一種基於花序浸漬誘導板慄2n花粉的方法與流程
2023-04-22 21:22:47
本發明屬於果樹育種技術領域，具體涉及一種用化學藥劑誘導多倍體的方法。
背景技術：
板慄原產中國，栽培歷史悠久，是優良的乾果樹種。中國板慄三分之二以上的種植面積位於經濟欠發達的邊老窮山區，隨著歷史的發展逐漸形成了獨具特色的山區板慄產業，成為山區農民貧致富的重要經濟依賴。品種是一個產業得以健康發展的重要保證，也是永恆的基礎需求。目前，國內外均採用多種方式來培育新品種為生產服務，植物上獲得新品種的主要方式包括：實生選種、芽變選種、雜交育種、輻射育種、轉基因育種、多倍體育種等，其中多倍體育種一直是應用普遍、育種效果突出的新品種培育方式之一。多倍體是指具有三套或者三套以上完整染色體組的所有個體。染色體組加倍使植物體可用的遺傳物質增加，重複的基因可能會發生功能分化，從而使多倍體物種在自然選擇中具有更大環境適應優勢，如更強的抗旱能力、抗病蟲害能力、無融合生殖等，使植物可以適應更廣泛的自然環境(Rieseberg LH.Hybrid origins of plant species.Ann Rev Ecol Syst,2003,28(1):359-389)。目前，多倍體育種的途徑主要包括：從自然界選擇天然多倍體植株；利用不同倍性水平植株雜交；利用天然或人工誘導2n花粉(2n雄配子)授粉；利用天然或者人工誘導2n雌配子雜交以及體細胞染色體加倍等。實踐業已證實，利用2n配子雜交是獲得植物多倍體的一種高效方式。2n配子是指在減數分裂過程中某些因素導致形成具有體細胞染色體數的花粉或卵細胞，其在植物界普遍發生，目前至少26個科的60個屬中發現能產生2n配子的植物種(張正海等.小胡楊小孢子發生及微管骨架變化.北京林業大學學報,2008(6):36-40.)；Nassar N.Cassava,Manihot esculenta Crantz and wild relatives:their relationships and evolution.Genetic Resources and Crop Evolution,2001,48(5):429-436.)。特別是2n花粉(具有體細胞染色體數的花粉)，由於其與正常倍性花粉在形態及大小方面存在差異，易於識別和鑑定，廣泛應用於植物多倍體育種(楊倩等.，楊樹2n花粉形態判別方法飛比較.東北林業大學學報,2015(2):33-35.)。國內外學者多年育種實踐證實，利用化學藥劑誘導出2n花粉與二倍體雌株雜交，是迅速獲得三倍體的有效途徑之一，而提高2n花粉產生頻率是利用2n花粉進行多倍體育種成敗的關鍵(向素瓊等，柑橘屬2n花粉自然發生與沙田柚2n花粉誘導研究.西南大學學報：自然科學版,2005,27(5):616-620)。
在植物雌雄配子多倍化過程中，由於各物種間遺傳物質、器官構成、發育時期和方式等因素千差萬別，其達到好的多倍化誘導效果所需的藥劑、劑量、時間、材料和方法等因素也各不相同(吳瀟，等.誘變技術在落葉果樹育種中的應用.園藝學報，2016，43(09)：1633-1652.)。板慄的遺傳背景複雜，保守性強，無法直接利用其自然花粉中2n花粉進行多倍體育種實踐；在目前的相關研究中，尚未發現有關成功誘導出板慄大頻率2n花粉的報導。
技術實現要素：
為了克服板慄自然花粉中2n花粉比率過低、無法直接應用於育種實踐的不足，彌補大頻率板慄2n花粉人工誘導方法空白，本發明旨在提供一種基於花序浸漬誘導板慄2n花粉的方法，該方法可以獲得大頻率2n花粉。
實現本發明目的的技術方案為：
一種基於花序浸漬誘導板慄2n花粉的方法，包括以下步驟：
1)選擇誘導材料：選擇板慄品種的花序為誘導處理材料，所述花序為雄花枝上的花序；
