一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆短肽的製備方法
2023-04-23 06:49:11
專利名稱：一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆短肽的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物活性肽的製備技術領域，涉及一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽、其分離純化方法及用途。
背景技術：
短肽是介於胺基酸和蛋白之間的由3-9個胺基酸殘基組成的短鏈肽，也叫低聚肽、寡肽或活性肽。近幾年的科學研究發現，人體吸收蛋白質的主要形式不是以胺基酸，而是以短肽的形式吸收的，這是人體吸收蛋白質機制研究的重大突破，短肽在人體內的作用具有以下特點:1、不需消化，直接吸收，通常，短肽是人體自身合成的，是人體將所吃的營養進行酶促水解。在體外已經合成好了，進入人體後不需進行二次降解，直接吸收；吸收迅速，口服劑如同針劑，口服進入人體，其速度如同火箭一樣，有的科學家把它稱為「生物飛彈」，快速地穿過人體的口腔、胃，直接進入小腸，被小腸吸收，最終進入人體血液循環系統、器官及細胞組織，迅速發揮其生理作用和生物學功能；以完整的形式吸收，短肽自身有一層保護膜，人服用時，不會受到人體中的促酶、胰酶、澱粉酶、消化酶、胃蛋白酶及消化系統中的酸鹼物質的損害或二次水解，短肽是以完整的形式被人體吸收和利用的；可百分之百被人體吸收；吸收後，不會有任何排洩物，全部被人體吸收和利用；短肽具有主動被人體吸收的特點。短肽自身具有極強的活性和能量，它的主動吸收、迫使吸收，就是自身的活性和能量在起作用，因此，它在被人體吸收時，不是人體要耗費自身的能量去吸收它，而是多肽以自身的能量讓人體吸收；短肽具有優先被人體吸收的特點，人體平常所食的營養物質，在吸收上，與短肽的競爭中，短肽具有優先吸收的特點，這與其主動吸收的特點是分不開的；短肽在被人體吸收時，對胺基酸有保護作用，可保護胺基酸不受破壞，因此，肽與胺基酸的混合物是人體吸收蛋白質的最佳吸收機制；短肽在人體中表現出載體的作用，可將人平常所食的營養物質，特別是鈣等對人體有益的微量元素，吸附、粘貼、裝載在本體上；短肽可在人體中起運輸工具的作用，可將人平常所食的各種營養物質吸附在本體上後，然後運載輸送到人體各個細胞；短肽被人體吸收後，在 人體中起著信使作用，它作為神經遞質傳遞信息，讓人體各系統、器官、組織發揮各自和整體作用。短肽可分為植物源短肽和動物源短肽兩大類，其中大豆類短肽是比較常見研究較多的植物源短肽。近年來的研究表明，由大豆類蛋白降解得到的短肽，具有生物活性，可增強體能，消除疲勞，可用於降膽固醇、降血壓、輔助治療糖尿病及解酒和排毒，延緩衰老；同時，其易消化、易吸收且避免了大豆蛋白對人體的過敏性反應。目前大豆類短肽已經被用於多種營養品或藥物當中。鷹嘴豆屬於高營養豆類植物，富含多種植物蛋白和多種胺基酸、維生素、粗纖維及鈣、鎂、鐵等成份。此外籽粒中還含腺嘌呤、膽鹼、肌醇、澱粉、蔗糖、葡萄糖等。其中純蛋白質含量高達28%以上，脂肪5%，碳水化合物61%，纖維4 - 6%，鷹嘴豆含有10多種胺基酸，其中人體必需的8種胺基酸全部具備，而且含量比燕麥還要高出2倍以上。每百克蛋白質含穀氨酸16.0g、亮氨酸4.6g、賴氨酸4.6g。
鷹嘴豆短肽也是短肽中生物活性較為突出的一類短肽，除了其較高的營養價值之夕卜，目前也已經發現其在抗癌和增強免疫力等方面的功效，而其在抗氧化方面更是有著非常好的表現。目前對於短肽的研究還在逐漸深入當中，如何獲取抗氧化效果更好，製備更加簡單穩定的鷹嘴豆多肽是本領域中還有待解決的問題。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽。本發明的第二個目的是提供一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法。本發明的第三個目的是提供一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的用途。