一類苯丙素苷的醫學用途的製作方法

2023-04-22 18:59:41

專利名稱：一類苯丙素苷的醫學用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及從玄參中提取有效成分，更具體指從玄參中提取獲得的苯丙素苷及它們的抑制心肌纖維化的用途。
背景技術：
玄參是常用的傳統中藥，始載於《神農本草經》。玄參味甘，苦，鹹，氣涼，有滋陰， 降火，除煩，解毒的功能。可治熱病煩渴，發斑，骨蒸勞熱，夜寐不寧，自汗盜汗，咽喉腫痛等。 中藥品玄參主要為玄參科(Scrophularaceae)玄參屬植物玄參的根。玄參為我國特有的植物，分布在浙江，安徽，江蘇，福建，江西等地。玄參化學成分的研究始於上世紀三十年代，發現玄參含揮髮油，植物留醇，油酸， 亞麻酸，硬脂酸，糖類，生物鹼等，1967年日本學者Isao Kitagawa等首次從北玄參根的正丁醇部位分離到兩個環烯醚萜苷成分哈帕苷(harpagide)和8_甲基對香豆醯基哈帕苷 [8-(O-methyl-p-coumaroyl)harpagide]。在對正品玄參的化學成分研究中，1989年日本學者TetsuyaKajimoto從南京產的玄參根的正丁醇部位分得環烯醚萜苷哈帕苷、哈帕酯苷(harpagoside)、6_0-(2_乙醯基_3_肉桂醯基_4_對甲氧基肉桂醯基)鼠李吡喃糖基梓酉享[6-0-(2-acetyl-3-cinnamoyl-4-p-methoxycinnamoyl)rhamnopyranosylcatalpol]、 1-去羥基-3，4-二氫桃葉珊瑚苷元(l-dehydroxy-3，4-dihydroaucubigenin)；苯丙素苷 安格洛苷CfengorosideC)及一個變型的環烯醚萜化合物。1992年德國學者JingfangQian 和Huker也從南京市售品玄參中分得四個玄參已知環烯醚萜苷哈帕苷(XS-7)、哈帕酯苷(XS-6)、桃葉珊瑚苷(aucubine)、6_甲基梓醇(6-0-methyl-catapol)；苯丙素苷安格洛苷C(XS-S)，並對Kajimoto分得的變異環烯醚萜結構進行修正，定為異玄參苷元 (ningpogeninXS-19)、異玄參苷 A(ningpogosideA)禾口異玄參苷 B (ningpogosideS)。1994 年昆明植物所張雯潔等從浙江栽培玄參中分得四個已知環烯醚萜苷哈帕苷、哈帕酯苷、 6-甲基梓醇(6-0-methyl-catapol)、土可玄參苷A(scropoliosideA)；苯丙素苷安格洛苷 C和一個新化合物4-0-(對甲氧基肉桂醯基)_ α -L-吡喃鼠李糖[4-0- (p-methoxycinnamo yl)- α -L-rhamnopyranose]。從前面的化學工作中，我們看出玄參水溶性部位主要含環烯醚萜苷與苯丙素苷二類成分。玄參的藥理作用最早報導的是降壓，降血糖作用，以後又發現玄參中的活性成分有抗菌作用，抗炎作用，保肝作用，抗血小板凝集作用，抗腫瘤作用等。玄參可與其它中藥合用於治療多種疾病如1.治咽喉腫痛，可與山桅、黃芩、桔梗、荊芥等同用(玄參解毒湯)，2.用於熱病後期津枯便，常與生地、麥冬同用；若用於熱病傷陰，煩熱口渴，夜寐不安等，可與石膏、知母等同用，3.用於瘰癧結核，常與牡蠣、貝母同用，4.用於血栓閉塞性脈管炎，常與銀花、當歸、甘草等同用。中國藥典1995年版收載玄參和含玄參現代中成藥22種，其中玄參是主要組分的有玄麥柑桔顆粒、養陰清肺膏、清熱解毒口服片、清喉咽合劑、清瘟解毒丸等。含玄參的古代驗方也有很多，如玄參升麻湯(《類證活人書》)、玄參黃連大黃丸(《丹溪心法》)、玄參麥東湯(《溫病條辨》)、玄參散(《聖惠方》)、消瘰丸(《病學心悟》)等。心肌纖維化是心肌中纖維性膠原成分不成比例的增多，膠原濃度顯著升高或膠原容積分數顯著高於正常，是受損組織僵硬度的結構基礎和心功能由代償期向失代償期轉變的關鍵。心肌膠原主要包括I、II型膠原纖維。I/II型膠原比值可反映心肌纖維化的程度。