2)配製誘導藥劑：配置秋水仙素的水溶液為誘導藥劑，處理花序之前1～3天配製好誘導藥劑，置於1～6℃溫度下備用；
3)誘導藥劑浸漬花序：選擇板慄品種花枝上的花序為處理對象。誘導藥劑處理花序時期為每年5月，將選用的雄花枝上的每條花序單獨用脫脂棉包覆，保留花序著生部位葉片；將誘導藥劑注射在包裹花序的脫脂棉上，直至脫脂棉吸收誘導藥劑至飽和狀態，
4)花序散粉前套袋：在板慄花朵開放前(每年6月1～10日)，將誘導藥劑處理過的花序全部套入紙袋中，封口，以防止該花序上混入其它花粉。
5)花粉收集：待硫酸紙袋中花序處於雄花盛花期，此時花粉已成熟，將紙袋和花序一同採下，收集袋中自然散落的花粉，即獲得大頻率板慄2n花粉。採下花序後優選置於陰涼乾燥處24h。
其中，步驟1)所述板慄品種為燕奎(Castanea mollissima『Yankui』)。
其中，步驟2)所述誘導藥劑中，秋水仙的濃度為0.1～1％(W/V)。該濃度表示溶液每100mL體積中加入秋水仙0.1～1g。
其中，所述誘導藥劑中含有體積濃度為0.02～0.2％的助滲劑，所述助滲劑為環氨基甲酸酯、內醯胺、二甲基亞碸中的一種或多種。
步驟3)所述處理對象為板慄健康無病、生長健壯的雄花枝，其上保留的4～6個花序為處理對象。
其中，步驟3)選擇板慄花序以基部直徑不超過5mm，長度不超過15cm，花朵緊抱花蕊未開放為標準。
進一步地，誘導藥劑處理花序時期為每年5月10日～25日，這個時期內花序大多符合上述的標準。在5月15至18日是更優選的時間。
進一步地，步驟3)中，花序用脫脂棉包好，包覆的棉層厚度為2±0.5mm，之後用塑料條將雄花枝上所有包裹好脫脂棉的花序連同其著生部位葉片封好，留有適當透氣縫隙；用注射器將誘導藥劑注射在包裹花序的脫脂棉上，直至脫脂棉吸收誘導藥劑至飽和狀態，如此使板慄雄花枝上的花序在藥劑浸漬狀態下。
其中，步驟3)所述使板慄雄花枝上的花序在藥劑浸漬狀態下為使板慄雄花枝上的花序在藥劑浸漬狀態下保持24～74h。之後拆除塑料條，去除花序上的脫脂棉，將藥劑處理後的花序重新暴露在空氣中。試驗中發現，浸漬72小時花粉誘導率到極限值，再延長浸漬時間會導致花粉敗育或死亡。考慮到操作時間，浸漬狀態保持最多74h。
本發明所述的基於花序浸漬誘導板慄2n花粉的方法在板慄多倍體育種中的應用。
自然界中的板慄花粉中2n花粉的比率不足1‰(試驗證實：對照板慄花序花粉中2n花粉的比率為0.03‰)，無法直接利用其進行多倍體育種實踐。在目前的相關研究中，尚未發現有關成功誘導出板慄大頻率2n花粉的報導。本發明以板慄花序為對象，篩選其適宜的誘導藥劑、劑量、時期、部位等因素，創建一套基於花序浸漬的板慄2n花粉誘導技術，獲得大頻率2n花粉，為今後提供一種切實可行的板慄2n花粉誘導方法，從而為板慄倍性育種的成功提供技術支撐。
本發明基於花序浸漬誘導板慄2n花粉的方法：第一通過選擇花粉量充足的板慄品種『燕奎』的雄花枝上的花序為處理材料；第二選用以秋水仙素為誘導劑、二甲基亞碸為助滲劑的特定成分、特定濃度和特定配比的2n花粉誘導藥劑；第三選擇誘導藥劑處理花序特定時期為每年5月17日前後；第四採用脫脂棉包裹花序並使其在藥劑浸漬狀態下保持72h。以上4個優選的措施來共同達到誘導板慄花粉中2n花粉比率提高的目的，獲得大比率板慄2n花粉。
板慄花序採用本發明提出的方法處理後，可以獲得大比率2n花粉，試驗證實處理的板慄花序所產生的花粉中2n花粉比率高達11.6％。
附圖說明
圖1未處理的正常板慄花序(對照)照片；
圖2脫脂棉包裹的板慄花序照片；
圖3塑料封條封好的板慄花序照片；
圖4誘導處理完成後解除塑料封條的板慄花序照片；
圖5散粉前板慄花序套袋照片；
圖6誘導出的大比率板慄2n花粉照片；
