毒素，上述鏈由於可變區之間的吸引力(例如，氫鍵，未在圖1A中顯示)而不是二硫鍵而相互結合。圖1A展示一對具有構型VL-L-VH-PE突變毒素的單鏈。
與單鏈免疫毒素對比，為防止鏈內Fv的形成，在雙倍體的每個多肽鏈中，優選VL和VH域之間的接頭L基本是剛性的，並且通常不多於10個胺基酸，更優選不多於1-5個胺基酸，如接頭的實例(Gly)4Ser(SEQID NO10)所示，並甚至可以完全不存在。(相反，在單鏈免疫毒素的VL和VH之間的接頭優選至少約14個胺基酸)。所以，雙倍體中功能性的Fv區實際上是通過二個鏈的相互作用形成的。雙倍體可以從哺乳動物細胞和大腸桿菌表達。雙倍體的結構總體上已由Hollinger等[美國國家科學院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.)906444(1993)]和Wu等[Immunotech 221(1996)]描述。
在本發明的另一個說明性的實施方案中，串聯的單鏈結構，象在圖1B中展示的，包含二個連續連接的抗CD3 Fv區，即它們通過肽鍵或任選可彎曲的肽接頭連接。圖1B展示結構的構型為VL-L-VH-X-VL-L-VH-Y-毒素，其中，X和Y可從肽鍵或接頭中獨立選擇。具體地，L可以是接頭，即(GGGS)4(SEQ ID NO5)，並且每個X和Y可以有如sc Fv(UCHT-1)-PE38的「連接物」序列(即KASGG，SEQ ID NO9)一樣的序列。與sc Fv(UCHT-1)-PE38結構相同，二個Fv區中的每一個Fv區的VL和VH域都被可彎曲的肽接頭分開(在圖1B和圖1C和D中通過連接每個VL和VH域的環線顯示)，此肽接頭優選包含大約10-30胺基酸，更優選包含大約14-25個胺基酸。在圖1B展示的結構中的二個Fv區優選都是抗CD3結合域。所以，在一個實施方案中，Fv區可結合CD3的同一個表位，甚至Fv區可以是相同的(或為促進表達或抑制重組可以修飾每個區或它的編碼核苷酸序列)；或可以選擇每個Fv與人CD3抗原上的不同表位結合。本發明的PE毒素成分可與Fv區中的一個Fv區的羧基或氨基端(任選通過插入的接頭或功能序列)連接。(或者，多PE毒素片段也可以出現在該分子中)。在圖1B中，PE序列與Fv區之一的羧基末端連接。
在串聯的單鏈抗體分子中抗原結合區可以與不同的抗原結合，使此分子具備「雙特異性」，這由Gruber等[《免疫學雜誌》1525368(1994)]、Kurcucz和Segal[《免疫學雜誌》1544576(1995)]和Mallender等[《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)269199(1994)]Mack等[美國國家科學院院刊927021(1995)]進行了總體描述。
本發明的另一個結構是從二個多肽鏈製備的，每一個多肽鏈包含通過結合力(例如，氫鍵)而不是二硫鍵促進鏈之間二聚化的「二聚化區」。(在此提到的結合力在圖1C中以園點表示，圖1D中也是如此)。在圖1C中每個二聚化區用一對星號表示，其可以位於鏈內部，例如，在Fv區和PE毒素成分之間(見圖示)；另一方面，二聚化區可以位於Fv區的N末端(未顯示)；另一方面，二聚化區還可以位於PE毒素的C末端(未顯示)。在圖1C中顯示的結構每條鏈有構型VL-L-VH-二聚化區-PE突變毒素。二聚化區由Pack和Pluckthun[《生物化學》311579(1992)]和Kostelny等，同上，進行了總體描述。適合的二聚化區可來自異源二聚體轉錄因子或兩性螺旋，並且可在哺乳動物細胞和大腸桿菌中表達。
根據本發明的另一個二聚化結構是從單鏈免疫毒素製備的，該單鏈免疫毒素包含Ig的鉸鏈區和第三個恆定區(「CH3」)，它們是通過二硫鍵的形成和CH3片段之間的吸引力進行二聚化的。
如在圖1D中展示的，本發明的「微體」(Minibody)-毒素包括二個(例如，相同的)單鏈，每個單鏈包含一個Fv區，其通過鉸鏈區(「H」)和CH3，例如人IgG1的CH3和PE毒素部分連接。在圖1D中每一個淺影的橢圓代表鉸鏈區和CH3區。所以，每個鏈有構型VL－L－VH－H＋(H3-PE突變毒素。多肽鏈通過各自的鉸鏈和CH3區之間的二硫鍵(在圖1D、1E和F中粗線代表)和結合力(園點代表)連接。(在圖1D中有一個改變了的結構稱為「微體-毒素」，其通過把鉸鏈區中通常與天然抗體的重鏈和輕鏈配對的半胱氨酸替換為例如絲氨酸或丙氨酸，並使在鉸鏈區剩餘的與重鏈結合的二個半胱氨酸保持完整來進行突變，以防止半胱氨酸的錯誤配對)。
其它的變體則利用來自其它同型免疫球蛋白或其它類型哺乳動物如小鼠的IgG’s的鉸鏈區。「微體」已由Hu等在《癌症研究》563055(1996)中進行了總體描述。
本發明另一個說明性的結構包括通過重鏈(圖1E左圖)或輕鏈的(圖1E右圖)C末端與根據本發明的PE突變毒素融合的重組抗體。象天然抗體一樣，鏈與鏈之間通過二硫鍵連接(連接鏈之間的粗線)。上述全長抗體毒素通常成對二聚化。在此結構中，非-huFcγ-受體結合Ig，如鼠IgG2b或人IgG4可以替代天然Fc。任選地，重鏈和輕鏈中都存在PE毒素成分(未顯示)。
根據本發明的另一個結構包含重組製備的F(ab』)2片段(包括指出的鉸鏈區)，它通過重鏈(圖1F左圖)或輕鏈(圖1F右圖)(任選通過接頭，未顯示)的羧基端與PE毒素連接。所述F(ab』)2毒素分子通常成對地二聚化。(圖1F中的淺影橢圓代表重鏈的恆定區(「CH」)或輕鏈的恆定區(「Cκ」))。該多肽鏈的鉸鏈區來自恆定區的以二硫鍵連接的連接物，冠以「鉸鏈」的標記。所以，各自的鏈具有構型VL-Cκ和VH-CH-鉸鏈-PE毒素(圖1F，左側)，或VL-Cκ-PE毒素和VH-CH1-鉸鏈(圖1F，右側)。
上述結構可從已知的起始材料通過本領域技術人員已知的重組工程技術製備。
本發明也旨在包括多肽的同系物(和編碼所述多肽的DNA分子)，它們和公開的各種類多肽不同的在於，例如，在基本上不影響CD3結合能力或免疫毒素的催化活性的情況下，它們對整個公開多肽中的胺基酸有保守的替代，或進行殘基的微小刪減或添加。
「保守的替代」是指一個或多個胺基酸由其它的有相似特性的胺基酸替代，以致多肽化學領域的技術人員可以預測至少該多肽二級結構，優選三級結構基本不改變。保守的替代一般在側鏈有關係的胺基酸家族中進行。典型的胺基酸替換包括丙氨酸或纈氨酸替代甘氨酸，天冬醯胺替代穀氨醯胺，絲氨酸替代蘇氨酸和精氨酸替代賴氨酸。
在此公開的各類免疫毒素的同系物也在本發明的範圍內。
術語「同系物」或「同源性」是指二個肽或二個核酸分子之間的序列相似性。同源性能通過比較可能為了比較的目的而對比的每個序列中的位置而確定。當比較序列中的一個位置被相同的鹼基或胺基酸佔據時，那麼在那個位置上這些分子的同源的。序列之間的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置數的函數。
優選地，本發明中各種免疫毒素多肽的任何同系物至少80％，優選至少90％，更優選至少95％與所述本發明免疫毒素多肽相同。
本發明的多肽的所有胺基酸(除甘氨酸外)優選為天然存在的L-胺基酸。
分離的編碼本發明重組免疫毒素多肽和它們的同系物的多核苷酸(例如cDNA)也在本發明的範圍內，這些多核苷酸尤其是編碼具有SEQ ID NO2第1-601、2-601或3-601個殘基的sc(UCHT-1)-PE38，或至少有100個(優選至少200個)胺基酸的sc(UCHT-1)-PE38片段的多核苷酸。
本發明不僅包括在SEQ ID NO1中顯示的核酸，而且包括分離的編碼SEQ ID NO2的多肽或它們的片段的核酸，其序列由於遺傳密碼的簡併性而不同於SEQ ID NO1顯示的核苷酸序列；本發明也包括前述核酸的互補鏈。
另一方面，本發明提供如下多核苷酸(優選至少具有300個鹼基(核苷酸)，更優選至少具有600個鹼基，甚至更優選至少具有900個鹼基)，該多核苷酸可與編碼本發明多肽，如SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸雜交。所述雜交反應可以在低或高嚴緊的條件下進行。
適當的促進DNA雜交的嚴緊條件(例如，用6.0×氯化鈉/硝酸鈉(SSC)在大約45℃雜交，然後用2.0×SSC在50℃洗滌)對本領域的技術人員是熟知的或能在「當代分子生物學實驗手冊」John Wiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可從大約2.0×SSC、50℃的低嚴緊條件到0.2×SSC，50℃的高嚴緊條件選擇。除此之外，洗滌步驟中的溫度可從大約22℃的室溫(RT)的低嚴緊條件增加到大約65℃的高嚴緊條件。術語「嚴緊雜交條件」是指在包含50％甲醯胺，5×SSC，750mM NaCl，75mM檸檬酸三鈉，50mM磷酸鈉(PH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/ml變性的剪切鮭魚精子DNA的溶液中42℃孵育過夜，然後在約65℃ 0.1×SSC中洗滌濾膜。
「分離的」多核苷酸是指已離開它們的天然環境的核酸分子，DNA或RNA。例如，為了本發明的目的，包含在載體中的重組DNA分子被認為是分離的。分離的DNA分子的進一步實例包括在異源宿主細胞中的重組DNA分子或溶液中(部分或基本)純化的DNA分子。分離的RNA分子包括本發明DNA分子的體內體外RNA轉錄本。根據本發明的分離核酸分子進一步包括合成產生的這類分子。
本發明也包括編碼本發明的肽連接物和/或接頭的分離的寡核苷酸。應該把這些寡核苷酸和編碼CD3結合域和PE成分的多核苷酸「在閱讀框中融合」，並且，優選該分子中包含獨特限制位點。
「在閱讀框中融合」是指(1)在CD3結合域或PE成分的閱讀框中沒有由接頭寡核苷酸引起的移碼；並且(2)在CD3結合域和PE成分的閱讀框之間無翻譯終止。
本發明進一步包含本發明新融合多肽的生理功能相同的蛋白，其是該新多肽合成過程中的中間物。術語「生理功能相同的」是指包括本發明融合多肽的更大分子，此更大分子已經添加了例如本發明的成熟重組融合蛋白從特定的宿主細胞中有效表達和分泌所必需或期望的胺基酸序列。這種添加的序列典型地存在於成熟蛋白的氨基末端，並且，通常構成前導(即信號)序列，指導蛋白進入分泌途徑，且在正常情況下，在蛋白從細胞分泌的同時或之前從蛋白中被剪切下來。信號序列可來自相關蛋白的天然N末端區，或者從編碼分泌蛋白的宿主基因獲得，或者來自已知可增加目的多肽分泌的任何序列，包括合成的序列和「前」和「原」區之間的所有組合。信號序列和編碼成熟蛋白的序列之間的接合部應該與在宿主內的剪切部位相對應。
在本發明的多肽中，CD3結合域引導表達，即在融合分子中處於其它編碼序列的上遊，所以，利用信號序列有效地獲得從哺乳動物系統(如CHO，COS)，或酵母(例如，P.pastoris)的表達可能是可行的。然而，附加的信號序列不一定是天然免疫球蛋白鏈的信號序列，它可以從任何適合的來源獲得，只要它適合實現成熟多肽從特定宿主細胞的表達/分泌。
在本發明蛋白的氨基或羧基末端附加便於純化的其它序列被認為是本發明的部分。這些序列的實例包括為在鎳親和樹脂上純化的多組氨酸標記和為抗c-myc或血凝素(HA)抗體所識別的肽序列。這類肽「標記」對本領域的技術人員是熟知的。
在PE毒素成分引導表達的本發明免疫毒素多肽中，適合的前導序列可能包含天然PE外毒素A前導序列(SFQ ID NO4)，以完成成熟的異源多肽從大腸桿菌、哺乳動物細胞(例如，CHO，COS)或酵母的分泌。然而，其它的前導序列，它們對PE或宿主細胞不一定是天然存在的，也可以提供在某些宿主中的成熟融合蛋白的有效表達。
4.製備本發明重組免疫毒素的一般方法a. 製備產生來自抗體的CD3結合部分克隆一個或多個抗體區域的一般策略從提取雜交瘤中的RNA開始，然後用隨機六聚體作引物進行RNA反轉錄。
具體地，為克隆抗體的Fv片段，每個VH和VL域都通過多聚酶鏈或反應(PCR)擴增。重鏈序列能用根據重鏈的氨基末端蛋白序列設計的5』末端引物和根據共有的免疫球蛋白恆定區序列設計的3』引物擴增(Kabat和Wu，同上)。輕鏈Fv區用根據抗體輕鏈的氨基末端蛋白序列設計的5』末端引物和C-kappa引物擴增。儘管本領域的技術人員將了解可以從本文提供的序列表中獲得其它適合的引物，但分離UCHT-1的Fv區的適合引物在實施例1中已經提到。
將粗PCR產物亞克隆到適當的克隆載體中。鑑定通過DNA限制性消化包含正確大小插入片段的克隆。用靠近克隆位點的測序引物從雙鏈質粒DNA測定重鏈或輕鏈編碼區的核酸序列。商業供應的試劑盒(例如，Sequenase試劑盒，美國生物化學公司，Cleveland Ohio，美國)可用於方便測定DNA的序列。
