親和力降低的新抗體和製備所述抗體的方法

2023-04-23 10:52:06

專利名稱：親和力降低的新抗體和製備所述抗體的方法
親和力降低的新抗體和製備所述抗體的方法相關申請的交叉引用
本申請要求2010年I月28日提交的美國臨時申請61/299，162的權益的優先權，其整個內容通過引用結合到本文中。
背景技術：
單克隆抗體因其以高度特異性結合抗原的能力而被廣泛用作研究、診斷和治療試劑。除其與抗原特異性結合外，單克隆抗體還可以通過其Fe區活化補體系統和效應細胞。為了正確地說明抗體的生物學性質，合適的對照是必需的。在沒有合適對照的情況下，難以確定抗體的特異性結合活性與抗體的生物化學和生物學作用之間的因果關係。目前使用的對照單克隆抗體包括1.由天然存在的漿細胞瘤分泌的無已知靶抗 原的抗體；2.針對來自進化遠緣物種例如KLH (匙孔戚血藍蛋白)的抗原產生的抗體；3.與不同於目的抗原的已知靶抗原起反應的抗體。在這些情況的每一種中，所用對照抗體具有限定不清的可變結構域和不確定的抗原特異性。而在第三種情況下，仍存在交叉反應性的問題。因此，當使用目前可獲得的對照抗體時，常常會遇到例如交叉反應性或非特異性結合等問題。此外，由於缺乏理想的對照抗體，因此常常使用製劑溶媒(例如生理鹽水)作為對照進行研究。在這種情況下，如果不是不可能的話，也難以區別所觀察到的生物化學和/或生物學作用是特異性抗原/抗體相互作用的直接結果，還是非特異性作用的結果，非特異性作用例如抗體分子的其它部分或存在於抗體製備物中的汙染物(例如宿主細胞蛋白質)的相互作用和生物學作用。鑑於至少這些原因，目前極其需要改進的合理設計的對照抗體。發明概述
一方面，本發明提供用於產生結合能力降低的互補決定區(CDR)的方法，所述方法包括以下步驟(a)從CDR多肽內鑑定出能夠與抗原相互作用的至少一個結合胺基酸；和(b)改變CDR多肽內的所述至少一個結合胺基酸，使得所得CDR在結合抗原方面的能力降低。在一些實施方案中，所述⑶R位於抗體或抗體片段內。在一些實施方案中，所述方法還包括驗證抗原結合喪失的步驟。可通過FACS分析實現驗證步驟。另一方面，本發明提供用於產生結合能力降低的抗體或抗體片段的方法，所述方法包括以下步驟(a)自抗體或抗體片段內鑑定出能夠與抗原相互作用的至少一個結合胺基酸；和(b)改變抗體或抗體片段內的所述至少一個結合胺基酸，使得所得抗體在結合抗原方面的能力降低。在一些實施方案中，所述方法還包括驗證抗原結合喪失的步驟。可通過FACS分析實現驗證步驟。在一些實施方案中，所述相互作用是氫鍵、鹽橋和/或範德華力。在某些實施方案中，所述結合胺基酸是天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬醯胺、組氨酸或穀氨醯胺。在其它實施方案中，所述結合胺基酸是酪氨酸、絲氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸。在一些實施方案中，所述結合胺基酸被非結合胺基酸替換。在一些實施方案中，所述非結合胺基酸是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。
在本發明的某些實施方案中，通過分析描述CDR和抗原間的複合物的晶體結構來進行鑑定結合胺基酸的步驟。另一方面，本發明包括採用本發明的方法產生的抗體或抗體片段。在一些實施方案中，本發明的抗體或抗體片段具有大於或等於約10_7的解離常數(Kd)。在一些實施方案中，本發明的抗體或抗體片段是完整的免疫球蛋白分子、scFv, Fab片段、Fab』片段、F(ab』)2、Fd片段、Fv或二硫鍵連接的Fv。附圖簡述
圖I表示描述製備本發明的對照抗體的流程圖。圖2表示參與抗體-抗原相互作用的特定⑶R胺基酸的頻率。圖3表示包括Fv結構域、Fab結構域和Fe結構域的抗體結構的示例性示意圖。
圖4表示重組抗體生產的示例性方法的圖示。圖5表不OKT3的抗體產生和本發明的一些不例性對照抗體。圖6表示表明本發明的一些示例性對照抗體與人Jurkat細胞結合的FACS圖。圖7表示表明本發明的一些示例性對照抗體與人PBMC結合的FACS圖。圖8表示編碼0KT3重鏈的pME-wt0KT3 HC載體的圖譜。圖9表示編碼0KT3輕鏈的pME-wt0KT3 LC載體的圖譜。

圖10表示0KT3和0KT3變體與Jurkat細胞的結合。圖11表示變體抗體的藥代動力學。發明詳述
