遊黴素的回收的製作方法
2023-04-23 10:46:26 2
專利名稱：遊黴素的回收的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從發酵液中回收遊黴素的快速而廉價的方法。
背景技術：
遊黴素(又稱為匹馬菌素或tenecetin)是一種廣為人知的抗菌素(Florey，″Analytical Profiles of Drug Substances″，Vol.10，1981；Merck Index，8th ed，″Pimaricin″，p.834)。雖然人們已經認識到它的有價值的抗菌性質，由於極其高昂的生產費用，遊黴素的研究及商業化幾乎沒有進行。因為遊黴素溶解於各種液體，它的回收還沒有達到經濟可行。有必要開發一種經濟可行的遊黴素回收工藝。
遊黴素已通過發酵法製備，例如英國專利846,933所公開的使用鏈黴素gilvosporeus。在這一工藝中，用甲醇萃取的方法回收遊黴素，後續煩瑣的吸附和洗脫步聚。Bridger的美國專利3,378,441號公開了通過鹽析法將其從發酵液中分離、用甲醇萃取、除去固體然後蒸發液體來回收遊黴素的工藝。Struyk的美國專利3,892,850號公開了通過用酸化甲醇萃取後蒸餾、沉澱的方法來回收遊黴素的工藝。Struyk同時公開了用溶解於甲醇的氯化鈣提高遊黴素可溶性。每一種工藝都需要一個昂貴的回收步聚，如吸附和洗脫、蒸餾或蒸發。英國專利844,289號給出了用加水的方法從醋酸中沉澱遊黴素的方法。Millis的PCT公報WO92/10580號，公開了從一種含有至少2g/L遊黴素的發酵液中回收遊黴素的工藝，包括加入甲醇和調節萃取介質的pH值至1.0-4.5以溶解沉澱下的遊黴素；除去固體，並且將pH值升至6.0-9.0以沉澱遊黴素。但是用該工藝回收的遊黴素包含一種不希望得到的副產物--遊黴素甲酯。
發明概述高純度遊黴素可以用甲醇在控制下的pH值和溫度條件下萃取的方法，從一種含有遊黴素的發酵液中回收。工藝包括步驟(1)將甲醇加入一股含有至少2g/L固體懸浮遊黴素進料物流中，以形成一種萃取介質，並且維持萃取介質溫度在0-25℃，優選不超過15℃；(2)在維持溫度在0-25℃下的同時，調節萃取介質的pH值到1.0-4.5，保持0.5-30小時，但是溫度為15-25℃時優選不超過0.5小時；(3)從萃取介質中除去固體以形成一種萃取液；(4)將萃取液的pH值升高至6.0-9.0；並且(5)回收沉澱的遊黴素。
在另一項實施方案中，該工藝包括步驟(1)將裡面含有約10-50g/L溶解度加強鹽的甲醇，加入一股含有至少2g/L固體懸浮遊黴素的遊黴素進料物流中，以形成一種萃取介質；(2)從萃取介質中除去固體以形成一種萃取液；(3)將水加入萃取液中以沉澱遊黴素；並且
(4)回收沉澱的遊黴素。
在每種實施方案中，較高純度遊黴素可以經由下列方法得到(1)通過用水衝洗在最後一個步驟中回收的沉澱遊黴素；(2)通過在遊黴素沉澱前用活性炭處理萃取液；(3)上述步驟結合使用。優選的溶解度加強鹽是氯化鈣。
附圖簡述
圖1是在控制的pH和溫度條仵下回收工藝的示意圖。
圖2是採用溶解鹽的回收工藝的示意圖。
發明詳述甲醇萃取遊黴素發酵液的進料物流發酵法生產遊黴素在Eisenschink的美國專利5,231,014號、英國專利846,933號和1991年8月5日提交的美國專利申請07/740,545和07/740,536號上已經公開。在這些發酵法中產生的發酵液包含固體懸浮遊黴素、生物體和水。例如Eisenschink所公開的工藝產生的發酵液一般含有約7-12g/L遊黴素。