在第一方面，本發明提供了一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽，其特徵在於所述鷹嘴豆肽的序列為SEQ ID NO: 1。根據本發明的鷹嘴豆肽，其特徵在於，所述鷹嘴豆肽可以是對SEQ ID N0:1的鷹嘴豆肽進行一個或多個胺基酸殘基的缺失、增加和/或取代而獲得的，其序列為SEQ IDNO:2-9。根據本發明的鷹嘴豆肽，其特徵在於，所述鷹嘴豆肽可以是藥學上可接受的鹽形式。根據本發明的鷹嘴豆肽，其特徵在於，所述鷹嘴豆肽可以被乙醯化、PEG化或醯胺化修飾。在第二方面，本發明提供了根據第一方面所述的鷹嘴豆肽的製備方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟:(I)脫脂；(2)蛋白酶水解；(3)凝膠層析分離，獲得所述鷹嘴豆肽。本發明的鷹嘴豆肽的製備方法可以包括以下步驟:(I)將鷹嘴豆浸泡後脫皮，50°C烘乾，用粉碎機打成豆粉。200目過篩，按豆粉:石油醚為1:10 (w/v)的比例進行脫脂，室溫下連續攪拌lh，鷹嘴豆自然沉降與石油醚分離，傾出石油醚進行回收，重複上述提取工藝兩次，然後將鷹嘴豆粉置於通風櫥下過夜，使石油醚充分揮發乾淨，將處理好的脫脂豆粉袋裝置-20°C冰箱保存；(2)脫脂豆粉與水按1:9 1:12 (w/v),優選地1:10 1:11 (w/v),更優選地1:10.5 混合,用 0.5mol/LNa0H 調 pH 至 8.3 攬拌 lh, 3000r/min 離心 10 20min,沉澱按固液比1:5 (w/v)提取兩次，將三次上清液合併，上清液用0.5mol/L的HCl調至等電點pH4.3沉澱蛋白，10000r/min離心20min,冷凍乾燥後,得到鷹嘴豆蛋白；(3)將所述鷹嘴豆蛋白溶解於蒸餾水中製成質量溶度為2%_5%，優選地3%_4%，更優選地3.5%的蛋白水溶液，按鹼性蛋白酶Alcalase與鷹嘴豆蛋白的比例為2%_5%，優選地3%-4%(v/w)，更優選地3.5%,將Alcalase酶加入鷹嘴豆蛋白水溶液中，在pH8.0，反應溫度為40°C -60°C，優選地45°C -55°C，更優選地55°C的條件下，水解30_60min，將酶解液放入沸水浴中IOmin,再迅速放入冰水浴中IOmin,冷卻後10000r/min離心IOmin,將離心出的液體部分冷凍乾燥，得到鷹嘴豆肽粉末；和
(4)將處理好的S^hadex G_25裝成1.6X 150cm的玻璃層析柱，用超純水將鷹嘴豆酶解物配製成20mg/mL的溶液，上樣量為5mL，用超純水以20mL/h的流速洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm處檢測，分時段共出現6個洗脫峰，收集第一個洗脫峰，冷凍乾燥，獲得所
述鷹嘴豆肽。在第三方面，本發明提供了一種組合物，其特徵在於，所述組合物包含第一方面所述的鷹嘴豆肽。根據本發明的所述組合物可以是藥物組合物(包括膠囊、片劑、口服液、衝劑)保健品、食品添加劑、化妝品或詞料。在第四方面，本發明提供了根據第一方面所述的鷹嘴豆肽在藥物組合物、保健品、食品添加劑、化妝品或飼料製備中的應用。本發明的有益效果在於:(I)本發明的鷹嘴豆肽抗氧化生物活性較高。(2)本發明的鷹嘴豆肽製備條件溫和，簡便易行，重現性好，樣品回收率高，為開發相關產品奠定了基礎。
圖1為凝膠色譜G-25分離鷹嘴豆蛋白酶解物的圖譜。圖2為本發明的短肽(SEQ ID NO:1)的提取離子流圖(上)和一級質譜圖(下)。
具體實施例方式