本發明提供親和力降低的新抗體，其具有在基本不改變抗體的三維結構的情況下降低或消除抗原結合的充分表徵的可變結構域。為了更容易地理解本發明，下文以及整個說明書對某些術語和短語作出定義。術語「抗體」在生物學和生物醫學領域中被充分理解，通常是指完整抗體及任何抗體片段或其單鏈。抗體是由稱為漿細胞的特化B淋巴細胞分泌的糖蛋白。其亦被稱為免疫球蛋白(Ig)，因為其含有存在於許多蛋白質中的共有結構域。抗體最可能包含通常由二硫鍵連接的2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(Vh)和重鏈恆定區組成。每條輕鏈同樣由可變區(')和恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。V1^P'區可進一步再分成超變區，稱為互補決定區(CDR)，其散布有稱為構架區(FR)的更保守的區域。每個￥11和'由按以下順序自氨基端到羧基端排列的3個CDR和4個FR組成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。本發明還包括抗體片段。抗體片段的實例包括(i) Fab片段，一種由VH、VpCL和CHl結構域組成的單價片段；(ii) F(ab』)2片段，一種包含在鉸鏈區通過二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段；(iii) Fd片段，其由V1^P CHl結構域組成；(iv) Fv片段，其由抗體單臂的 Vh 和'結構域組成，(V) dAb 片段(Ward 等，(1989) Nature 341:544 546)，其由 Vh結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(OTR)或(vii)兩個或更多個分離⑶R的組合，其可任選通過合成接頭連接。此外，雖然Fv片段的2個結構域V1^P \由不同的基因編碼，但是可採用重組方法，通過合成接頭將它們連接，所述合成接頭使它們成為其中Vh和\區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)的一條蛋白質鏈；參見例如Bird等(1988) Science242:423 426 ;以及 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879 5883)。這類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的「抗原結合部分」內。本文所用「抗體」和「抗體片段」可互換使用以描述本發明，除非另有明確說明。術語「超變區」、「HVR」或「HV」是指序列是超變的並形成結構上確定的環的抗體可變結構域的區域。抗體一般包含6個HVR ;3個在VH (H1、H2、H3)中，3個在VL (L1、L2、L3)中。在抗體分子中，VH結構域的3個HVR和VL結構域的3個HVR在三維結構中被連接在一起形成抗原結合表面。因為這些序列形成與靶抗原的三維結構互補的表面，因此HVR亦被稱為互補決定區(OTR)。術語「⑶R」及其複數「⑶Rs」是指互補決定區(⑶R)，其中3個構成輕鏈可變區(CDRL1、CDRL2和CDRL3)的結合特性，3個構成重鏈可變區(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的結合特性。CDR有助於抗體分子的功能活性，並且被包括支架區或構架區的胺基酸序列分開。確切界定的⑶R邊界和長度取決於不同的分類和編號系統。因此⑶R可參考Kabat、Chothia、接觸或任何其它邊界定義。儘管有不同的邊界，這些系統的每一個在構成可變序列內的所 謂「超變區」中有某種程度的重疊。因此，就相鄰構架區而言，按照這些系統的CDR定義的長度和邊界區域可不同。參見例如Kabat、Chothia和/或MacCallum等(Kabat等，載於「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」 第 5 版，美國衛生與公眾服務部(U.S. Department of Health and Human Services), 1992; Chothia 等，J. Mol.Biol. , 1987，196: 901 ;和 MacCallum 等，J. Mol. Biol. , 1996，262: 732，各自均通過引用以其整體結合)。「構架區」或「FR」殘基是那些可變結構域殘基而非本文定義的HVR殘基。示例性的構架區由SEQ ID NOs. 15-22提供。本文術語「Fe區」用來定義免疫球蛋白重鏈的C端區，包括天然序列Fe區和變體Fe區。雖然免疫球蛋白重鏈的Fe區的邊界可不同，但人IgG重鏈Fe區通常被定義為從Cys226位或Pro230位的胺基酸殘基延伸至其羧基端。例如，可在抗體產生或純化期間，或者通過重組工程改造編碼抗體重鏈的核酸，除去Fe區的C端賴氨酸(EU編號系統的殘基447)。因此，完整抗體的組成可包含所有K447殘基均被除去的抗體群、無K447殘基被除去的抗體群和具有含或不含K447殘基的抗體的混合物的抗體群。