人們也可以理解，給定本發明公開的序列信息，利用熟知的方法本領域普通的技術人員可以輕易製備編碼這些序列的核酸。所以，編碼Fv區的DNA可以通過任何適當的方法製備，這些方法包括如擴增技術如連接酶鏈式反應(LCR)和維持自身的序列複製，適當序列的克隆和限制性消化，或直接化學合成，如通過磷酸三脂法、磷酸二脂法、二乙基亞磷醯胺法和固體支持法的化學合成。化學合成產生單鏈寡聚核苷酸。這可以通過與互補序列雜交或通過用單鏈作模板、用DNA酶進行聚合反應轉化成雙鏈DNA。儘管有可能化學合成整個單鏈Fv區，但優選合成大量短序列(大約100-150個鹼基)，然後將它們連接在一起。或者，克隆亞序列，然後用適當的限制酶剪切適當的亞序列。然後連接各片段產生所要的DNA序列。
一旦獲得Fv可變的輕鏈和重鏈DNA，用本領域技術人員熟知的技術就可以或直接，或通過編碼肽接頭的DNA序列，或通過PCR把這些序列連接起來。在優選實施方案中，重鏈和輕鏈區通過可彎曲的肽接頭連接，肽接頭起始於輕鏈Fv域的羧基末端，終止於重鏈Fv區的氨基末端。整個序列是以單鏈CD3結合部分的形式編碼Fv域的。
b.將CD3結合區與PE成分融合可以把Fv區直接和毒素部分融合，或者通過連接肽將它們連接在一起。連接肽只是用來提供抗體和毒素部分之間的空間或者增加這些區域之間的移動性使它們各自獲得最佳的構象。包含連接肽的DNA序列也可提供序列(如引物位點或限制位點)便於克隆或保持編碼抗體和毒素部分的序列之間的閱讀框。
通常，根據本發明的免疫毒素融合蛋白的克隆涉及分別製備編碼CD3結合部分的DNA和編碼PE毒素部分的DNA，然後在質粒或其它載體中重組這些DNA序列形成編碼這一特定目的融合蛋白的結構。載體可以是包含適當啟動子序列等的表達質粒，或者免疫毒素編碼DNA片段隨後可以被轉移到表達質粒中。另一個方法涉及把編碼CD3結合部分的DNA插入編碼PE毒素部分的已形成的結構中。
c.重組免疫毒素的表達本發明的蛋白可以在各種宿主細胞中表達，這些細胞包括大腸桿菌、其它細菌宿主、酵母和各種高等真核細胞如COS、CHO和HeLa細胞系和骨髓瘤細胞系。可以把重組蛋白基因可操作地連接到針對每個宿主適當的表達控制序列上。對大腸桿菌來說，控制序列包括啟動子如T7、trp、tac或λ啟動子、核糖體結合部位，並優選包括轉錄終止信號。對真核細胞來說，控制序列包括啟動子和優選來自免疫球蛋白基因、SV40、巨細胞病毒等的增強子，和聚腺苷酸化序列，並且可以包括剪接的供體和受體序列。
白喉毒素和假單胞菌外毒素都可通過延伸因子-2(EF-2)(一種必需的真核轉錄因子)的ADP-核糖基化阻止真核細胞中的蛋白合成。所以，對於真核表達，優選使用EP-2被突變因而對假單胞菌外黴素引起的ADP-核糖基化具有抗性的細胞。此突變宿主和突變EF-2蛋白對哺乳動物[(Moehring等，《體細胞遺傳學》(Somatic Cell Genetics)5469-480(1979)；Kohno等，《生物化學雜誌》26212298-12305(1987)]和酵母細胞[Phah等，《生物化學雜誌》2688665-8668(1993)；Kimata等，《生物化學生物物理學研究通報》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)1911145-1151(1993)]已有描述。
本發明的質粒能通過熟知的方法例如大腸桿菌的氯化鈣轉化法和哺乳動物細胞的磷酸鈣處理或電穿孔轉移到選擇的宿主細胞中。被質粒轉化的細胞可通過對抗生素的抗性被選擇出來，這種對抗生素的抗性是由包含在質粒中的基因如amp、gpt、neo、hyg基因賦予的。
顯然，在不降低生物學功能的情況下，可以修飾單鏈Fv區和包含單鏈Fv區的的融合蛋白。可以進行一些修飾便於克隆、表達或將單鏈Fv區納入融合蛋白中。這些修飾對本領域的技術人員是熟知的，它們包括把甲硫氨酸加在氨基末端提供起始位點，或把胺基酸附加在任何一個末端製造位置方便的限制位點或終止密碼子。例如，在實施例1中所使用的引物引入了為在大腸桿菌中表達的一個編碼起始甲硫氨酸的序列和便於克隆的BamHI、XbaI、SalI、NcoI和BstXI限制位點。
一經表達，可根據本領域標準的方法將重組蛋白純化，這些方法包括硫酸胺沉澱法、親和柱法、柱層析法、凝膠電泳法等。優選基本純化的至少大約90％-95％均一的組合物，並且對於藥用，最優選有98％-99％或大於99％均一性的組合物。一經純化，部分或完全達到期望的均一程度的多肽用作藥物用途應該基本無內毒素，並且可以用於治療。
本領域的技術人員將了解，在化學合成、生物表達、或純化後，單鏈Fv區或包含單鏈Fv區的融合蛋白可能具有與天然蛋白基本不同的構象。在這種情況下，有必要將此蛋白變性和還原，然後使它重新摺疊成優選的構象。
表達單鏈抗體和/或變性蛋白和誘導重新摺疊到適當摺疊形式的方法，包括來自細菌如大腸桿菌的單鏈抗體已有描述，並且是人們熟知的，這些方法也適用於本發明的多肽[Buchner等，《分析，生物化學》(Analytical Biochemistry)205263-270(1992)]。
具體地，來自大腸桿菌或其它細菌的功能蛋白通常從包含體產生並且需要用強變性劑對蛋白進行溶解，然後，重新摺疊。在溶解這個步驟中，本領域熟知需要有還原劑存在把二硫鍵打開。一種有還原劑的緩衝液的實例是0.1M tris，pH8，6M胍，2mM EDTA，0.3M DTE(二硫赤蘚糖醇)。蛋白二硫鍵的重新氧化可以在低分子量還原和氧化形式的巰基試劑存在下得到有效催化，Buchner等(同上)對此有描述。典型的復性過程可以通過將變性和還原的蛋白於重新摺疊緩衝液中進行稀釋(例如，100倍)來完成。已發現，在8mM GSSG存在下進行復性可提供可重複的、高度穩定的產物。為達到此目的的一種緩衝液實例是0.1M tris，pH8.0，0.5M L-精氨酸，8mM氧化型穀胱甘肽(GSSG)和2mM EDTA。
5. 重組抗-CD3免疫毒素的治療應用為治療或預防T細胞介導的免疫系統疾病或異常狀態，本文描述的免疫毒素多肽可用來實現削減至少部分T細胞。為系統降低患者體內的T細胞群體，免疫毒素可以在體內方法中應用。為從已處理過的細胞群中削減T細胞，免疫毒素也可以離體應用。
體內應用為在患者體內系統殺傷T細胞，向患者體內施用免疫毒素對T細胞介導的疾病或異常狀態提供預防和治療，和在骨髓或幹細胞移植或來自人(同種異體)或非人源(異種)的實體器官移植時作為製劑或調節方案或誘導耐受治療的一部分，都包括在本發明的範圍之內。
B和T淋巴細胞都起源於骨髓，來源於共同的淋巴樣先祖細胞，多能幹細胞，但僅B淋巴細胞在骨髓中成熟。T細胞轉移到胸腺經歷成熟，然後進入血流，從血流中移向外周淋巴組織。淋巴組織包括產生淋巴細胞的中樞淋巴器官，和引發適應性免疫應答的次級或外周淋巴器官。中樞淋巴器官是骨髓和胸腺。外周淋巴器官包括淋巴結、脾臟、腸道相關淋巴組織、氣管相關淋巴組織和黏膜相關淋巴組織(Janeway和Travers，同上，§1-2)。
本發明包括治療和預防患者體內T細胞介導的疾病的方法，包括給有此需要的患者施用T細胞削減有效量的本發明免疫毒素。在患者的骨髓，外周血和/或淋巴組織中T細胞水平的削減的能改善患者的T細胞介導的對抗原的塑料應答，並且輔助誘導免疫耐受。例如，為在患者體內實現削減T細胞並由此預防或降低患者體內T細胞介導的對移植的同種異體(或異種)細胞、組織和器官的急性或慢性移植排斥，或促使對這些細胞、組織或器官的免疫耐受的產生，可將本發明免疫毒素有用地施用給接受了或即將接受同種異體移植(或異種移植)的患者。
優選地，當體內施用藥物預防或治療器官移植排斥時，期望將本發明免疫毒素以若干劑的方式在一段時間內施用給患者。通常，優選至少第一劑在移植手術前施用(優選儘可能提前)，隨後的一劑或多劑在手術的同時或手術後迅速施用。
免疫毒素能在體內單獨或與其它有效治療急性或慢性移植排斥的藥物製劑聯合施用，這些製劑包括環孢素A、環孢素G、雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙基雷帕黴素(RAD)、FK-506、黴酚酸、黴酚酸莫非替克(mycophenolate mofetil，MMF)、環磷醯胺、硫唑嘌呤(azathioprene)、來氟米特、咪唑立賓、一種脫氧精胍菌素(deoxyspergualine)化合物或其衍生物或類似物，2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1，3-二醇(優選作為鹽酸鹽(FTY720))、皮質類固醇(例如，氨甲蝶呤、強的松龍、甲潑尼龍、地塞米松)或其它的免疫調節化合物(例如，CTLA4-Ig)；抗-LFA-1或抗-ICAM抗體或其它防止T細胞共刺激的抗體，例如，針對白細胞受體或它們的配體的抗體(例如，針對MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD40、CD45、CD58、CD152(CTLA-4)、CD154(CD40配體)的抗體)。
具體地，移植物接受時間延長和甚至明顯的免疫耐受能通過本發明的抗CD3免疫毒素和精胍菌素衍生物如脫氧精胍菌素化合物或者精胍菌素類似物聯合施用而獲得。並且，本發明的一個優選實施方案包含在耐受誘導方案中抗CD3免疫毒素和脫氧精胍菌素化合物的聯合施用，參見例如，Eckhoff等1997年5月15日提交給美國移植外科協會的摘要，和Contreras等，《移植》651159(1998)，兩者都納入作參考。術語「脫氧精胍菌素化合物」包括15-脫氧精胍菌素(稱為「DSG」，也稱作胍立莫司)，即N-[4-(3-氨基-丙基)氨基丁基]-2-(7-N-胍基庚醯胺基)-2-羥基乙醯胺，和它的藥用鹽，公開於US4518532，納入作參考；(-)-15-脫氧精胍菌素和它的藥用鹽，公開於US4,525,299，納入作參考。有旋光活性的(S)-(-)或(R)-(+)-15-脫氧精胍菌素同型異構體和它們的鹽在US5,869,734和EP 765,866中公開，二者都納入作參考；和DSG的三鹽酸鹽形式，在美國5,162,581中公開，納入作參考。
在免疫耐受的誘導方案中和抗CD3免疫毒素一起應用的其它精胍菌素衍生物包括在US4,658,058，US4,956,504，US4,983,328，US4,529,549和EP213,526，EP212,606，中公開的化合物，這些文獻都被納入作參考。
本發明在進一步優選的實施方案中包含根據本發明的抗-CD3免疫毒素和其它精胍菌素類似物如在US5,476,870和EP600,762(都納入作參考)中公開的化合物聯合施用，例如， 化合物(a)即2-[[[4-[[3-(氨基)丙基]氨基]丁基]氨基]羰氧基]-N-[6-[(氨基亞氨基甲基)-氨基]己基]乙醯胺(″tresperimus″)和它的與無機或有機酸形成的可藥用加成鹽；在美國5,637,613和EP669,316(都納入作參考)中公開的化合物， 化合物(b)即2-[[[4-[[3(R)(氨基)丁基]氨基]丁基]氨基羰氧基]-N-[6-[(氨基亞氨基甲基)-氨基]己基]乙醯胺基三(三氟乙酸酯)和它們的其它可藥用鹽。上述化合物的可藥用鹽包括與無機和有機酸形成的鹽，這些無機和有機酸包括(無機酸)鹽酸、溴酸、硫酸和磷酸以及(有機酸)延胡索酸、順丁烯二酸、甲磺酸、草酸、和檸檬酸；在US5,733,928和EP743,300中公開的化合物，這些文獻都納入作參考；在US5,883,132和EP755,380中公開的化合物，這些文獻都納入作參考；和在US5,505,715中公開的(例如，co1.4，I.44-co1.5，I.45)化合物，該文獻納入作參考。
「聯合施用」是指用本發明的抗CD3免疫毒素和精胍菌素衍生物或類似物二者治療器官移植接受者。
免疫毒素和精胍菌素衍生物或類似物的施用不必同時進行，可以在時間上分開施用。然而，典型的情況是，免疫毒素和精胍菌素相關化合物的施用時程將至少有一定程度的重疊。
抗CD3免疫毒素的總劑量優選通過2-3次注射給予，第一劑在移植之前儘可能最早時間施用，隨後各劑間隔施用，例如，間隔約24小時施用。
優選將免疫毒素在移植之前和在移植的同時和/或移植之後施用。在同種異體移植過程中，抗-CD3免疫毒素優選在移植手術前大約2-6小時施用，然而，對異種移植或生命相關的同種異體移植，第一次抗-CD3注射可以在移植之前一周進行，參見例如，Knechtle等[《移植》631(1997)]。在免疫耐受誘導方案中，免疫毒素治療優選縮短至不晚於移植後14天，優選約在第七天，或在第五天，甚至在第三天。
精胍菌素衍生物或類似物的施用可以在移植前，移植的當時，和/或移植後。在移植前或移植後治療時間的長短可以變化。
在免疫耐受誘導方案中，用精胍菌素衍生物或類似化合物治療優選在移植後不晚於大約120天停藥，並且，更優選在移植後60天，更優選移植後大約30天，甚至更優選不晚於14天，或甚至10天停藥。