發酵液用作回收工藝的進料物流，或者直接地或者通過除去一部分或幾乎全部的水濃縮後使用。進料物流中至少應當含每升2g的遊黴素，但優選更高的濃度。由於發酵液含水，固體懸浮遊黴素和生物體固體，部分或基本上全部的水，可以用任何方便的常規固/液分高技術，例如離心、過濾或傾析來除去(參見實施例1，其中舉以過濾實例說明)。如果需要，固體可以採用諸如熱空氣、噴霧乾燥或用機械方法將水擠出等常規方法進一步乾燥。如果固體用加熱法乾燥，應使用約20-80℃的溫度。高於95℃的溫度應當避免。
遊黴素在萃取介質(進料物流與甲醇)中的溶解度隨著水含量增加而降低。由於萃取介質中的水含量取決於進料物流中水的量，最好在第一步實施前儘可能多地除去水。如果進料物流中含大約70％體積的水，所需要的甲醇量是以非常乾燥的進料物流開始時所需要的甲醇量的約3倍。如果進料物流中含大約40％體積的水，需要的甲醇是其約2倍。
進料物流中的固含量可以低至約20％(Wt)或更低，如果幾乎不或根本不除去水，或者如果約98％(Wt)高含量的水被除去的話。為了達到高度回收所需的遊黴素濃度，可能需要在甲醇加入之前濃縮發酵液。與設備情況有關，尤其是為了回收甲醇，在甲醇加入之前從發酵液中除去幾乎所有的水可能是需要的。這樣就將回收所需的甲醇量降至最低。如果經濟考慮處主導地位，應當從發酵液中除去絕大部分水。這就使得回收過程可能在沒有大量副產物生成的較高pH值下進行。在一個優選實施例中，除去水產生了含有至少50％(Wt)固體的進料物流。
甲醇的加入參照圖1，在第1步中，甲醇被加入進料物流中。在合適的條件下，遊黴素在這種廉價溶劑中有著優異的溶解性，而且甲醇的回收有簡易的方法。為得到最優的遊黴素回收率，加入足夠的甲醇於進料物流中以得到含約20-150g/L遊黴素的萃取介質。由於遊黴素在高濃度下易於從酸化萃取介質中沉澱(第2步)，優選遊黴素在萃取介質中的濃度為20-120g/L 。
酸的加入在第2步中，通過加入一種酸將萃取介質的pH值調節至約1.0-4.5。這使得遊黴素在萃取介質中高度可溶。雖然任何常規可兼容的酸性物料都可以使用，但鹽酸是一種優秀的選擇。雖然不是一種優選技術，第1和第2步可以通過將酸直接加入甲醇的方法結合起來。
一種不希望得到的副產物遊黴素甲酯的生成取決於pH值、遊黴素-甲醇接觸時間和溫度(見表1)。保證這一步在約0-25℃的溫度下進行很重要，因為這樣可以將遊黴素甲酯和其它不希望得到的副產物的生成降至最低。溫度越高或接觸時間越長，在給定的pH值下生成副產物的可能越多。為避免遊黴素甲酯在15-25℃下生成，應採用短的接觸時間，即0.5小時或更短。在約15℃，萃取時間不應超過1.5小時。優選的萃取溫度為約0-15℃。
一般來講，在pH值接近2以及約0℃下，萃取可以持續12小時而沒有過量副產物生成。在約25℃下萃取可以在0.5小時後停止。當pH值增加至4.5，較長的時間是可以接受的。在pH值接近4以及溫度在約4℃時，時間可以在30小時左右。
表1遊黴素甲酯在甲酯中的生成溫度 時間 遊黴素甲酯(℃) pH(hr) (g/l)(％產品重量)232.4044 0232.4142 3.9232.4241 7.3232.4338 9.7233.2038 0233.2138 2.3233.2237 3.9233.2434 7.4233.2632 9.216 23 14234.0041 0234.0240 2.3234.0439 3.74 2.4042 0.44 2.4242 1.34 2.48.5 39 2.74 2.419 37 5.2
對於商業上可接受的生產，需要將甲酯含量維持在總產品(遊黴素、甲酯和任何雜質)重量的約5％以下，優選低於其重量的約3％。