本發明的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，並不能對本發明作任何限制。下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法，包括下述步驟:(I)將鷹嘴豆浸泡後脫皮，50°C烘乾，用粉碎機打成豆粉。200目過篩，按豆粉:石油醚為1:10 (w/v)的比例進行脫脂，室溫下連續攪拌lh，鷹嘴豆自然沉降與石油醚分離，傾出石油醚進行回收，重複上述提取工藝兩次。然後將鷹嘴豆粉置於通風櫥下過夜，使石油醚充分揮發乾淨。將處理好的脫脂豆粉袋裝置-20°C冰箱保存。脫脂豆粉與水按1:9 (w/v)混合，用0.5mol/LNa0H調pH至8.3攪拌lh，3000r/min離心lOmin,沉澱按固液比1:5 (w/v)提取兩次,將三次上清液合併,上清液用0.5mol/L的HCl調至等電點pH4.3沉澱蛋白，10000r/min離心20min,,冷凍乾燥後,得到鷹嘴豆蛋白。(2)將所述鷹嘴豆蛋白溶解於蒸餾水中製成質量溶度為2%_5%的蛋白水溶液，按鹼性蛋白酶Alcalase與鷹嘴豆蛋白的比例為2% (v/w),將Alcalase酶加入鷹嘴豆蛋白水溶液中，在PH8.0，反應溫度為50°C的條件下，水解30 ;將酶解液放入沸水浴中lOmin，再迅速放入冰水浴中IOmin,冷卻後10000r/min離心IOmin,將離心出的液體部分冷凍乾燥,得到鷹嘴豆肽粉末。(3)將處理好的S印hadex G-25裝成1. 6X 150cm的凝膠色譜柱，用超純水將鷹嘴豆酶解物配製成20mg/mL的溶液，上樣量為5mL，用超純水以20mL/h的流速洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm處檢測，分時段共出現6個洗脫峰，收集各洗脫峰，冷凍乾燥各洗脫組分。經測定(見下文)，具有抗氧化活性最高的是第一個洗脫峰，用I表示。見圖1。液質聯用(HLPC-MS)確定組分I的結構。色譜柱:ZorbaxSB C18 (150mmX 2.1mm 1.D.，5 y m);流動相 A:水(含 0.1%TFA),B:乙腈(含 0.1%TFA);梯度:0 80min, B:5% 40% ；80 90min, B:40% 90% ;進樣量80 u L ;流速:0.2ml/min ;檢測波長:214nm。質譜條件:ESI電噴霧離子源，噴霧電壓4.5kV，加熱電壓25V，離子導入電壓(skimmer電壓)20V,殼氣流速:60arb,輔助氣流速:5arb,離子傳輸毛細管溫度:300°C。離子監測模式參數中共設立3個掃描段，第一段監測為一級質譜全掃描，掃描範圍為m/z=400-2000，採用正離子監測模式；第二段監測為數據依賴型精確質量數掃描(datadependent zoomscan),用來確定一級質譜全掃描中某一高豐度離子所帶電荷數；第三段監測採用數據依賴型二級質譜的掃描(data dependent MS/MS)，用於掃描在第一段和第二段監測中已確定質量數離子的二級質譜，離子帶電荷數默認值為2個，二級質譜碰撞誘導裂分中的能量值均設置為35%。為獲得同一色譜峰內不同多肽的序列信息，將質譜分析過程中的動態排除次數降低為1，動態排除時間設為0.5min，離子注入離子阱的模式為type2模式，即在離子注入過程中排除低於或高於設定的掃描範圍的離子從而提高目標離子的信號強度。尚子動態排除數量設為20。動態排除中尚子的質量數寬度設為1.0。用Turbosequest軟體進行檢索，資料庫為從Swiss-Prot下載的包括鷹嘴豆中已發現的全部蛋白質的胺基酸序列。數據搜索格式為:FASTA。獲得I組分的分子量為1333Da，胺基酸組成為:Glu_Glu-Pro-Arg-Glu-Ser-Glu-Gln-Gly-Glu-Gly-Ser (SEQ ID NO:1)。保留時間為 15.46 所對應的峰為I組分的主要成分。見圖2。鷹嘴豆蛋白酶解物還原能力的測定還原能力測定方法:稱取5mg``不同組分的樣品溶於2mL的去離子水中，震蕩使其充分溶解，加入0.2mol/L pH6.6的磷酸緩衝液2mL，質量分數為1%的鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液2mL，混勻，50°C水浴下保溫20min，再加入質量分數為10%的三氯乙酸(TCA)溶液2mL，震蕩混勻後離心。取離心後的上清液2mL，加入2mL去離子水和0.4mL質量分數為0.1%的FeC13溶液，震蕩混勻後在50°C水浴下保溫lOmin，體系溶液由黃色變為藍色，在700nm下進行比色。以去離子水代替樣品作為空白。測定結果見表I。表I
權利要求
1.一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽，其特徵在於，所述鷹嘴豆肽的序列為SEQ IDNO:1。