所以，術語「聯合施用」的範圍包括這樣的治療方案內，例如，一劑或多劑免疫毒素在移植之前施用，然後一劑或多劑靠近移植時的前後開始施用；並伴隨在移植前和/或在移植的當時施用精胍菌素衍生物或類似物，並且，典型的情況是在移植後繼續施用。
皮質類固醇激素例如甲潑尼龍可以被納入聯合施用方案中。例如，類固醇可以在移植之前開始施用，並且在此之後可以繼續施用一劑或多劑。
本發明的抗CD3免疫毒素優選以足以降低T細胞數量2-3個log值的劑量提供給患者。根據本發明，降低患者T細胞數量2-3個log值的全部有效劑量可以在約50μg/kg和大約10mg/kg實驗對象的體重之間，和更優選在約0.1mg/kg和1mg/kg之間。
用精胍菌素衍生物或類似物誘導治療的劑量方案可以在10mg/kg/天，治療0-30天，最佳是例如大約2.5mg/kg/天，治療15天。
附加的類固醇可以在抗CD3免疫毒素注射的同時施用，例如，甲潑尼龍以劑量逐漸降低的方式施用，例如，在移植手術的當天7mg/kg，在+24小時3.5mg/kg和在+48小時0.35mg/kg。類固醇劑量也可以一直保持恆定，例如，在免疫毒素注射同時用40mg/kg潑尼松治療。可以理解，與標準的臨床實踐一致，類固醇確切的劑量和選擇可以更改。
在本發明的聯合治療的優選實施方案中，聯合治療的免疫毒素是scFv(UCHT-1)-PE38，尤其是有SEQ ID N01序列的免疫毒素。該scFv(UCHT-1)-PE38優選和15-脫氧精胍菌素尤其是(-)-15-脫氧精胍菌素共同施用。在另一方面，該scFv(UCHT-1)-PE38和上述化合物(a)共同施用。在再另一個實施方案中，該scFv(UCHT-1)-PE38和上述化合物(b)共同施用。
在上述聯合治療的實踐和本發明的其它的方法中，在並種移植的情況下，尤其移植物接受者是人時，供體細胞、組織或器官優選是豬的，並且最優選來自轉基因豬，例如，表達人DAF的豬。
在本發明的方法的另一實施方案中，可以將免疫毒素施用到骨髓接受者體內，通過殺傷宿主(即骨髓移植的接受者)的T細胞預防和治療宿主抗移植物疾病。骨髓移植在某些疾病的治療中變得必不可少，如白血病、再生障礙性貧血、或某些遺傳性疾病，在這些情況下，患者自身的骨髓嚴重損傷或經放療和化療後患者的造血系統已經破壞。如果骨髓移植沒有能使造血系統重建，患者將呈現嚴重免疫抑制和易受感染。
供體同種異體骨髓的穩定移植大部分取決於供體和受體之間的MHC的匹配。一般情況下，在骨髓移植中僅僅一個或二個抗原不匹配對因為接受者的T細胞對不同的骨髓移植物所造成的排斥是可以耐受的(也可以出現移植物抗宿主疾病，這在以下討論，當存在較大差異時，這種疾病會非常嚴重)。另外，甚至極小程度的不吻合常規也需要對接受者進行致死或亞致死劑量的全身射線照射或整個淋巴系統放射處理以消減接受者的T細胞。進行骨髓移植的患者需要進行射線照射使他們完全或幾乎完全無免疫能力，這對臨床應用骨髓移植治療許多疾病如實體器官或細胞移植、鐮狀細胞貧血、地中海貧血和再生障礙性貧血等帶來了明顯的限制，儘管骨髓移植對這些疾病的治療可能是有用的。
本發明在不進行射線照射的情況下通過提供一種定向殺傷接受者T細胞的方法解決這個問題。
所以，本發明在另一方面提供一種在患者接受供體的骨髓和/或幹細胞富集的外周血細胞移植之前調節骨髓移植患者的方法，該方法包括向患者施用T細胞削減有效量的免疫毒素。免疫毒素使患者體內T細胞群減少，因而可預防宿主(即患者)對供體骨髓移植物的排斥。獲得含豐富造血幹細胞的供體組合物的方法在US5,814,440、US5,681,559、US5,677,136和US5,061,620中公開，所有文獻一併納入作參考。
特別地，移植物抗宿主疾病(GVHD)有時是致命的，通常引起同種異體骨髓移植的身體衰弱併發症，這主要(如果不是全部的話)由T淋巴細胞介導。GVHD是由骨髓移植接受者從移植物中獲得的供體T細胞引起，該供體T細胞產生抗宿主的免疫反應。GVHD典型地由供體和接受者人白細胞抗原(HLA)的不完全免疫學匹配引起。
因此，本發明也涉及一種預防和治療骨髓移植患者中GVHD的方法，該方法包含在移植後早期階段或在GVHD的症狀變得明顯時以足以降低宿主(即患者)體內供體和宿主兩者的T細胞水平的劑量施用本發明的免疫毒素。供體和宿主T細胞的早期削減也促使同種異體嵌合狀態的產生；即，在宿主T細胞被免疫毒素削減之後再次成熟的T細胞呈現對供體和宿主抗原的耐受並且不參與移植物抗宿主排斥反應。「移植後的早期階段」是指骨髓移植後一天或幾天至不超過大約二周的時間。
在進一步的實施方案中，能將本發明的抗CD3免疫毒素施用給有此需要的患者以治療其它的T細胞介導的疾病，例如，T細胞白血病和淋巴瘤。如前所述，臨床治療T細胞白血病和淋巴瘤典型地依賴整個身體的射線照射以不加區別地殺傷患者體內的淋巴細胞，在此之後進行骨髓替換。將本發明的免疫毒素施用給患白血病/淋巴瘤的患者可用一種選擇清除T細胞方法替換整個身體的射線照射。
在本發明的另一個方面，也可以將本發明的免疫毒素體內施用給患者，通過削減患者T細胞群治療T細胞介導的自身免疫病，如系統性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病，類風溼性關節炎(RA)、重症肌無力和多發性硬化症。也能將免疫毒素施用給患免疫系統感染疾病如獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)的患者，施用量足以削減患者感染的T細胞從而抑制患者體內的HIV-1的複製。另外，也可以將抗CD3免疫毒素施用給患者以治療那些不能接受慢性免疫抑制治療的異常情況或疾病，例如，對患有糖尿病或代謝性疾病的患者分別通過有利於胰島或肝細胞的移植來進行治療。用肝移植可以糾正的疾病或易感狀態包括血友病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症和高膽紅素血症。
在本發明的上述方法中，患者優選是人，並且，供體可以是同種異體(即人)或異種(例如，豬)。移植物可以是未經修飾的或修飾過的器官、組織或細胞移植物，例如，心臟、肺臟、聯合心肺、氣管、肝臟、腎臟胰腺、胰導細胞、腸管例如小腸、皮膚、肌肉或肢體、骨髓、食管、角膜或神經組織移植物。
對於體內應用，免疫毒素可以以有效殺傷至少一部分攜帶CD3的細胞(即T細胞)靶群的劑量施用給患者。
一般情況下，有效量的免疫毒素可以削減T細胞靶群，即在淋巴系統和/或外周血中，消減1或多個log值，更優選削減至少約2個log值，甚至更優選削減至少2-3個log值的T細胞靶群。最有效的施用方式和劑量方案依賴於疾病的病程和嚴重程度，施用對象的健康狀況和對治療的反應程度以及治療醫生的判斷。所以，免疫毒素分子的劑量應該根據每個對象調整。
優選地，在治療和預防伴隨骨髓移植髮生的GVHD時，將免疫毒素在骨髓移植後迅速施用給骨髓移植接受者，施用的劑量為足以降低存在於患者血和淋巴結中的全部T細胞群(即供體加受體T細胞)至少約50％，更優選至少約80％，甚至更優選至少約95％(例如，99％)，即至少2個log值(如2-3個log值)。
治療或預防骨髓移植接受者的宿主抗移植物疾病和/或GVHD的適當投藥方案可能包含在骨髓移植前即刻和/或骨髓移植後即刻施用免疫毒素，在移植後6天的時程中隔天一次施用，全部劑量約10-500μg/kg，優選200-300μg/kg。
在對白血病/淋巴瘤治療時，免疫毒素施用的劑量足以降低施用當時的T細胞群的至少約50％，更優選至少約80％，甚至更優選至少約95％(例如99％)，即至少2個log值(如至少2-3個log值)。
在患者的骨髓、血或淋巴組織中攜帶CD3的細胞的水平，尤其是T細胞的水平，可以通過FACS分析檢測。
在削減外周血和淋巴器官的T細胞的過程中免疫毒素治療的有效性能通過比較免疫毒素治療前後實驗對象的血樣品和浸軟的淋巴組織中T細胞的數量來確定。T細胞的削減可以通過流式細胞儀跟綜測定，見Neyille等的描述[《免疫治療雜誌》(J.Immunother.)1985-92(1996)]。
已顯示，包含抗恆河猴CD3單克隆抗體和刪除了細胞結合區的白喉毒素的化學連接免疫毒素造成的2個log值的T細胞削減與恆河猴體內同種異體腎臟移植的耐受相關[Thomsa等，《移植》64124-135(1997)；Knechtle等，《移植》631-6(1997)]。
通常，根據本發明，降低患者體內T細胞2-3個log值的總有效劑量最好是在約50μg/kg-約10mg/kg實驗對象體重之間(例如，在約50μg/kg-5mg/kg之間)，更優選在約1mg/kg-0.1mg/kg之間。
患者可以每天進行一次或多次給藥治療。免疫毒素組合物也可以每月施用(或適合以周為間隔)，按一次或多次給藥。
可以想像，在疾病狀態期間，給藥的劑量和時間可以更改。在治療所述疾病時，開始施用組合物時可以在上述範圍內以較高劑量施用，並且施用次數比以後頻繁。
例如，實施例1中的scFv(UCHT-1)-PE38多肽，可以施用給腎移植患者，就在移植前開始施用，移植後繼續，每天或隔天投藥，平均(70kg)體重的患者每周約0.3-10mg，歷時一周。移植後的第一周後，治療方案可減少到隔周投藥，平均體重的患者每周施用0.1mg-1mg多肽。然而，預計免疫毒素的治療將在移植後第5周終止，更典型的在第3周，甚至在移植後第一周終止。
離體應用應用免疫毒素從取自機體的分離的細胞群中離體削減T細胞也在本本發明包括治療和預防T細胞介導的免疫系統疾病或異常狀態的方法，包括在移植或導入患者體內前用本發明的免疫毒素接觸細胞、組織或器官。
在一方面，免疫毒素能應用在預防器官移植排斥的方法中，其中，該方法包含為清除器官內隱蔽的供體T細胞在移植進入接受者體內之前用包含T細胞削減有效劑量的免疫毒素灌注供體器官(例如，心臟、肺、腎臟、肝臟)。
在本發明的另一個實施方案中，通過用免疫毒素清除患者的癌細胞群(例如，骨髓)或者感染的T細胞，然後重新把T細胞削減後的細胞群輸注到患者體內，免疫毒素可以以自身治療的方式離體用於T細胞白血病/淋巴瘤或其它T細胞介導的疾病或異常狀態的治療。
具體地，這種治療方法包含(a)收集來自患者的包含攜帶CD3的細胞的細胞群(例如，骨髓)。
(b)用有效削減T細胞的劑量的免疫毒素處理該細胞群；和(c)將處理過的細胞群輸注到患者體內(例如，進入血液)。
這種自身治療的進一步應用包含治療感染HIV的實驗對象的方法，該方法包含以下步驟(a)從患者分離包含感染HIV的T細胞；(b)用有效削減T細胞的劑量的免疫毒素處理分離的細胞群；和(c)將處理過的細胞群重新導入患者體內。
根據本發明的另一個實施方案，免疫毒素能離體用於削減來源於供體細胞群中的T細胞以預防骨髓移植患者的移植物抗宿主疾病，同時，誘導耐受。該方法包含以下步驟(a)提供包含適當供體(即有適當的MHC、HLA匹配的同種異體供體)分離骨髓和/或幹細胞富集的外周血細胞的細胞組合物；(b)用有效量免疫毒素處理細胞組合物形成攜帶CD3的活細胞(即T細胞)至少部分削減的接種物；和(c)將處理過的接種物導入患者體內。
因為從供體接種物中削減了T細胞，使得移植之後成熟的供體T細胞對宿主免疫耐受並且不再引發移植物抗宿主排斥。
該方法的優點是，為上述離體治療的目的，可以以遠超過體內能達到或可耐受水平的治療濃度施用免疫毒素。例如，為殺傷培養物中的CD3攜帶細胞，可以將免疫毒素以約0.5-50,000ng/ml的濃度與CD3表達細胞共同孵育在培養液中。
已發現人細胞因子活化的外周血白細胞(CMPBL，5×106/ml)與0.005-50μg/ml在實施例1中製備的免疫毒素在培養基中25℃孵育1小時，可導致存在的CD3+細胞削減約2.5個logs值，同時也可以將PHA誘導的增殖降低到基礎水平，這可通過3H-胸苷的攝取檢測。
在另一方面，上述離體治療方法能與體內免疫毒素的施用聯合使用，以提供治療或預防骨髓移植患者排斥和獲得免疫耐受的改進的方法。例如，為預防和/或治療待進行骨髓移植的患者的宿主抗移植物疾病和/或移植物抗宿主疾病，可以應用包含體內和離體都施用本發明免疫毒素的方法，該方法包含以下步驟(a)降低患者體內(即來自患者外周血或淋巴系統)活的CD3攜帶細胞(即T細胞)水平；(b)提供包含適當供體的用T細胞削減有效量的免疫毒素處理的造血細胞(即骨髓和/或幹細胞富集的外周血細胞)的接種物；和(c)將接種物導入患者體內，之後任選地向患者體內施用免疫毒素進一步削減供體和患者的T細胞。
步驟(a)，即患者T細胞的削減，可以通過向患者體內施用免疫毒素和/或通過包括用免疫毒素離體處理分離的患者骨髓或外周血的自身治療按以上的描述來進行。
本發明的上述體內和離體方法適用於治療可通過骨髓移植治癒或治療的疾病，這些疾病包括白血病，如急性成淋巴細胞白血病(ALL)、急性非成淋巴細胞白血病(ANLL)、急性粒細胞白血病(AML)和慢性粒細胞白血病(CML)、皮膚T細胞淋巴瘤、重度聯合免疫缺陷綜合症(SCID)、骨質疏鬆、再生障礙性貧血、Gaucher’s病、地中海貧血、蕈樣肉芽腫病(MF)、Sezany綜合症(SS)和其它的先天性或遺傳決定的血細胞生成異常。