用於本發明抗體的合適的天然序列Fe區包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。「Fe受體」或「FcR」描述了與抗體Fe區結合的受體。優選的FcR是天然序列人FcR0此外，優選的FcR是結合IgG抗體的FcR U受體)，並且包括Fe Y RI、Fe Y RII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式，FcyRII受體包括FcyRIIA ( 「活化受體」)和Fe Y RIIB ( 「抑制受體」)，其具有主要在其胞質結構域上不同的相似胺基酸序列。活化受體Fe y RIIA在其胞質結構域含有基於免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其胞質結構域含有基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITM)。(參見 M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。FcR 的綜述見Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. TmmunoI 9: 457-92 (1991) ；CapeI 等,Immunomethods4: 25-34 (1994);以及 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)。其它FcR，包括與其它同種型結合的FcR以及將來鑑定的FcR，均包括在本文術語「FcR」中。抗體可以是異種的、同種異體的或同基因的或其修飾形式(例如人源化的、嵌合的等)。抗體還可是完全人抗體。本文所用術語「單克隆抗體」是指針對特定表位顯示單一結合特異性和親和力的抗體。因此，術語「人單克隆抗體」是指這樣的抗體，其顯示單一結合特異性並且具有來源於人種系或非種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。在一個實施方案中，人單克隆抗體由包括B細胞的雜交瘤產生，所述B細胞獲自轉基因非人動物(例如轉基因小鼠)，其具有包含與永生化細胞融合的人重鏈和輕鏈轉基因的基因組。在本發明的一些實施方案中，對抗體或其片段進行修飾以降低或消除潛在的糖基化位點。這類修飾抗體常被稱為「去糖基化」抗體。為了改進抗體或其抗原結合片段的結合親和力，可通過例如誘變(例如定點誘變)來改變抗體的糖基化位點。「糖基化位點」是指被真核細胞識別作為糖殘基連接位置的胺基酸殘基。糖(例如寡糖)所連接的胺基酸通常是天冬醯胺(N-聯)、絲氨酸(0-聯)和蘇氨酸(0-聯)殘基。為了鑑定抗體或抗原-結合片段內的潛在糖基化位點，通過例如利用可公開獲取的資料庫例如生物學序列分析中心(Center for Biological Sequence Analysis)提供的網站(對於預測N-聯糖基化位點，參見 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/,對於預測 0_ 聯糖基化位點，參見http://www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/),對抗體的序列進行檢查。用 於改變抗體的糖基化位點的其它方法描述於美國專利號6，350，861和5，714，350。此外，抗體糖基化可受其中產生抗體糖基化的細胞、抗體的構象和細胞培養條件影響。本發明優選的細胞表達系統是人細胞表達系統。術語「人源化抗體」是指由來源於哺乳動物而非人的抗體CDR以及人抗體的FR區和恆定區組成的抗體。人源化抗體可用作治療劑的有效組分，因為在人體中人源化抗體的抗原性降低。在治療應用的情況下，本發明的目的是設計人源化抗體的親和力降低的抗體。術語「重組抗體」包括所有通過重組方法製備、表達、產生或分離的抗體，例如(a)自動物(例如小鼠)(其免疫球蛋白基因為轉基因或轉染色體的)或者由其製備的雜交瘤(在下文第I部分作進一步描述)分離的抗體，(b)自經轉化以表達抗體的宿主細胞(例如轉染瘤)分離的抗體，(C)自重組的組合抗體文庫分離的抗體，和(d)通過任何其它方法(涉及將免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列)製備、表達、產生或分離的抗體。這類重組抗體具有來源於種系和/或非種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。