引起心肌纖維化的原因有多種，如缺血性心臟病、心肌病、高血壓性、炎症性、代謝性心肌病，只要病變持久和病程慢性化，終將導致心肌纖維化。其發生機制，總體上講是心肌膠原生成與降解失衡引起膠原異常蓄積，其涉及一系列調控因素，如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)、血管活性物質(如內皮素、兒茶酚胺、NO、前列腺素、緩激肽等)、細胞因子(如轉化生長因子_β)、細胞內Ca2+、氧化應激、血流動力學等因素。其中，血管緊張素II(Ang II)研究較多，現已證實Ang II可以使心肌細胞總蛋白含量增多，蛋白合成速率升高，還能增加心肌間質細胞(主要是成纖維細胞)的基質合成和分泌，因而造成心肌肥厚以致心肌纖維化。針對心肌纖維化的形成機制，一系列治療措施應運而生，其中較為肯定的有血管緊張素轉化酶抑制劑ACEI、ATl受體阻斷劑、醛固酮拮抗劑、鈣拮抗劑等均同時具有抗膠原增殖和降壓作用，而其中降壓並非抗纖維化的機制，低於降壓劑量即可改善膠原的沉積。但由於西藥不良反應及價格昂貴而限制了臨床應用，所以在中醫藥領域尋找抗心肌纖維化的有效藥物具有非常重要的意義。

發明內容
本發明的目的是提供一類從玄參中提取獲得具有對心肌纖維化抑制作用的有效部位，本發明涉及的有效部位為玄參中提取的一類苯丙素苷以及它們的用途。本發明對玄參中提取的一類苯丙素苷有效部位進行心肌纖維化抑制作用的試驗， 通過試驗，證明玄參中一類苯丙素苷具有抑制心肌纖維化作用。本發明是這樣實施的本發明涉及的一類苯丙素苷的化學結構如下其中隊為H或木糖基& 為 H 或 CH3本發明涉及的化合物為從玄參中提取，其製備方法如下IOkg玄參的飲片(購自上海養和堂中藥飲片廠，經上海中醫藥大學李醫明教授鑑定為中藥玄參)，用50-80 %乙醇回流提取3次，每次100L，合併提取液，減壓濃縮得提取物1500g，取IOOOg經D-101大孔吸附樹脂柱層析處理，分別用30 %乙醇，60 %乙醇，80 % 乙醇洗脫，得到30%乙醇，60%乙醇，80%乙醇洗脫部分。60%乙醇洗脫部分除去乙醇得一類苯丙素苷有效部位，該有效部位再經矽膠柱層析，以乙酸乙酯-乙醇-水梯度洗脫 (9 1 0. 1至3 1 0.1)，經薄層層析檢查各洗脫部位，得到一類玄參苯丙素苷。經結構鑑定，為如上所述化學結構的苯丙素苷類成分，具體化合物鑑定數據如下安格洛苷CO^1 =木糖基，& =甲基)無定型粉末。薄層板上遇濃硫酸香蘭素溶液加熱顯棕黃色。mp = U8 131°C。[α ]D2CI-30. 73o(Me0H ;c 0.397)。IH NMR(CD30D) δ 6. 44 (1H, brs, H_2)，6. 79 (1H, d, J = 7. 9Hz, H_5)，6. 65 (1H, brd, J = 7. 9Hz, H_6) ,3. 90, 3. 62(2X1H, m, H- α ), 2. 73 (2H, t, J = 7. 3Hz, H- β ), 7. 30 (1H, brs, H-2' ) ,6. 81 (1H, d, J = 8. 2Hz, H-5' ),1. 10 (1H, brd, J = 8. 2Hz, H-6' )，6. 43，7. 55(2X1H, d, J = 15. 8Hz, H-α ' , β 『 ), 3. 72, 3. 81 (2 X 3H, s, CH30), 5. 02 (1H, brs, rha-1), 0. 97 (3H, d, J = 6. IHz, rha-6), 4. 37 (1H, d，J = 7. 9Hz, glu-1) ,4. 11 (1H, d，J = 6. 2Hz). 13C NMR(CD30D) δ :131. 04 (C-I) ,112. 37 (C-2)，146. 11 (C_3)，145. 62 (C-4) ,116. 28 (C-5) ,119. 48 (C-6)， 70. 20 (C- α ), 34. 