具體地，利用免疫毒素作為藥劑誘導與同種異體或異種細胞治療或組織或器官移植相聯繫的供體特異和抗原特異性的耐受也在本發明的範圍內。所以，可以將免疫毒素作為調節方案的一部分給藥以在患者體內誘導針對供體細胞、組織或器官，例如心臟、肺、聯合心肺、氣管、肝臟、腎、胰腺、胰島細胞、腸管(例如小腸)、皮膚、肌肉或肢體、骨髓、食管、角膜或神經組織的免疫耐受。
供體特異的系統性移植耐受已在MHC不匹配的動物模型和人體內通過嵌合狀態短暫獲得，這是用供體細胞進行骨髓移植之前對接受者整個淋巴系統射線照射的結果。重新構建的動物在它們的外周血中呈現穩定的混合的多譜系嵌合狀態，這包含所有的淋巴造血細胞系的供體和接受體細胞，包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、紅細胞和血小板。而且，混合的同種異體嵌合體對供體型皮膚移植物顯示供體特異的耐受，同時，它們迅速排斥第三者的移植物。供體特異的耐受也可以通過體外實驗證實，在此實驗中，從嵌合體獲得的淋巴細胞顯示針對同種異體的供體細胞的增殖活性和細胞毒活性下降，但保持正常的對第三者的細胞的免疫反應。
所以，本發明進一步涉及一種調節待移植供體細胞、組織或器官的患者的方法。此方法包括以下步驟(a』)降低患者體內(即患者外周血或淋巴系統)活的CD3攜帶細胞(即T細胞)的水平；(b』)提供包含用T細胞削減有效量的免疫毒素處理過的供體造血細胞(即骨髓和/或幹細胞富集的外周血細胞)的接種物；(c』)將接種物導入患者體內；之後，(d』)將供體細胞、組織或器官移植到患者體內；或者，(a)削減患者體內的攜帶CD3的細胞群；(b)提供包含用T細胞削減有效量的免疫毒素處理過的分離的供體骨髓和/或幹細胞富集的外周血細胞的接種物；(c)將接種物導入患者體內。
上述方法優選在沒有進行全身射線照射或全部淋巴照射的情況下進行，並且最優選在沒有任何射線照射情況下進行。
6. 包含免疫毒素的組合物可將本發明的重組免疫毒素多肽作為一種在可藥用載體中的未修飾的多肽或它的可藥用鹽施用。
此處所用術語「可藥用鹽」是指由如下方式製備的鹽從可藥用的非毒性酸形成所述多肽鏈氨基基團的酸加成鹽，或從可藥用的非毒性鹼形成所述多肽羧基基團的鹼式鹽。這些鹽可以作為內部的鹽和/或作為本發明多肽的氨基或羧基末端的鹽形成。適合的可藥用的酸加成鹽是那些可藥用的非毒性的有機酸、多聚酸或無機酸形成的酸加成鹽。適合的有機酸的實例包含醋酸、抗壞血酸、苯甲酸、苯磺酸、檸檬酸、乙磺酸、延胡索酸、葡萄糖酸、穀氨酸、氫溴酸、鹽酸、羥乙磺酸、乳酸、順丁烯二酸、蘋果酸、杏仁酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、草酸、pamoic acid、泛酸、磷酸、水楊酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、對-甲苯磺酸等，和多聚酸如鞣酸或羧甲基纖維素。適合的無機酸包括無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等。形成羧基鹽的適合的無機鹼實例包括鹼金屬鹽如鈉、鉀和鋰鹽；鹼土鹽如鈣、鋇和鎂鹽；和氨、銅、亞鐵、高鐵、鋅、亞錳、鋁、錳鹽等。優選氨、鈣、鎂、鉀、鈉鹽。適合形成羧基鹽的有機鹼包括有機胺，如三甲基胺、三乙基胺、三(正丙基)胺、二環己基胺、β-(二甲胺)-乙醇、三(羥甲基)氨基甲烷、三乙醇胺、β-(二乙胺)-乙醇、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、N-乙基哌啶、hydrabamine、膽鹼、甜菜鹼、1，2-乙二胺、葡糖胺、methylglucamine、可可鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、咖啡鹼、普魯卡因等。
多肽的酸加成鹽可用常規的方法通過用一或多個當量的所需無機酸或有機酸，例如鹽酸，與多肽接觸製備。肽的羧基鹽可以用一或多個當量的所需鹼例如，金屬氫氧化物鹼例如氫氧化鈉；金屬的碳酸鹽或碳酸氫鹽鹼，例如碳酸鈉或碳酸氫鈉；或胺鹼例如三乙基胺、三乙醇胺等，與多肽接觸常規製備。
對於體內或者離體應用，本發明的藥物組合物包含載體，該載體優選無菌的、無致熱源的、腸胃外可接受的液體。水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、和乙二醇是優選的液體載體，尤其(等滲時)對注射溶液，或離體使用時如此。
可以將包含免疫毒素或其鹽的組合物系統施用，即通過非腸胃的途徑(例如，肌肉內的、靜脈內的、皮下的、或皮內的途徑)或通過腹膜施用。
尤其用於非腸胃施用如靜脈施用或投入體腔或器官的腔隙中的組合物通常包含溶解在可藥用載體中的融合蛋白溶液，所述載體優選含水載體如緩衝鹽水等。這些組合物是無菌的並且通常不含不需要的物質。這些組合物可以通過常規的熟知的滅菌技術滅菌。此組合物也可包含可藥用的接近生理條件所需的輔助物質，如pH值調節和緩衝劑、毒性調節劑等，例如，醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。在這些製劑中免疫毒素蛋白的濃度可以在很寬範圍內變動，並且主要基於液體體積、粘稠度、體重等，並根據選擇的特定施用方式和患者的需要進行選擇。實際製備非腸胃施用的組合物的方法對本領域的技術人員來說是已知的或很明顯的，並且在出版物如Remington’s藥物科學，第15版Mack出版公司，Easton，Pa.(1980)等中有詳細描述。
包含免疫毒素或它們的鹽的藥物組合物可以用於口服、局部或體表施用，例如通過氣霧劑或經皮膚施用。
適合口服給藥的單位劑量形式包括粉劑、片劑、丸劑、膠囊、和錠劑。可以理解，當口服施用時多肽必須防止被消化，如把所述蛋白和組合物混合使其抗酸水解和酶水解，或者把蛋白包裹在有適當抗性的載體例如脂質體中。保護蛋白免受消化的各種方法在本領域是已知的。
體表製劑形式的實例包括噴霧劑、眼藥水、滴鼻劑和軟膏。例如，噴霧劑可以通過將蛋白溶解在適當的溶劑中並且把它放入噴霧器中作為氣霧劑用於常用的吸入治療。眼藥水和滴鼻劑可以這樣製備，即把活性的肽成分溶解在蒸餾水中，然後加任何需要的輔助藥劑，如緩衝液、等滲劑、增稠劑、防腐劑、穩定劑、表面活性劑、抗菌劑等，把此化合物調到pH4-9。也可以製備軟膏，例如，首先從多聚物溶液例如2％羧基乙烯基多聚物的水溶液，和鹼例如2％氫氧化鈉，製備一種組合物，然後將該組合物和鹼混合獲得膠體，然後再將這種膠體與一定量的純化融合多肽混合。
本發明組合物可以通過本領域熟知的方法製備的凍乾物。
在本發明的體內法的實踐中，將有效治療量的重組免疫多肽，它的可藥用鹽或包含免疫毒素或其可藥用鹽的藥物組合物施用給有此需要的患者。
給出以下實施例用來說明本發明和為普通技術人員實施和應用本發明提供幫助，並不打算限制發明的範圍。
實施例1 scFv(UCHT-1)-PE38的製備(a)從雜交瘤細胞中克隆UCHT-1抗體的可變區通過RT-PCR從UCHT-1雜交瘤的RNA擴增編碼鼠抗人CD3 Fv區的基因(Beverley和Callard，1981)，所用寡聚核苷酸引物是基於已公布的UCHT-1 scFv的序列(Shalaby等，同上)和為克隆抗體可變區而描述的共有引物[Orlandi等，PNAS863833-3387(1989)]，參見SEQ ID NO11到SEQ ID NO22。
寡聚物IM34A和IM34B用來擴增VL區，IM-61和IM-34C用來擴增VH片段。然後將這兩個擴增片段亞克隆到大腸桿菌質粒載體中(TA載體，Invitrogen)，並且測定它們的DNA序列。
確定此克隆DNA序列後，通過在適當的限制位點切割pUC18和亞克隆的PCR片段然後用T4 DNA連接酶將它們在連接一起，從而將二個分子合併到單個基於pUC18的質粒中。該質粒包含VL，接著是多接頭，其後是VH，將該質粒用XbaI和SalI切割。由二個退火後的寡聚物，IM-24A和IM-24B，組成的接頭被設計成包含這兩個位點的互補末端，將該接頭插入到XbaI和SalI位點之間。產生的克隆，『克隆B』，編碼與SEQ ID NO2不同的帶有接頭的單鏈免疫毒素。用在scFv(UCHT-1)-PE38中使用的(GGGS)4(SEQ ID NO5)接頭替代此接頭將在下文中描述。然而，首先必需研究在可變區序列中發現與Shalaby等(同上)報導的克隆Fv片段序列有關的二個變更(1)在重鏈序列(VH)中核苷酸第208位上A變為C。這可能反映了Shalaby等(同上)的一個錯誤，因為報導在此位置編碼的胺基酸(亮氨酸)與文中的核苷酸序列無關聯，但確實與現在獲得的克隆序列相關聯；和(2)在第98位胺基酸殘基苯丙氨酸變為絲氨酸。這顯然是PCR導致的錯誤，VL鏈中的這個點突變用標準的4步PCR反應改正，在該PCR反應中，所需的核苷酸變更用互補寡聚物VL2和VL3引入。兩側的寡聚物，5』端的VL1和3』端的VH4，穩定了該變更，這在以下進行描述。
al.VL中點突變的修正用pUC18/UCHT-1『克隆B』作為模板和寡聚物對VL1和VL2或者VL3和VH4設置PCR反應。用凝膠電泳分離這兩個不同的PCR產物，然後將它們的互補末端退火，並用前述退火後的產物作為模板進行第二個PCR反應，其中用VL1和VH4連接上述二個片段。
a2.替代『克隆B』的接頭通過二個順序的PCR反應，以修正了點突變後的質粒作為模板將分開VL和VH的接頭變為包含序列(Gly3Ser)4(SEQ ID NO5)的接頭。二個順序反應的5』末端引物都與載體序列(M13R；New England Biolabs)互補。第一個PCR反應的3』引物是VL6，第二個PCR反應的3』引物是VL8。VL6和VL8與編碼鏈互補；在VL8中BstXI位點朝向UCHT-1的VH片段的N端。來自第二個PCR反應的PCR產物編碼VL的COOH末端、該新接頭、和VH的N末端(正好在BSTXI位點以外)。來自第二個PCR反應的PCR產物在第三個PCR反應中進一步延伸以添加VL的N末端區。這個反應是用第二個PCR產物作為3』引物，用載體中的M13R(New England Biolabs)作為5』引物。第三個PCR反應的模板是puc18/UCHT-1『克隆B』質粒。用第二個接頭替代第一個接頭並且把PCR產物連接到VH的剩餘部分，第三個反應的PCR產物用BamHI(發生在VL和載體的連接部位)和BstXI(發生在VH中)切割。也用BamHI和BstXI切割puc18/UCHT-1『克隆B』質粒；相應區域用此新產物替代。
在實施例1中使用的引物和寡聚物是核苷酸序列SEQ ID NO11，SEQID NO12，SEQ ID NO14(編碼寡聚物用於克隆)，SEQ ID NO15(接頭的編碼寡聚物)，SEQ ID NO16(接頭的相應非編碼寡聚物)，SEQ ID NO17(VL的5』末端第102-124位核苷酸)，SEQ ID NO18(在nt#293具有正確T的3』引物)，SEQ ID NO19(在nt#293具有正確T的5』引物)，SEQ ID NO20(非編碼引物)，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22的那些引物和寡聚物。
(b)PE38的克隆PE38的克隆描述於Benhar等[Bioconjugate Chem.5No.4(1994)]和US5,981,726及US5,990,296描述，它們納入本文作為參考。
(c)免疫毒素融合物的製備將新的sc Fv克隆到pET15b大腸桿菌表達載體中(Novagen)。首先用PCR將一些位點加到scFv上使此片段與pET15b克隆載體和來自包含假單胞菌外毒素的質粒pRB391(I.Psatan惠贈)的HindIII位點相匹配。(或者，編碼PE38片段的DNA序列可以用標準的PCR方法和適當的寡聚物引物從以ATCC 67208保藏在ATCC的pJH8質粒中重建。在這種方法中，pJH8質粒需要通過PCR誘變以添加HindIII位點和存在質粒pRB391中的連接序列，Benhar等1994(同上)對此有描述。另外，將Ib域內部的16個胺基酸(天然PE的第365-380位)移動到PE40片段可以通過PCR完成，產生與pRB391的PE38片段功能相同的質粒。通過DNA序列分析可以確定產生的質粒是在相同的翻譯框中。)添加NcoI限制位點編碼的氨基末端甲硫氨酸和丙氨酸殘基，以促進從該質粒的表達。
產物的胺基酸序列(包含N端的Met-ALa)在SEQ ID NO2中給出，相應的核苷酸序列在SEQ ID NO1給出。