有可能通過冷卻物流和/或甲醇的方法在所需的低溫下進行甲醇萃取以使萃取介質在加入酸時在低溫範圍之內。
萃取進行的合適時間/溫度/pH值的關係可以容易地通過試驗確定，記下在一個特定pH值下產生所需產品純度的時間和溫度，並記住所使用的特定設備的最優的經濟性。
pH值在某種程度上取決於萃取介質中的水含量和所希望的產率。為了達到約90％或更高的沉澱產率，遊黴素在萃取介質中的濃度應當在約40g/L。在沒有水存在的情況下，所需的pH值是約4.5。在約30％水/70％甲醇(體積)的情況下，所需的pH值是約2.5(表2)。
表2遊黴素在甲醇及甲醇/水的混合物中的溶解度水含量 遊黴素(％) pH (g/L)07.0604.55003.87802.09430 7.0430 3.31830 2.455
懸浮固體的除去在第3步中，剩餘的懸浮固體可用任何方便的固/液分離技術除去，例如過濾或離心分離，留下一種萃取液。固體從萃取介質中除去後，仍然可能含有大量遊黴素。因此，在一項優選實施方案中，用甲醇或甲醇與水的混合物衝洗固體，以回收至少一部分包含在固體中的遊黴素。衝洗溶液加入萃取液中。
遊黴素的沉澱和回收在第4步中，任何一種兼容的基本材料都可用於將萃取液的pH值提高至約6.0-9.0。這樣就使得高純度遊黴素沉澱下來，然後被移出和乾燥。典型的適用、廉價而且兼容的基本材料是鈉和鉀的氫氧化物。如果需要，也可以在第4步加入水以幫助遊黴素沉澱。進料物流含有高濃度遊黴素和少量水時，這樣做可能更好。含有有用的遊黴素、發酵殘餘物、甲醇、無機鹽和水的剩餘液體副產物(殘餘液)被送去回收甲醇。甲醇可以用溶劑回收的常規蒸餾方法進行。
本工藝生產的遊黴素的重量純度至少約80％，通常為至少約90％。在一項優選實施方案中，在第5步中回收的遊黴素沉澱用水衝洗，然後乾燥，得到純度至少約90％重量的遊黴素。
本工藝可以用間歇萃取法進行。但是對於大規模商業化萃取來說，連續過程可能更好。在一項技術中，遊黴素發酵液，優選濃縮至低含水量，連續地加入混合器中並在低溫下與甲醇徹底混合。pH值通過加入酸來控制，遊黴素快速溶解。然後將得到的萃取介質加入過濾器中，以將生物體和其它固體從萃取液中分離出來。將萃取液加入一個在較高pH值下操作的結晶器中，遊黴素就沉澱下來。沉澱遊黴素和殘餘液被連續地從結晶器中移出。萃取時間、水含量、溫度和pH值可以按遊黴素生產的經濟合理性加以調節。
加入溶解度加強鹽不採用加酸降低pH值後加鹼升高pH值並沉澱遊黴素的方法，也可能快速得到遊黴素的高回收率。在該工藝中，一種甲醇與溶解度加強鹽的混合物，與遊黴素發酵液進料物流(濃縮或非濃縮的)混合。得到的萃取介質被過濾以除去生物體和其它固體，得到一種萃取液。水被加入萃取液中沉澱遊黴素。
任何在萃取條件下能增加遊黴素在甲醇中的溶解度，並且不與遊黴素萃取體系反應，或不幹擾遊黴素萃取、回收或產品純度的鹽，都可以使用。氯化鈣(CaCl2)是優選的溶解度加強鹽。鹽在甲醇中的量為約10-50g/L時最為有效。
為了最優化遊黴素的回收，如上所述，水一般要從進料物流中除去。進料物流應當含有足夠多的遊黴素，以便在萃取液(甲醇/鹽溶液)加入進料物流後，得到的萃取介質含有至少2g/L的遊黴素。遊黴素濃度低於2g/L時，難以用加水的方法沉澱遊黴素。
為了沉澱出高百分比的遊黴素，萃取液中水的含量應當增加到至少50％(Vol.).表3給出了遊黴素在甲醇/水/氯化鈣溶液中的溶解度對水含量的函數變化。
表3遊黴素在甲醇/CaCl2*中的溶解度在不同水濃度的萃取物水含量 遊黴素(％.v/v) (g/L)0 9110 4420 1930640550220g/LCaCl2.