95 (C- β ), 125. 62 (C-l 『 ), 114. 17 (C-2 『 ), 147. 89 (C-3 『)， 149. 33(C-4 『 ),115. 50 (C-5 『 ), 123. 17(C-6 『 ), 111. 20(C-α 『 ),149. 33(C-β 『)， 165. 74 (C = 0)，101. 24 (rha-1)，102. 28 (glu-1)，101. 57 (ara-1) ·安格洛苷DO^1 =木糖基, = H):無定型粉末。薄層板上遇濃硫酸香蘭素溶液加熱顯棕黃色。mp = 123-125°C。[ α ]D2CI-33. 59o (MeOH ;c0. 521)。FABMS :m/ζ 675[M+Na]+， 653[M+H]+0 IH NMR(DMS0-d6) δ 6.68(1H, brs, H-2),6. 79(1H, d, J = 7. 8Hz, H_5)，
6.62 (1H, brd, J = 7. 9Hz, H_6)，3. 90，3. 62(2X1H, m，H-α )，2. 74(2H, m，H-β )，7· 29 (1H, brs, H-2 ' ),6. 81 (1H, d, J = 8. 2Hz, H-5 ' ), 7. 09 (1H, brd, J = 8. 2Hz, H-6 ' )，6. 41，
7.53(2X1H, d, J = 15. 8Hz, H-α 『，β 『 ), 3. 72, 3. 81 (2 X 3Η, s, CH30), 5. 02 (1H, brs, rha-1)，0. 97 (3H, d，J = 6. 1Hz, rha-6)，4. 36 (1H, d, J = 7. 8Hz, glu-1)。13C NMR(DMS0_d6) δ 131. 01(C-I)，112. 30(C-2)，146. 07(C-3)，145. 50(C-4),116. 27(C-5)，119. 43 (C-6)， 70. 12 (C- α ), 34. 99 (C- β ), 125. 61 (C-l 『 ) ,114. 13 (C-2 『 ), 147. 82 (C-3 『)， 149. 34 (C-4 ' ),115. 51 (C-5 『 ), 123. 13 (C-6 ' ),111. 08 (C-α 『 ), 149. 34 (C-β 『)， 165. 76 (C = 0)，101. 24 (rha-1)，102. 30 (glu-1)。麥角甾苷(R1 = H，& =甲基)淡黃色無定型粉末，易氧化變黑。薄層板上遇濃硫酸香蘭素溶液加熱顯棕黃色。mp = 123-125°C。[ α ]D2°-37. 33o (MeOH ;c 0.662)。IH NMR(CD30D) δ 6. 62 (1Η, brs, H-2), 6. 63(lH，d，J = 7. 9Ηζ，Η_5)，6· 49 (1Η, brd, J = 7. 9Ηζ, Η-6) ,3. 88, 3. 62 (2X 1Η, m，H- α )，2· 68 (2Η, m, Η-β ) ,7. 02 (1Η, brs, Η_2 ' )，6. 68 (1Η, d, J = 8. 2Ηζ, Η-5 ' ) ,6. 98 (1Η, brd, J = 8. 2Ηζ, Η-6 ' ),6. 20,7. 45(2Χ1Η, d, J = 15. 8Ηζ，H- α '，β ' )，5· 02 (1Η, brs, rha-Ι)，0. 95 (3Η, d, J = 6. IHz, rha-6)，4. 35 (1Η, d, J = 7· 9Hz，glu-1)。13C NMR(CD30D) δ 131.01 (C-l),112. 30(C-2),146. 07(C-3), 145. 50 (C-4)，116. 27 (C-5)，119. 43 (C-6)，70. 12 (C- α )，34. 99 (C- β )，125. 61 (C-l 『)， 114. 