在SEQ ID NO2中，VL包含第3-111位殘基，肽接頭佔據第112-127位殘基，VH包含第128-249位殘基，連接物位於第250-254位殘基，而截短的PE包含第255-601位殘基。氨基末端殘基甲硫氨酸和丙氨酸由NcoI限制位點(DNA序列是從第1個核苷酸到第6個核苷酸)編碼，添加後促進從大腸桿菌質粒pET 15b的表達。在EcoRI位點(DNA序列是從第1901-1906位核苷酸)和BfIII/BamHI位點(DNA序列是從第1939-1944位核苷酸)之間3』非編碼DNA是從中間物的克隆載體(pLitmus 38，NewEngland Biolabs)的多接頭遺留的序列。在DNA序列中從核苷酸751到核苷酸756有一個HindIII限制位點。
已發現scFv(UCHT-1)-PE38在大腸桿菌株BLR(DE3)中的表達產生高均質的產物(即95％的純度或更高)，該產物包含丙氨酸引導的多肽並且有8EQ ID NO2的第2-601位殘基。
(a)scFv(UCHT-1)-PE38的發酵、重新摺疊和純化重組scFv(UCHT-1)-PE38的製備方法是在50L的規模上建立的。用PET15b轉化至大腸桿菌BLR(DE3)(Novagen，Inc.)中。利用採取自我調節、pH固定的甘油補料策略的補料分批系統。補料在起始量的碳源消耗後開始，甘油自動限量加入，由pH控制。此方法避免了甘油過多和碳源完全消耗的不利影響。
最佳培養基包含6g/1/KH2PO4，0.6g/1KCl，0.2g/1MgSO4·7H2O，24.0g/1 N-Z-胺A，72g/l酵母提取物，100mg/l檸檬酸Fe(III)-銨，12mg/lMnSO4·H2O和10g/l甘油。為達到最佳的表達水平，需要在500D550條件下進行乳糖脈衝誘導。用此方法，24小時後可從在如下條件下進行的發酵實驗中收穫包含1kg包含體的4.3kg溼重細胞塊體積50L；混合200-250rpm；通氣/壓力1vvm/1bar；pO2控制手動調節；pH控制6.7＜x＜7.1；鹼2N NaOH；溫度37℃；接種物在LB中生長到OD550＝1.8的預培養物1.0L；誘導50g/lD-乳糖，OD550＝52；收穫在誘導後11小時。
用過量的D-乳糖在50的OD550誘導後表達水平達到總細胞蛋白的25％，這可用SDS-PAGE凝膠的光密度測定法檢測。用這種方法，每升發酵肉湯可檢測到86g溼細胞塊(wcp)和20g包含體(IBs)的產量。通過SDS-PAGE和scFv(UCHT-1)-PE38的光密度定量法測定到1.4g/l的產物濃度。
然後提取scFv(UCHT-1)-PE38融合蛋白並且根據Buchner等(同上)的一般方法重新摺疊，作如下改動(1)將含有以包含體形式存在的誘導scFv(UCHT-1)-PE38的冷凍細菌塊(65g)在室溫融化，繼而轉移到250ml的瓶中。將180ml TES(50mMTris-HCl，pH7.4，20mM EDTA和100mM NaCl的水溶液)加入瓶中，用Polytron組織粉碎機將細菌塊徹底懸浮。把懸浮細胞分成幾部分(30ml)，分別分裝到清潔的250ml瓶中，每瓶用TES稀釋到180ml。每瓶加入8ml溶菌酶溶液(在TES中，8mg/ml)，將細菌塊重新懸浮，懸浮物在室溫下孵育1小時。
(2)將20ml 25％的Triton-X100加到每個瓶中，然後將此混合物充分搖勻。此混合物在室溫下孵育30分鐘。然後，再將細胞裂解物用GSA轉子13,000rpm離心50分鐘。
(3)將細菌塊重新懸浮在180ml TE中(50mM Tris-HCl，pH7.4，和20mM EDTA)。用Polytron組織粉碎機勻漿2分鐘。加入20ml 25％Triton-X100到每個瓶中，然後將此混合物充分搖勻。然後把混合物以13,000rpm離心10分鐘。
(4)將在步驟(b)中描述的去汙劑(Triton-x100)洗滌步驟重複3次，以產生相對純淨的包含體。將包含體重新懸浮在180ml的TE中，然後以13,000rpm離心10分鐘。
(5)將在步驟(3)中描述的漂洗步驟重複3次。將包含體合併，在-70℃冰凍成塊。
(6)將42ml含6M鹽酸胍(MW＝95.53)、0.1M Tris-Cl，pH8.0和2mM EDTA的溶解緩衝液加入到合併的包含體中。用移液器將包含體懸浮。然後將此懸浮物轉移到兩個50ml離心管中。該內容物室溫孵育過夜，再離心。
(7)將多批100mg變性的包含體蛋白進行還原和復性。加入DTE至0.3M，並將混合物在室溫孵育2小時，之後將此樣品(100mg變性的包含體蛋白)迅速加至100體積的重摺疊緩衝液中。重摺疊緩衝液按如下製備配製0.1M Tris，pH8.0，0.5M L-精氨酸-HCl(FW 210.7g)，和2mMEDTA，用10N NaOH將pH調整到9.5，並且平衡到8-10℃，之後加入氧化的穀胱甘肽(GSSG，MW612.6g)到8mM。使此樣品在無攪動的情況下10℃重新摺疊30-40個小時。將樣品biocentrator上濃縮，並透析至20mMTris-HCl，pH7.4，1mM EDTA和100mM尿素。
(8)將重新摺疊後的免疫毒素通過相繼的2次陰離子交換層析純化，第一次用Fast-Flow Q(Pharmacia)進行，採用鹽分級梯度洗脫，第二次用Q5柱(BioRad)進行，之後是鹽梯度洗脫。以下緩衝液在柱層析中用於分級和線性梯度洗脫。
平衡20mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA衝洗20mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA，0.08M NaCl洗脫20mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA，0.28M NaCl
然後將洗脫峰用平衡緩衝液稀釋5倍，將其在隨後的純化步驟中加樣到Q5柱中。
從第二個陰離子交換柱回收單個峰。通過SDS-PAGE後預期位置上的遷移(64.5kD)和在Western印跡上可與兔抗PE38多克隆抗體進行交叉反應證明此峰與scFv(UCHT-1)-PE38相關(純度大於95％)。
採用上面提到的DTE和GSSG濃度，用上述方法收穫的正確摺疊的scFv(UCHT-1)-PE38的產量可達到50mg/ml。
16批物質都進行重新摺疊，所生成的物質用MTS檢測後發現IC50值非常類似。
前11批產生的蛋白質在UCHT-1的輕鏈可變區第三個構架區的第63位殘基從絲氨酸變成了精氨酸。基於體外實驗的結果，發現此突變對其體外的特異性細胞毒影響極小或無影響。
重新摺疊的5批蛋白(即第12，13，14，15，16批)中，點突變被修正了。
由於在MTS實驗中的高重複性，將第12和13批，第14、15和16批分別合併在一起。用MTS實驗檢測合併批次的效力，然後再將合併批次本身合併在一起形成「合併的第12-16批」，用於在本發明中報告的大多數體外和體內研究。合併的第10A-12A批也包含已修正的物質，同樣將其收集並檢測。
通過非變性PAGE的分析發現，純化的scFv(UCHT-1)-PE38在溶液中以單體形式存在。另外，用大小排阻柱層析(Sephacryl S200)或動態光散射(dynamic light scattering)實驗未發現聚集的物質。基本上所有蛋白都在牛血清白蛋白(66kD)附近遷移。
根據例如以下描述的方法以及臨床中的方法，可說明本發明的重組免疫毒素多肽在上文描述的如下方面的用途治療和預防器官移植排斥和移植物抗宿主疾病，誘導免疫耐受，以及治療和預防自身免疫病，AIDS和其它T細胞介導的免疫疾病，和T細胞白血病或淋巴瘤。
免疫毒素的生物學活性(1)scFv(UCHT-1)-PE38的MTS檢測將免疫毒素加入到細胞後第3天用MTS檢測，顯示針對表達CD3+的人Jurkat T細胞系的特異毒性作用。
在MTS檢測中，細胞的活性通過加入MTS，即(3(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲基苯基)-2H-四唑翁，內鹽)進行檢測，MTS在電子偶聯劑吩嗪硫酸二甲酯存在的情況下被活細胞代謝轉變成水溶性的甲替衍生物。該甲替衍生物的490nm吸光度與活細胞的數量成正比。將加入檢測化合物時的活細胞數與加入化合物後72小時的活細胞數相比較。非特異性毒性的陰性對照是人CD3-Ramos B細胞系。scFv(UCHT-1)-PE38免疫毒素是非常有效的(≈10pM)，這是由MTS檢測中CD3+細胞的殺傷作用測定。在高濃度的情況下，所述蛋白可以把活細胞數降到開始時的細胞數以下，所以是作為細胞毒性製劑起作用的。
(2)scFv的熱穩定性scFv(UCHT-1)-PE38的熱穩定性是用MTS檢測法測定的。樣品在PBS中以100μg/ml的濃度在4℃、25℃、和37℃孵育。此物質在4℃和25℃時一個月是完全穩定的。在37℃，在第21或28天IC50有輕度的增加。
(3)scFv(UCHT-1)-PE38對蛋白合成抑制的實驗將細胞在有或無免疫毒素存在時孵育過夜。第二天早晨，將細胞與3H-亮氨酸孵育3小時。培養皿冰凍在-80℃以裂解細胞，然後用細胞收集器和充分的洗滌將裂解物收集在玻璃濾器fibermat中。用Wallac Betaplate讀數器測定摻入蛋白質中的量。典型地，在無免疫毒素存在的情況下，3H-亮氨酸的摻入是3,000-4,000cpm；細胞處理前即刻加入的標記本底是400-700cpm。在一個培養皿中，三個重複孔的標準差通常小於10％，每培養皿之間平均摻入的偏差小於10％。
Jurkat(CD3+)和Ramos(CD)細胞中蛋白合成的抑制在這個實驗中scFv(UCHT-1)-PE38的IC50是6.7±1.9ng/ml或104±29pM。
甚至在最高的檢測濃度時(100μg/ml)也存在殺傷的選擇性。在較高的濃度時，細胞數量降低到起始細胞數量以下。對CD3+Jurkat細胞系的毒性的選擇性在這些實驗中，即使用高4或5個logs的濃度的scFv(UCHT-1)-PE38也未獲得殺傷CD3-Ramos細胞的IC50。
(4)人血混合淋巴細胞反應(MLR)scFv(UCHT-1)-PE38免疫毒素阻止同種異體反應性人外周血單核細胞(PBMC)增殖的能力可用一種雙向混合淋巴細胞反應(MLR)檢測。MLR是同種異體刺激的量度。在MLR測定中幹擾細胞增殖是對免疫抑制劑作用於完整人血細胞的效力的測定。
人MLR是根據標準方法進行的。在Ficoll上從淡黃色的覆蓋物中分離來自不同供體(A、B、C)的攜帶未知HLA型的PBMC(Kantonspital/Basel/Blutspendezentrum)。將細胞以2×107細胞/ml的濃度(90％FCS，10％DMSO)放入冷凍管(Nunc)保存在液氮中待用。開始進行MLS時，將細胞融化，洗滌，計數。
在兩個實驗的每一個中(「A」和「B」)，通過以1∶1細胞數的比例混合來自2個不同供體的細胞建立3個雙向反應(AB，AC，BC)。混合的細胞(共4×105細胞/0.2ml)在37℃，5％CO2條件下共培養6天，作三次重複。用環孢素A作陽性對照。在遞增濃度的免疫毒素(合併的第12-16批)或對照存在時進行培養。在最後16小時的培養中通過3H-TdR的攝取(1mCi/0.2ml)測定增殖水平。
在上述二個實驗的體外混合淋巴細胞反應(MLR)中，scFv(UCHT-1)-PE38在阻止人血PBMC增殖方面的效力測定為0.11±0.053ng/ml和0.53±0.002ng/ml，導致總體IC50為0.072±0.053ng/ml(1.12pM)。這個資料說明scFv(UCHT-1)-PE38在人MLR中能有效抑制同種異體特異性T細胞的活化。
(5)scFv(UCHT-1)-PE38對人CD3ε轉基因小鼠脾細胞伴刀豆球蛋白A刺激的增殖作用的抑制。
人CD3ε轉基因小鼠人CD3ε轉基因小鼠株來自C.Terhorst(BethIsrael Deaconess醫學中心)。表達高和低拷貝數人CD3ε的轉基因小鼠脾細胞的表型由Wang等描述[PNAS919402(1994)]。表達高拷貝數人CD3ε的轉基因小鼠甚至在雜合的情況下也沒有T和NK細胞，所以該轉基因小鼠具有敲除表型。據報導tgε600株存在約3個拷貝整合在染色體的未知位置上的人CD3ε轉基因。純合的低拷貝數的轉基因小鼠如tgε600小鼠僅表達有限數量的T細胞。相反，當tgε600為雜合時，小鼠有接近正常數量的T細胞，這些T細胞中大部分既表達人CD3ε又表達小鼠CD3ε。
這些小鼠的遺傳背景是混合的；由於轉基因是通過CBA和C57BL/6雜交的F2胚胎的原核注射導入的，所以，其同胞在遺傳上是不同的。將人CD3ε純合的轉基因小鼠和C57BL/6野生型小鼠交配產生雜合小鼠。將這些動物保持作為轉基因的純合子，在與C57BL/6回交後用作雜合子。tgε600插入片段雜合的動物用於檢測體外對scFv(UCHT-1)-PE38的敏感性和靜脈內或腹膜內施用scFv(UCHT-1)-PE38後引起的體內削減作用。合併的第12-16批scFv(UCHT-1)-PE38用於這些實驗。對於體外實驗，使用CBA×C57BL/6雜交的F1代作為對照動物。在體內實驗中，未經處理的雜合tgε600小鼠作為對照組。