2.根據權利要求1所述的鷹嘴豆肽，其特徵在於，所述鷹嘴豆肽可以是對SEQID NO:I的鷹嘴豆肽進行一個或多個胺基酸殘基的缺失、增加和/或取代而獲得的，其序列為SEQID NO:2-9。
3.根據權利要求1或2所述的鷹嘴豆肽，其特徵在於，所述鷹嘴豆肽是藥學上可接受的鹽形式。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的鷹嘴豆肽，其特徵在於，所述鷹嘴豆肽被乙醯化、PEG化或醯胺化修飾。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的鷹嘴豆肽的製備方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: (1)脫脂； (2)蛋白酶水解； (3)凝膠層析分離，獲得所述鷹嘴豆肽。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: (1)將鷹嘴豆浸泡後脫皮，50°C烘乾，用粉碎機打成豆粉。200目過篩，按豆粉:石油醚為1:10 1:12 (w/v)，優選地1:10 1:11 (w/v)，更優選地1:10.5的比例進行脫脂，室溫下連續攪拌lh，鷹嘴豆自然沉降與石油醚分離，傾出石油醚進行回收，重複上述提取工藝兩次，然後將鷹嘴豆粉置於通風櫥下過夜，使石油醚充分揮發乾淨，將處理好的脫脂豆粉袋裝置-20°C冰箱保存； (2)脫脂豆粉與水按1:9 1:12(w/v),優選地1:10 1:ll(w/v),更優選地1:10.5混合比例混合，攬祥均勻，用0.5mol/LNaOH調pH至8.3攬祥lh, 3000r/min離心10 20min,沉澱按固液比1:5 (w/v)提取兩次，將三次上清液合併，上清液用0.5mol/L的HCl調至等電點pH4.3沉澱蛋白，10000r/min離心20min,冷凍乾燥後,得到鷹嘴豆蛋白； (3)將所述鷹嘴豆蛋白溶解於蒸餾水中製成質量溶度為2%-5%，優選地3%-4%，更優選地3.5%的蛋白水溶液，按鹼性蛋白酶Alcalase與鷹嘴豆蛋白的比例為2%_5%，優選地3%-4% (v/w)，更優選地3.5%，將Alcalase酶加入鷹嘴豆蛋白水溶液中，在pH8.0 pH9.0，優選地pH8.2 pH8.8，更優選地pH8.5，反應溫度為40°C -60°C，優選地45°C _55°C，更優選地55°C的條件下，水解30-60min，將酶解液放入沸水浴中lOmin，再迅速放入冰水浴中lOmin，冷卻後10000r/min離心IOmin,將離心出的液體部分冷凍乾燥，得到鷹嘴豆肽粉末； (4)將處理好的S^hadexG-25裝成1.6X 150cm的玻璃層析柱，用超純水將鷹嘴豆酶解物配製成20mg/mL的溶液，上樣量為5mL，用超純水以20mL/h的流速洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm處檢測，分時段共出現6個洗脫峰，收集第一個洗脫峰I，冷凍乾燥，獲得所述鷹嘴豆肽。
7.一種組合物，其特徵在於，包含根據權利要求1至4中任一項所述的鷹嘴豆肽。
8.根據權利要求7所述的組合物，所述組合物是藥物組合物、保健品、食品添加劑、化妝品或飼料。
9.根據權利要求7或8所述的組合物，所述組合物為膠囊、片劑、口服液或衝劑。
10.根據權利要求1至4中任一項所述的鷹嘴豆肽在藥物組合物、保健品、食品添加劑、化妝品或飼料製備 中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽、其分離純化方法及用途。所述鷹嘴豆肽抗氧化生物活性較高，並且其製備條件溫和，簡便易行，重現性好，樣品回收率高，易於進行相關產品的開發。
文檔編號A61P39/06GK103172706SQ20131008414
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月15日 優先權日2013年3月15日
發明者王麗, 邢慧芳, 楊良嶸, 劉會洲 申請人:中國科學院過程工程研究所