本工藝可以在pH2-9，優選pH6-8下進行。如果pH值低，萃取時間應當短，因為酸性環境促進了遊黴素甲酯的生成(見表4)。如果pH值高於6，酯的生成減慢。任何合理的溫度都可以採用(即20-30℃)。
表4酯在含40g/L CaCl2的甲醇中的生成溫度 時間遊黴素甲酯(℃)pH(hr)(g/L)(％產品)23 4.4 0 72 06 675.023 5.3 0 51 020 482.423 6.1 0 51 020 491.15 4.4 0 60 08 600.5圖2概要地示意了本工藝。在步驟(a)，一種甲醇/鹽溶液被加入進料物流中。在步驟(b)，殘餘懸浮固體用任何固/液分高技術，例如過濾或離心分離，從萃取介質中除去以得到一種萃取液。固體中可能仍含有大量遊黴素，可以用甲醇或甲醇與水的混合物衝洗以回收至少一部分含在固體中的遊黴素。甲醇衝洗溶液被加入萃取液中。在步驟(c)，水被加入萃取液以沉澱遊黴素。在步驟(d)，沉澱的遊黴素得以回收。回收的沉澱中至少含有80％重量的遊黴素，通常至少含有90％重量的遊黴素。較高純度的產品，高達至少90％重量的遊黴素，可以用在步驟(d)中用水衝洗回收的沉澱的方法，或在步驟(c)進行之前用活性炭處理萃取液的方法，或兩種方法結合使用來得到。
工業應用本工藝是一種從發酵液，特別是從含有遠高於2g/L含量遊黴素的發酵液中，快速、廉價回收遊黴素的工藝。
實施例1該實施例說明了在控制的pH值和溫度條件下遊黴素的回收。按照Eisenschink的美國專利第5,231,014號所敘述的方法製備的含有遊黴素、生物體、水和少量營養物和雜質的發酵液，用在Buchner平底瓷漏鬥中過濾的方法被濃縮至含約45％的固體。Celite545被加入其中以提高過濾率。濾餅中含約7.5％重量的遊黴素。
大約74g濾餅與約96ml甲醇混合以生成一種萃取介質漿液，並將漿液溫度用冰浴夾套降至約4℃。將鹽酸加入漿液中降低pH值至約2.4，並在此溫度和pH值下將漿液放置3小時左右。
用平底瓷漏鬥過濾漿液，得到約150ml含約40g/L遊黴素的清液(萃取液)。加入5N的氫氧化鈉溶液，使萃取液的pH值升高至約7，並在此pH值下緩慢攪拌保持約1小時。在這期間，一種粘稠的白色沉澱形成。
用過濾法分離出沉澱，並在40℃左右真空乾燥。得到大約4.1g乾產品。產品含約92％重量的遊黴素(幹基)和1.7％重量的甲酯。
實施例2該實施例說明了在控制的pH值和溫度條件下遊黴素的回收。重複實施例1的過程，但萃取介質溫度為約22℃而不是約4℃。乾燥後得到3.9g左右的產品。產品含約83％重量的遊黴素(幹基)和10％重量的甲酯。
實施例3該實施例說明了採用溶解度加強鹽來回收遊黴素。用在平底瓷漏鬥過濾使發酵液濃縮至含45％重量的固體。加入Celite545以提高過濾率。濾餅在一個流化床乾燥器中，在60℃下進一步乾燥至含98％重量的固體。乾燥餅中遊黴素的含量為18％(Wt)。
40g的幹濾餅被加入3g氯化鈣溶解於150ml甲醇的溶液中，漿液被混合30min。在平底瓷漏鬥上過濾漿液並收集清濾液(萃取液)。
邊攪拌邊緩慢加入水，使濾液中水的體積含量增加至30％。一種粘稠灰白色沉澱形成。用過濾法分離沉澱，用水衝洗並在30℃下真空乾燥。沉澱含88％重量的遊黴素(幹基)。
實施例4該實施例說明了採用溶解度加強鹽來回收遊黴素。發酵液(IL)被加熱至70℃ 15min，冷卻至室溫並靜置沉澱。500ml的上層液體被傾析棄去。用平底瓷漏鬥過濾濃縮剩餘固體。20gCelite545被加入以增加過濾率。用50ml甲醇衝洗濾餅兩次，以除去大部分的水，並留下10％重量的水。濾餅含9％重量的遊黴素。40g濾餅被加入2g氯化鈣溶解在50ml甲醇的溶液中並混合0.5小時。用平底瓷漏鬥過濾漿液並收集清濾液(萃取液)。將3g活性炭加入濾液並將混合物攪拌1小時。將炭過濾除去並收集清濾液。