scFv(UCHT-1)-PE38對表達人CD3ε的轉基因小鼠脾細胞體外增殖的抑制能力可以通過伴刀豆球蛋白A誘導的增殖和單向混合淋巴細胞反應來測定。
將脾臟粉碎，通過尼龍濾膜(0.45μm)濾過，然後用1ml注射器輕輕地吹打形成單細胞懸液。紅細胞用ACK緩衝液(0.15氯化銨，1mM碳酸鉀，0.1mM EDTA)裂解，然後將此懸液在補充有5％FBS的RPMI-1640溶液中洗滌3次。每孔加入5μg/ml伴刀豆球蛋白A。將培養皿在37℃，5％CO2條件下孵育3天。在第三天，每孔加入1μCi的3H-胸苷。24小時後將各孔收集至玻璃纖維濾器中，用Wallacβ培養皿讀數器檢測3H-胸苷的摻入量。
加入scFv(UCHT-1)-PE38可阻斷Con A(5μg/ml)誘導的人CD3ε轉基因(「HuCD3 εTg」)脾細胞的增殖，但不能阻斷非轉基因的B6CBAF1(「NonTg」)脾細胞的增殖。對轉基因小鼠細胞的劑量依賴性的抑制作用可以從計算得出的0.6ng/ml的IC50觀察到。這與抗Jurkat細胞的細胞毒性(0.63±0.15ng/ml)非常一致。在高濃度時，可以觀察到＞100％的抑制作用(即增殖比無Con A存在時觀察到的少)，提示所有的ConA-反應性的脾細胞對scFv(UCHT-1)-PE38是敏感的。
(6)在單向MLR中scFv(UCHT-1)-PE38對人CD3ε轉基因小鼠脾細胞增殖的抑制作用。
scFv(UCHT-1)-PE38對人CD3ε脾細胞中的T細胞體外增殖的抑制能力可以通過單向混合淋巴細胞反應檢測。在單向MLR中，增殖是由於同種異體反應性huCD3ε轉基因小鼠脾細胞對同種異體MHC II的直接識別所引起的。不是所有的T細胞都是同種異體反應性的，結果只有較少百分比的反應性轉基因脾細胞，這與檢測中信號降低和實驗之間的偏差增加相一致。
根據上述第5部分的方法製備huCD3ε轉基因小鼠脾細胞(「CD3Tg細胞」)。非轉基因B6CBAF1小鼠的脾細胞(「NonTg」)用作對照。
根據上述第5部分的方法製備Balb/C脾細胞的單細胞懸液，然後用絲裂黴素C(30μg/ml)在37℃處理20分鐘，然後加入MLR培養基洗滌。
將絲裂黴素C處理的BALB/c刺激細胞以4×105細胞/ml加入平底Corning 96孔培養板中。將轉基因小鼠脾細胞以2×105細胞/ml加入各孔中，然後將培養板在37℃，5％CO2中孵育3天。在第三天，加入1μCi/孔3H-胸苷。16小時後，將各孔收集在玻璃纖維濾器上，用Wallacβ培養皿讀數器檢測3H-胸苷的摻入量。
scFv(UCHT-1)-PE38免疫毒素抑制包含huCD3εTg脾細胞的培養物中的同種異體MLR反應，但不抑制非轉基因對照脾細胞的MLR反應。觀察到轉基因小鼠細胞的劑量依賴性抑制，計算的IC50為0.6ng/ml。在高濃度時，可以觀察到＞100％的抑制作用，提示所有同種異體反應性huCD3εT細胞都對scFv(UCHT-1)-PE38敏感。在非轉基因B6CBAF1脾細胞和絲裂黴素C處理的Balb/C(APC)脾細胞之間的MLR反應沒有被scFv(UCHT-1)-PE38抑制。
所以，發現免疫毒素可以以劑量依賴性方式抑制由完全同種異體的絲裂黴素C處理BALB/C脾細胞(APC)刺激產生的huCD3ε轉基因脾細胞(T細胞)的MLR反應。在此實驗中上述免疫毒素的有效性是～0.9ng/ml，即～14pM。
(7)Jurkat空纖維植入模型將8條空纖維植入單一裸鼠體內4條腹膜內放置，另4條放置在皮下。在每一植入位置的4條空纖維中2條包含CD3+Jurkat細胞；每一植入位置的4條空纖維中1條包含LS174T結腸癌細胞；1條包含MDA-MB-435S乳腺癌細胞。6隻動物構成一組。
值得一提的是用於這些研究的材料都包含在Seq.ID NO2第195位核苷酸T變成了G的點突變，這一突變使得SEQ ID NO2第65位殘基(即在可變的輕鏈的第三個構架區中)從絲氨酸(UCHT-1)變成了精氨酸(突變體)。該材料的效力在3天的MTS實驗中等同於沒有突變的scFv(UCHT-1)-PE38的效力。
隨著第3-6天腹膜內以1μg/只小鼠、一天二次，或5μg/只小鼠、一天二次的劑量施用(每隻小鼠施用存在於鹽水載體中的150μl)scFv(UCHT-1)-PE38，監測植入到裸鼠腹膜腔中的空纖維中Jurkat細胞的生長。在第10天取回纖維。在腹膜內或靜脈內施用免疫毒素後，顯示出免疫毒素在殺傷植入裸鼠體內的人T細胞系方面有系統的體內效果，並且可觀察到的生長抑制是CD3+T細胞特異的。
在此模型中也發現，用1μg/只小鼠的劑量腹膜內(一天二次，共4天)或用3μg/只小鼠的劑量靜脈內(一天二次，共4天)給藥，腹膜內植入的空纖維中Jurkat細胞的生長受到大約75％的抑制。
(8)在人CD3ε轉基因小鼠中的T細胞削減用4μg/只小鼠的免疫毒素(合併的第12-16批)處理上述tgε600/C57BL6雜合小鼠，一天二次，共4天。在最後處理後第一天，將淋巴結(LN)和脾臟取出，從單個小鼠中製備單細胞懸液。
CD3陽性細胞的百分比可通過用FITC-抗huCD3ε抗體(以檢測人CD3ε的表達)和與藻紅蛋白(PE)連接的抗mCD3ε抗體(500A2-PE)(以檢測小鼠CD3的表達)對單細胞懸液進行雙色FACS分析來評價。每個器官中T細胞數量可通過從該器官獲得的總細胞數乘以CD3陽性細胞的百分比確定。
由同型匹配的對照抗體所引起的非特異細胞染色是低的。在經處理的和未經處理的小鼠之間未見非特異染色不同。
在未經處理的轉基因動物脾臟全部細胞中～20％是mCD3和huCD3雙陽性的。一小部分細胞表達小鼠CD3，但不表達人CD3(3.5％)。
用scFv(UCHT-1)-PE38進行的系統治療可將表達mCD3和huCD3兩者的細胞百分比從約20％降低至約2％。
處理和未處理轉基因小鼠的淋巴結(LN)FACS分析結果與轉基因小鼠的脾細胞FACS分析結果相似。即，由同型匹配的對照抗體所引起的非特異細胞染色是低的。在未處理的轉基因小鼠中，淋巴結總細胞中～53％是mCD3和huCD3雙陽性的。一小部分細胞表達小鼠CD3但不表達人CD3(2.8％)。靜脈內施用scFv(UCHT-1)-PE38(4μg/動物)，一天二次，共4天，之後，表達mCD3和huCD3兩者的雙陽性LN細胞的百分比從～53％降低到12％。
對於脾臟和淋巴結，不同給藥方案對小鼠和人CD3雙陽性細胞的百分比和數量的結果是相似的。當經靜脈內或者腹膜內以一天二次的方式給藥時，scFv(UCHT-1)-PE38可引起雙陽性T細胞統計學上顯著的削減。另外，在系統給藥後在兩種組織中都可觀察到劑量依賴性的T細胞削減。
總結所產生的數據，4μg/只小鼠靜脈內給藥或5μg/只小鼠腹膜內給藥，一天二次，持續4天，可導致所獲得的脾huCD3 T細胞數量86％和95％的削減。當考慮huCD3陽性細胞百分比時，按3μg/只小鼠，靜脈內，一天二次，持續4天和1μg/只小鼠靜脈內，一天二次的方式給藥，可觀察到脾細胞數量統計學上顯著的降低。所以，導致脾削減的最低有效劑量顯示為1μg，一天二次，持續4天。
對於淋巴結，4μg/只小鼠靜脈內給藥或5μg/只小鼠腹膜內給藥，一天二次，持續4天，可導致所獲得的脾huCD3 T細胞數量97％和92％削減。當考慮淋巴結中huCD3陽性細胞百分比時，用3μg/只小鼠靜脈內給藥，一天二次，持續4天，和1μg/只小鼠靜脈內給藥，一天二次，持續4天的方式處理的小鼠，可觀察到淋巴結細胞數量統計學上顯著的降低。所以，導致淋巴結削減的最低有效劑量顯示為1μg，一天二次，持續4天。
序列表110Novartis AG120抗CD3免疫毒素及其治療用途130免疫毒素14014116022170PatentIn Ver.2.121012111803212DNA213人工序列220221CDS222(1)..(1803)220223人工序列的描述scFv(UCHT-1)-PE284001atg gcg gac atc cag atg acc cag acc acc tcc tcc ctg tct gcc tct 48Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser1 5 10 15ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att aga 96Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg20 25 30aat tat tta aac tgg tat caa cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc 144Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu35 40 45ctg atc tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca aag ttc 192Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe50 55 60agt ggc agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc aac ctg 240Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu65 70 75 80gag caa gag gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt aat acg ctt 288Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu85 90 95ccg tgg acg ttc gct gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg gct gga 336Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Gly100 105 110ggc ggt agt ggc ggt gga tcg ggt gga ggc agc ggt ggc gga tct gag 384Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu115 120 125gtg cag ctc cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct gga gct tca 432Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser130 135 140atg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac acc 480Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr145 150 155 160atg aac tgg gtg aag cag agt cat gga aag aac ctt gag tgg atg gga 528Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly165 170 175ctt att aat cct tac aaa ggt gtt agt acc tac aac cag aag ttc aag 576Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys180 185 190gac aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc agc aca gcc tac atg 624Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met195 200 205gaa ctc ctc agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt gca 672Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala210 215 220aga tcg ggg tac tac ggt gat agt