13 (C-2 『 ),147. 82 (C-3 『 ), 149. 34 (C-4 ' ),115. 51 (C-5 『 ), 123. 13 (C-6 『)， 111. 08 (C-α 『 )，149. 34 (C- β 『 )，165. 76 (C = 0)，101. 24 (rha-Ι)，102. 30 (glu-1)。脫咖啡醯基麥角留苷淡黃色無定型粉末。薄層板上遇濃硫酸香蘭素溶液加熱顯棕黃色。mp = 126-128 °C。[a ]D2CI-24. 16o (MeOH ；c 0. 327) · FABMSm/z :485 [M+Na]+，463[M+H]+。IH NMR(CD30D) δ 6. 51 (1Η, d, J = 2.1Hz，H_2)，6. 49 (1H，d, J = 8.0Hz， H-5) ,6. 38 (1H, dd, J = 8. 0,2. IHz, H-6), 3. 51,3. 78(2X1H, m, H-α ), 2. 61 (2H, t, J = 7. 6Hz, H- β ), 4. 12 (1H, d, J = 7. 8Hz, glu-1) ,4. 98 (1H, d, J = 1. 4Hz, rha-1)，1. 08 (3H, d, J = 6. 3Hz，rha-6).。13C NMR(CD30D) δ 131.84 (C-I),117. 41(C-2),146. 43(C-3), 144. 97(C-4)，116. 61 (C_5)，121. 55 (C-6), 72. 42 (C-α )，36. 87 (C-β )，103. 08 (rha-1)， 104. 54(glu-1)。本發明所指玄參中一類苯丙素苷主要含安格洛苷C(70% 80%)，其次為安格洛苷D (5% 15% )，麥角甾苷(10% 20% )，脫咖啡醯基麥角甾苷(5% 10% )四種苯丙素苷成分，以下簡稱苯丙素苷。藥理試驗1.實驗目的評價玄參中一類苯丙素苷對大鼠心肌纖維化的抑制作用。2.實驗動物Waster大鼠由必凱實驗動物有限公司提供，實驗前經第二軍醫大學動物所1周適應性飼養。3.實驗方法3. 1大鼠心肌纖維化模型的製備大鼠背部皮下注射異丙腎上腺素，首次劑量為20mg/kg，第2天劑量為10mg/kg，第 3天劑量為5mg/kg，並以此劑量維持10天，自由進食，給水，正常對照組大鼠背部皮下注射相同體積的生理鹽水。實驗共分為四組，包括正常對照組，模型組，苯丙素苷組和陽性對照依那普利組，苯丙素苷組和依那普利組按照每日10mg/kg的劑量分別連續灌胃給藥苯丙素苷、依那普利13天，對照組和模型組給予等體積的生理鹽水。實驗結束後斷頭處死大鼠，摘取心臟，10%福馬林固定，石蠟包埋，切成2mm切片，2mm厚石蠟切片做VG染色。3. 2大鼠心臟組織羥脯氨酸的測定大鼠處死，摘取心臟，去除大血管，心房，心外膜脂肪組織，然後用預冷的生理鹽水衝洗乾淨，沿室間隔剪去右室游離壁，剩餘部分用濾紙吸乾水分後稱得左心室重量，組織中的膠原經酶消化產生羥脯氨酸，羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產生的氧化產物與二甲氨基苯甲醛作用呈現紫紅色，利用分光光度計在550nm測定羥脯氨酸含量，具體操作按照羥脯氨酸測定試劑盒進行，羥脯氨酸測定試劑盒購自南京建成生物工程公司。4.實驗結果4. 1心臟的組織形態學改變光鏡下可見空白組心肌纖維排列有序，大鼠皮下注射異丙腎上腺素後出現明顯的心肌纖維化改變，病理切片顯示血管周圍和心肌細胞間有大量纖維化增生變化，部分心肌纖維肥厚或萎縮，呈波浪狀排列，少量光細胞散在浸潤，心肌間質成纖維細胞增生明顯，苯丙素苷組和依那普利組可見病灶明顯疏散，新生血管增多，成纖維細胞增生減少，可見心肌纖維化明顯減輕。4. 2大鼠心臟組織羥脯氨酸含量的變化模型組與正常對照組相比，模型組的大鼠心肌組織中羥脯氨酸含量明顯升高，而苯丙素苷組和依那普利組心肌組織中羥脯氨酸含量與正常對照組接近，沒有顯著變化。5.結論苯丙素苷對異丙腎上腺素造成的大鼠心肌纖維化有明顯的防治作用，其機理與其能抑制膠原蛋白的形成有關。