圖7自然板慄花粉(對照)照片。
具體實施方式
現以以下實施例來說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例中使用的手段，如無特別說明，均使用本領域常規的手段。
實施例及對比例中所用藥劑、脫脂棉、塑料條、醫用一次性注射器、硫酸紙袋等材料均為市購。
實施例1：
對比例1所用試驗材料位於河北省昌黎果樹研究所板慄育種基地。按下述方法進行基於花序浸漬誘導板慄2n花粉試驗。
試驗隨機區組設計，單株小區，3次重複，以未處理『燕奎』花序為對照。該試驗以誘導藥劑(4個水平)、誘導藥劑處理花序時期(5個水平)和藥劑浸漬花序時長(3個水平)為因素，進行完全試驗設計，共60個處理(見表1)。按照下述步驟進行板慄2n花粉誘導操作：
1)選擇誘導材料
選擇花序長、花朵多、花粉量充足的板慄品種『燕奎』(Castaneamollissima『Yankui』)的雄花枝上的花序為處理材料。選擇板慄花序以基部直徑不超過5mm，長度不超過15cm，花朵緊抱花蕊未開放為標準。
2)配製誘導藥劑
於採用誘導藥劑處理花序前2天配製好各處理所需誘導藥劑(濃度見表1)的水溶液(W/V的單位是g/mL)，置於4℃冰箱中備用。
3)誘導藥劑浸漬花序
選擇板慄品種『燕奎』健康無病，生長健壯的雄花枝，每條雄花枝上保留5個花序為處理對象，多餘疏除。各處理的誘導藥劑處理花序時期按照表1所列執行。將選用的雄花枝上的每條花序單獨用脫脂棉包好，棉層厚度2±0.5mm，保留花序著生部位葉片；之後用塑料條(厚度0.06mm，寬度3cm)將雄花枝上所有包裹好脫脂棉的花序連同其著生部位葉片自下而上纏好，留有適當透氣縫隙；用醫用一次性注射器將配置好的誘導藥劑注射在包裹好花序的脫脂棉上，直至脫脂棉吸收誘導藥劑至飽和狀態，如此使板慄雄花枝上的花序在藥劑浸漬狀態下保持24—72h(各處理所用時長見表1)；之後拆除塑料條，去除花序上的脫脂棉，將藥劑處理後的花序重新暴露在空氣中。
4)花序散粉前套袋
在板慄花朵開放前(6月5日)，將誘導藥劑處理過的花序全部套入硫酸紙袋中，封口，以防止該花序上混入其它花粉。
5)花粉收集
待硫酸紙袋中花序處於雄花盛花期，此時花粉已成熟，將硫酸紙袋和花序一同採下，帶回實驗室，置於陰涼乾燥處24h，之後收集袋中自然散落的花粉。
6)2n花粉檢測
隨機選取收集的部分花粉，經卡諾固定液V(乙醇)：V(乙酸)＝3：1固定24—48h。將固定好的花粉製成臨時塗片，45％醋酸洋紅染液染色20min，置於顯微鏡上觀察。根據花粉的直徑判斷是否為2n花粉，並計算比例。每個處理單次隨機檢測500個花粉，重複3次。SPSS 20.0進行數據統計分析。
所有花粉檢測均在Olympus BX-51光學顯微鏡下觀察，Olympus DP70照相系統數碼攝相，照片見圖1-7。
表1試驗設計各處理的相關因素
7)實施效果
由表2可見，處理Ch37～60(5月25日之後)誘導的板慄花粉中2n花粉比率極低，故不對其進行差異顯著性分析。
不同處理誘導出的板慄2n花粉比率不盡相同，處理ch-1～36誘導出的板慄2n花粉比率均高於自然板慄花粉(CK)，處理ch42、ch-51、ch-58誘導產生的板慄2n花粉比率和對照無顯著差異，其餘處理誘導產生的2n花粉比率低於對照。所有處理中誘導產生2n花粉比率最高的為ch-24，其誘導產生的板慄2n花粉比率為11.6％，顯著高於對照(板慄自然花粉中2n花粉比率為0.067％)，亦顯著高於其它處理產生的2n花粉。