gac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc 720Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly225 230 235 240gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca aaa gct tcc gga ggt ccc gag 768Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Ala Ser Gly Gly Pro Glu245 250 255ggc ggc agc ctg gcc gcg ctg acc gcg cac cag gct tgc cac ctg ccg 816Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro260 265 270ctg gag act ttc acc cgt cat cgc cag ccg cgc ggc tgg gaa caa ctg 864Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu275 280 285gag cag tgc ggc tat ccg gtg cag cgg ctg gtc gcc ctc tac ctg gcg 912Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala290 295 300gcg cgg ctg tcg tgg aac cag gtc gac cag gtg atc cgc aac gcc ctg 960Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val ASp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu305 310 315 320gcc agc ccc ggc agc ggc ggc gac ctg ggc gaa gcg atc cgc gag cag 1008Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln
325 330 335ccg gag cag gcc cgt ctg gcc ctg acc ctg gcc gcc gcc gag agc gag 1056Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu340 345 350cgc ttc gtc cgg cag ggc acc ggc aac gac gag gcc ggc gcg gcc aac 1104Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn355 360 365ggc ccg gcg gac agc ggc gac gcc ctg ctg gag cgc aac tat ccc act 1152Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr370 375 380ggc gcg gag ttc ctc ggc gac ggc ggc gac gtc agc ttc agc acc cgc 1200Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg385 390 395 400ggc acg cag aac tgg acg gtg gag cgg ctg ctc cag gcg cac cgc caa 1248Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln405 410 415ctg gag gag cgc ggc tat gtg ttc gtc ggc tac cac ggc acc ttc ctc 1296Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu420 425 430gaa gcg gcg caa agc atc gtc ttc ggc ggg gtg cgc gcg cgc agc cag 1344Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser 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Pro545 550 555 560acc gac ccg cgc aac gtc ggc ggc gac ctc gac ccg tcc agc atc ccc 1728Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro565 570 575gac aag gaa cag gcg atc agc gcc ctg ccg gac tac gcc agc cag ccc 1776Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro580 585 590ggc aaa ccg ccg cgc gag gac ctg aag 1803Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys595 6002102211601212PRT213人工序列223人工序列的描述scFv(UCHT-1)-PE284002Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser1 5 10 15Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg20 25 30Ash Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe50 55 60Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu65 70 75 80Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu85 90 95Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Gly100 105 110Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu115 120 125Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser130 135 140Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr145 150 155 160Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly165 170 175Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys180 185 190Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met195 200 205Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala210 215 220Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly225 230 235 240Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Ala Ser Gly Gly Pro Glu245 250 255Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro260 265 270Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu275 280 285Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala290 295 300Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu305 310 315 320Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln325 330 335Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu340 345 350Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn355 360 365Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Ash Tyr Pro Thr370 375 380Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg385 390 395 400Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln405 410 415Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu420 425 430Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln435 440 445Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala450 455 460Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg465 470 475 480Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu485 490 495Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala500 505 510Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp515 520 525Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu530 535 540Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val 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565 570 575Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro580 585 590Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys595 6002103211613212PRT213銅綠假單胞菌4003Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val1 5 10 15Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro20 25 30Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val35 40 45Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu50 55 60Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu65 70 75 80Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser85 90 95Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn100 105 110Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His115 120 125Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys130 135 140Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu145 150 155 160Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met165 170 175Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser180 185 190Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr195 200 205Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile210 215 220Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys225 230 235 240Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu245 250 255Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe260 265 270Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly275 280 285Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser290 295 300Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly305 310 315 320Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala325 330 335Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg340 345 350Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val355 360 365Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp370 375 380Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe385 390 395 400Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn405 410 415Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg420 425 430Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln435 440 445Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala450 455 460Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly465 470 475 480Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly485 490 495Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr500 505 510Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu515 520 525Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly530 535 540Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu545 550 555 560Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg565 570 575Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln580 585 590Ala Ile Ser Ala Leu Pro ASp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro595 600 605Arg Glu Asp Leu Lys610210421125212PRT213銅綠假單胞菌4004Met His Leu Ile Pro His Trp Ile Pro Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu1 5 10 15Leu Ala Gly Gly Ser Ser Ala Ser Ala20 25210521116212PRT213人工序列220223人工序列描述scFV(UCHT-1)-PE38的接頭4005Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser1 5 10 1521062115212PRT213銅綠假單胞菌4006Arg Glu Asp Leu Lys1 521072114212PRT213銅綠假單胞菌4007Arg Glu Asp Leu121082114212PRT213銅綠假單胞菌4008Lys Asp Glu Leu121092115212PRT213人工序列220223人工序列描述scFV(UCHT-1)-PE38的連接肽4009Lys Ala Ser Gly Gly1 5210102115212PRT213人工序列220223人工序列描述雙倍體接頭40010Gly Gly Gly Gly Ser152101121132212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40011gcggatccga catccagatg acccagacca CC 322101221132212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40012cctctagaag cccgtttgat ttccagcttg gt 322101321135212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40013ccaagctttc atgaggagac ggtgaccgtg gtccc 352101421129212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40014ccgtcgacga ggtgcagctc cagcagtct 292101521142212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40015ctagaggagg tagtggaggc tcaggaggtt ctggaggtag tg 422101621142212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40016tcgacactac ctccagaacc tcctgagcct ccactacctc ct 422101721123212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40017ctggtatcaa cagaaaccag atc232101821127212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40018ggtgcctcca gcgaacgtcc acggaag272101921127212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40019cttccgtgga cgttcgctgg aggcacc272102021121212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40020ctctgcttca cccagttcat g 212102121166212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40021gccaccgctg cctccacctg atccaccgcc actaccgcct ccagcccgtt tgatttccag 60cttggt662102221157212DNA213人工序列220223人工序列描述引物40022tcaggtccag actgctggag ctgcacctca gatccgccac cgctgcctcc acctgat 5權利要求
1.包含CD3結合域和假單胞菌外毒素A成分的分離的重組免疫毒素及其可藥用鹽。
2.根據權利要求1的免疫毒素及其可藥用鹽，其中CD3結合域是鼠抗人CD3單克隆抗體UCHT-1的單鏈(「sc」)Fv片段，且假單胞菌外毒素A成分是綠膿假單胞菌外毒素A的截短的片段。
3.具有SEQ ID NO2的第1-601位或第2-601位或第3-601位殘基的重組免疫毒素多肽及其可藥用鹽和同系物。
4.多核苷酸或生理功能等同的多肽，其是製備根據權利要求1的免疫毒素的中間物。
5.預防或治療T細胞介導的免疫系統疾病或病症的方法，包括給有此需要的患者施用T細胞削減有效量的根據權利要求1的免疫毒素或其可藥用鹽。
6.預防或治療T細胞介導的免疫系統疾病或病症的方法，包括在細胞、組織、或器官移植或導入到患者體內之前用根據權利要求1的免疫毒素或其可藥用鹽接觸細胞、組織、或器官。
7.調節將用供體的細胞、或組織或器官移植的患者的方法，此方法包括(a)削減患者體內攜帶CD3的細胞群；(b)提供如下接種物，該接種物包含供體的經T細胞削減有效量的根據權利要求1的免疫毒素或其可藥用鹽處理的分離的骨髓和/或幹細胞富集的外周血細胞；和(c)將該接種物導入患者體內。
8.在待進行骨髓移植的患者中預防和/或治療移植排斥、宿主抗移植物疾病和/或移植物抗宿主疾病的方法，包括(a)降低患者體內攜帶CD3的活細胞水平；(b)提供如下接種物，該接種物包含適當供體的經T細胞削減有效量的根據權利要求1的免疫毒素或其可藥用鹽處理的造血細胞；和(c)將該接種物導入患者體內，並且，此後任選給該患者施用根據權利要求1的免疫毒素或其可藥用鹽以進一步削減供體和患者的T細胞。
9.根據權利要求5或8的方法，該方法包括把有效治療量的根據權利要求1的免疫毒素或其可藥用鹽和在治療急性或慢性移植排斥方面有效的選自如下物質的藥劑共同施用給患者環孢素A、雷帕黴素、40-0-(2-羥基)乙基雷帕黴素(RAD)、FK-506、黴酚酸、黴酚酸莫非替克(MMF)、環磷醯胺、硫唑嘌呤、來氟米特、咪唑立賓、脫氧精胍菌素化合物或其衍生物或類似物、2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1，3-二醇(FTY720)、皮質類固醇、其它免疫調節化合物；抗-LFA-1和抗-ICAM抗體，和其它阻止T細胞共刺激的抗體。
10.根據權利要求1的免疫毒素或其可藥用鹽在製備用於根據權利要求5-9之任一項的方法的藥物的用途。
11.藥用組合物，包含根據權利要求1的免疫毒素或其可藥用鹽和可藥用的稀釋劑或載體。
12.用於根據權利要求5-9之任一項的方法的藥物組合物，包含根據權利要求1的免疫毒素或其可藥用鹽和一種或多種可藥用的載體或稀釋劑。
13.根據權利要求10或11的組合物，該組合物和可有效治療急性或慢性移植排斥的藥劑聯合應用。
全文摘要
本發明描述了重組免疫毒素多肽,其包含CD3結合域和假單胞菌外毒素突變體,尤其包含作為CD3結合部分的單鏈(sc)Fv。本發明的優選種類包含scFv(UCHT－1)－PE38。本發明還公開了該免疫毒素的製備方法;作為本發明免疫毒素製備過程中的中間物的功能等同的免疫毒素,和多核苷酸和寡核苷酸中間物;用免疫毒素或其可藥用鹽預防和/或治療移植排斥,和誘導耐受,以及治療自身免疫病和其它免疫疾病的方法;和包含該免疫毒素或其可藥用鹽的藥物組合物。
文檔編號C07D498/18GK1341124SQ00804064
公開日2002年3月20日 申請日期2000年1月13日 優先權日1999年1月15日
發明者M·E·迪根, P·雷克, R·M·萊特 申請人:諾瓦提斯公司