圖1.正常對照。圖2.模型組心肌細胞間有大量纖維化增生變化，部分心肌纖維肥厚或萎縮，呈波浪狀排列，少量光細胞散在浸潤，心肌間質成纖維細胞增生明顯。圖3.苯丙素苷組(口服給藥，10mg/kg)病灶明顯疏散，新生血管增多，成纖維細胞增生減少，心肌纖維化明顯減輕。圖4.依那普利(口服給藥，10mg/kg)心肌纖維化病灶明顯減少，減輕。結論玄參中苯丙素苷組和依那普利組口服給藥對異丙腎上腺素造成的大鼠心肌纖維化具有明顯的抑制作用。
具體實施例方式口服苯丙素苷對異丙腎上腺素造成的大鼠心肌纖維化的抑制作用Waster大鼠40隻，必凱實驗動物有限公司提供，實驗前經第二軍醫大學動物所1 周適應性飼養。到實驗室後將購得大鼠隨機分為4組，包括正常對照組，模型組，苯丙素苷組和陽性對照依那普利組，苯丙素苷組和依那普利組按照每日10mg/kg的劑量連續灌胃給藥13天，對照組和模型組給予等體積的生理鹽水。除正常對照組外，其餘各組大鼠背部皮下注射異丙腎上腺素，首次劑量為20mg/kg，第2天劑量為10mg/kg，第3天劑量為5mg/kg， 並以此劑量維持10天，自由進食，給水，正常對照組大鼠背部皮下注射相同體積的生理鹽水。十三天後斷頭處死大鼠，摘取心臟，10 %福馬林固定，石蠟包埋，切成2mm切片，2mm厚石蠟切片做VG染色。大鼠心臟組織羥脯氨酸的測定大鼠處死，摘取心臟，去除大血管，心房，心外膜脂肪組織，然後用預冷的生理鹽水衝洗乾淨，沿室間隔剪去右室游離壁，剩餘部分用濾紙吸乾水分後稱得左心室重量，組織中的膠原經酶消化產生羥脯氨酸，羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產生的氧化產物與二甲氨基苯甲醛作用呈現紫紅色，利用分光光度計在550nm測定羥脯氨酸含量，具體操作按照羥脯氨酸測定試劑盒進行，羥脯氨酸測定試劑盒購自南京建成生物工程公司。結果從染色切片可以看出(圖1)可見空白組心肌纖維排列有序，圖2大鼠皮下注射異丙腎上腺素後出現明顯的心肌纖維化改變，血管周圍和心肌細胞間有大量纖維化增生變化，部分心肌纖維肥厚或萎縮，呈波浪狀排列，少量光細胞散在浸潤，心肌間質成纖維細胞增生明顯，苯丙素苷組圖3和依那普利組圖4可見病灶明顯疏散，新生血管增多，成纖維細胞增生減少，可見心肌纖維化明顯減輕。從表1可以看出，模型組與正常對照組相比，模型組的大鼠心肌組織中羥脯氨酸含量明顯升高，而苯丙素苷組和依那普利組心肌組織中羥脯氨酸含量與正常對照組接近，沒有顯著變化。羥脯氨酸是膠原纖維中的重要成分，羥脯氨酸的含量多少能反映纖維化的程度，通常都是以測定羥脯氨酸指標來觀察纖維化程度。表1玄參中苯丙素苷對大鼠心肌組織羥脯氨酸含量的影響(χ士s，η = 10)
劑量(mg/kg)輕脯氨酸(pg/mg溼重)
正常對照組0.553±0. 035
模型組0.734±0· 047**
苯丙素苷組100.557±0. 044δδ
依那普利組100.562±0. 036δδ**與正常正常對照組相比，ρ < 0. 01，^與模型組相比，ρ <0.0權利要求
1. 一類結構式如下的苯丙素苷
全文摘要
本發明提供一類苯丙素苷在製備抑制心肌纖維化藥物中的應用，大鼠隨機分為模型組、苯丙素苷組、陽性對照組及正常對照組4組，試驗採用異丙腎上腺素背部注射造成大鼠心肌纖維化的模型，正常對照組和模型組給予生理鹽水，其餘組分別給藥，結果顯示苯丙素苷和陽性對照組中，心臟成纖維細胞增生減少，心肌纖維化明顯減輕，羥脯氨酸含量與對照組對比無明顯變化。
文檔編號A61P9/04GK102198141SQ20101013286
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月25日 優先權日2010年3月25日
發明者李醫明, 王瑞, 魏善建, 黃才國 申請人:上海中醫藥大學, 中國人民解放軍第二軍醫大學