由此可見，以誘導產生的2n花粉比率為評價指標，ch-24處理中各因素組合為最佳，誘導產生的2n花粉比率是所有處理中最高的(可獲得高達11.6％的板慄2n花粉)。換言之，在以獲得大頻率2n花粉為目的的前提下，選用誘導藥劑[0.75％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亞碸]，於5月17日處理花序，並保持藥劑浸漬花序72h的處理，可以取得理想的試驗結果。
表2板慄2n花粉誘導效果
注:表中數據後不同字母表示差異顯著(α＝0.05)。
試驗數據也表明，板慄的自然花粉中2n花粉的比率不足1‰，由於其比率過低，無法直接利用其自然花粉中2n花粉進行多倍體育種實踐。
實施例2～10
以下實施例共對「燕奎」、X44-21、燕明、南垂5號、替碼珍珠、燕昌、燕紅、燕龍、燕豐、懷九共10個花期相近的板慄品種進行基於花序浸漬誘導板慄2n花粉試驗。
按照下述步驟進行板慄2n花粉誘導操作：
1)選擇誘導材料
選擇燕奎、X44-21、燕明、南垂5號、替碼珍珠、燕昌、燕紅、燕龍、D7-43、懷九共10個板慄品種的雄花枝上花序作為誘導處理材料。
2)配製誘導藥劑
於採用誘導藥劑處理花序前2天配製好所需誘導藥劑[0.75％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亞碸]，置於4℃冰箱中備用。
3)誘導藥劑浸漬花序
選擇各板慄品種健康無病，生長健壯的雄花枝，每條雄花枝上保留5個花序為處理對象，多餘疏除。將選用的雄花枝上的每條花序單獨用脫脂棉包好，棉層厚度2±0.5mm，保留花序著生部位葉片；之後用塑料條(厚度0.06mm，寬度3cm)將雄花枝上所有包裹好脫脂棉的花序連同其著生部位葉片自下而上纏好，留有適當透氣縫隙；用醫用一次性注射器將配置好的誘導藥劑注射在包裹好花序的脫脂棉上，直至脫脂棉吸收誘導藥劑至飽和狀態，如此使板慄雄花枝上的花序在藥劑浸漬狀態下保持72h；之後拆除塑料條，去除花序上的脫脂棉，將藥劑處理後的花序重新暴露在空氣中。
4)花序散粉前套袋
在板慄花朵開放前(6月5日)，將誘導藥劑處理過的花序全部套入硫酸紙袋中，封口，以防止該花序上的花粉混入其它花粉。
5)花粉收集和檢測
待硫酸紙袋中花序處於雄花盛花期，此時花粉已成熟，將硫酸紙袋和花序一同採下，帶回實驗室，置於陰涼乾燥處24h，之後收集袋中自然散落的花粉。
6)2n花粉檢測
隨機選取收集的部分花粉，經卡諾固定液V(乙醇)：V(乙酸)＝3：1固定24～48h。將固定好的花粉製成臨時塗片，45％醋酸洋紅染液染色20min，置於顯微鏡上觀察。根據花粉的直徑判斷是否為2n花粉，並計算比例。每個處理單次隨機檢測500個花粉，重複3次。SPSS 20.0進行數據統計分析。
所有花粉檢測均在Olympus BX-51光學顯微鏡下觀察，Olympus DP70照相系統數碼攝相。顯微觀察誘導出的花粉尺寸和實施例大致相等。
7)實施效果
由表3可知，10個板慄品種採用同一基於花序浸漬誘導板慄2n花粉方法，均可誘導產生6.24％比率以上的2n花粉，顯著高於板慄自然花粉中2n花粉比率(0.067％，表2)，說明發明方法在不同板慄品種上實施均可誘導大頻率2n花粉，該方法具有廣泛性。
該發明方法在不同品種上實施，誘導產生的2n花粉比率亦有差別，品種『燕奎』、『南垂5號』、『燕昌』、『D7-43』經同一方法誘導產生的2n花粉比率較高，但這4個品種間無顯著差別，其中以品種『燕奎』誘導處理後產生的2n花粉比率最高。
表3各品種誘導出的2n花粉比率統計表
注:表中數據後不同字母表示差異顯著(α＝0.05)。
以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案做出的各種變型和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。