緩慢地邊攪拌邊加入水，使濾液中水的體積含量增加到50％，一種粘稠的白色沉澱形成，將其過濾，用水衝洗並在30℃下真空乾燥。沉澱含95％重量的遊黴素(幹基)。
權利要求
1.一種回收遊黴素的工藝，包括按下列順序的步驟(1)將甲醇加入一股含有固體遊黴素的遊黴素進料物流中，以形成每升含20-150g遊黴素的萃取介質，並維持萃取介質的溫度在0-25℃；(2)維持萃取介質的溫度在0-25℃，並調節其pH值在1.0-4.5，0.5-30小時；(3)從萃取介質中除去固體以形成一種萃取液；(4)將萃取液的pH值提高至6.0-9.0；並且(5)回收沉澱遊黴素。
2.權利要求1的工藝，其中進料物流中含有至少50％重量的固體。
3.權利要求1的工藝，其中萃取介質的溫度維持在0-15℃。
4.權利要求1的工藝，其中通過在步驟(1)之前將酸加入甲醇中的方法，將步驟1和2結合起來。
5.權利要求1的工藝，另外包括在步驟(3)之後和步驟(4)之前(6)用甲醇衝洗固體並將甲醇加入萃取液。
6.權利要求1的工藝，另外包括在步驟(4)之前的步驟(7)用活性炭處理萃取液。
7.權利要求1的工藝，另外包括在步驟1之前的步驟(8)從遊黴素進料物流中除去水，以使遊黴素進料物流中含有少於10％重量的水。
8.權利要求7的工藝，其中萃取介質中含有每升20-150g的遊黴素。
9.權利要求8的工藝，其中萃取介質的溫度維持在0-15℃。
10.權利要求9的工藝，其中萃取介質的溫度在0-15℃維持0.5-1.5小時。
11.權利要求10的工藝，另外包括在步驟(4)之前的步驟(7)用活性炭處理萃取液。
12.一種回收遊黴素的工藝，包括按下列順序的步驟(1)將含有約10-50g/L溶解度加強鹽的甲醇，加入含有至少2g/L固體懸浮遊黴素的遊黴素進料物流中以形成一種萃取介質；(2)從萃取介質中除去固體以生成一種萃取液；(3)將水加入萃取液中以沉澱遊黴素；並且(4)回收沉澱遊黴素。
13.權利要求12的工藝，其中溶解度強化鹽是氯化鈣。
14.權利要求13的工藝，其中進料物流中含有至少50％重量的固體。
15.權利要求13的工藝，另外包括步驟(3)之前的步驟(7)用活性炭外理萃取液。
16.權利要求13的工藝，另外包括步驟(1)之前的步驟(6)從遊黴素進料物流中除去水以便游離素進料物流中含有少於10％重量的水。
17.權利要求16的工藝，其中萃取介質中含有每升20-150g的遊黴素。
18.權利要求17的工藝，另外包括在步驟(3)之前的步驟(7)用活性炭處理萃取液。
全文摘要
一項用甲醇萃取的方法從發酵液中回收高純度遊黴素的工藝在此公開。在一項實施方案中，該工藝包括下列步驟(1)將甲醇加入一股含有至少2g/L固體懸浮遊黴素的遊黴素進料物流中以形成一種萃取介質，並且維持萃取介質溫度在0-25℃，優選不超過15℃；(2)調節萃取介質的pH值到1.0-4.5，並維持溫度在0-25℃ 0.5-30小時，但是溫度為15-25℃時優選不超過0.5小時；(3)從萃取介質中除去固體以形成一種萃取液；(4)將萃取液的pH值提高至6.0-9.0；並且(5)回收沉澱的遊黴素。
文檔編號C12P19/62GK1135239SQ94194150
公開日1996年11月6日 申請日期1994年9月16日 優先權日1993年9月17日
發明者P·T·奧爾森, J·R·米力斯, M·H·萊馬 申請人:生物技術資源兩合公司