然而，在某些實施方案中，可對這類重組抗體進行體外誘變(或當使用動物(其對於Ig序列為轉基因的)時為體內體細胞誘變)，因此重組抗體Vh和\區的胺基酸序列是這樣的序列，雖然來源於人種系Vh和\序列以及與人種系V1^P \序列有關，但可能並非天然存在於體內種系庫(repertoire)內。術語「雙特異性單克隆抗體」是指其結合臂與兩種不同類型的抗原具有雙重特異性的單克隆抗體。雙特異性單克隆抗體不是天然存在的；其必須用重組DNA或細胞融合技術製備。用該方法，對於這類抗體可能同時與細胞毒性細胞(使用受體諸如CD3)和癌症靶細胞(諸如CD19)結合，導致更有效地殺死靶癌細胞。本發明的目的是設計雙特異性單克隆抗體的親和力降低的抗體使得雙特異性抗體的一個或兩個臂可對抗原具有降低或消除的親和力。術語「KD」意欲指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。抗體對於單價表位的結合強度的量度稱為親和力。在某些情況下，抗體可與抗原形成多價相互作用。在這種情況下，抗體/抗原相互作用的表觀解離平衡常數可不同於單價解離常數。
親和力隨存在於抗體上的抗原結合部位和特異性抗原的抗原決定簇或表位之間的非共價鍵而變化。在典型情況下，抗體用於其特異性結合性質，而且當使用重組蛋白作為分析物，抗體作為配體，例如在BIAC0RE儀器中通過表面等離振子共振(SPR)技術測定時，抗體以約小於10_7 M、例如約小於10_8 M、10_9 M或10, M或甚至更低的親和力(Kd)結合，且與預定抗原結合的親和力是與非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)而非預定抗原或密切相關抗原結合的親和力的至少I. I倍、I. 2倍、I. 3倍、I. 4倍、I. 5倍、I. 6倍、I. 7倍、I. 8倍、
I.9 倍、2. 0 倍、2. 5 倍、3. 0 倍、3. 5 倍、4. 0 倍、4. 5 倍、5. 0 倍、6. 0 倍、7. 0 倍、8. 0 倍、9. 0 倍或10. 0倍或更多倍。短語「識別抗原的抗體」和「對抗原有特異性的抗體」在本文中與術語「與抗原特異性結合的抗體」互換使用。具有「降低的親和力」的抗體是指Kd約大於10_7M，例如是Kr7 M的約10倍、或100倍、或1000倍。本發明的目的是設計幾乎不與或不與抗原特異性結合的抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體具有大於或等於約10_7的解離常數(Kd)。更優選本發明的抗體具有大於或等於約10_6的解離常數(Kd)。最優選本發明的抗體對限定的抗原無可檢測的特異性結合。
根據Ig類別，可以結合多達5個結構分子以形成任一種抗體。在哺乳動物中，有5種Ig類別(IgG、IgM、IgA、IgD和IgE);在鳥類中，有3種類別(IgY、IgM和IgE)。在選定的哺乳動物中，因重鏈保守區中的多態性所致，IgG和IgA被進一步細分成亞類，稱為同種型。術語「核酸分子」或「多核苷酸」意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優選為雙鏈DNA。本發明還包括附圖中所示序列的「保守序列修飾」，包括核苷酸和胺基酸序列修飾，其不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的抗體或含有所述胺基酸序列的抗體的結合特性。這類保守序列修飾包括核苷酸和胺基酸取代、添加和缺失。可通過本領域已知的標準技術，例如定點誘變和PCR介導的誘變，將修飾引入附圖所示的序列中。保守胺基酸取代包括其中胺基酸殘基被具有類似側鏈的胺基酸殘基替換的取代。本領域已界定了具有類似側鏈的胺基酸殘基的家族。這些家族包括具有以下側鏈的胺基酸鹼性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、￠-分支的側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，由本文公開的重鏈和輕鏈可變區核苷酸序列編碼的抗體和/或含有本文公開的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列的抗體包括由經保守修飾的類似序列編碼的基本類似抗體或含有經保守修飾的類似序列的基本類似抗體。下面提供如何根據本文公開的序列(即重鏈和輕鏈可變區)產生所述基本類似抗體的進一步論述。可按照標準技術使本發明的核酸組成突變，以得到基因序列。對於編碼序列，這些突變可按需要影響胺基酸序列。具體地說，預期基本同源於或來源於天然V、D、J、恆定、轉換區的DNA序列和本文所述的其它這類序列(其中「來源」表明序列與另一序列相同或自另一序列修飾)。以下分部更詳細地描述了本發明的各個方面。I.親和力降低的抗體本發明親和力降低的抗體是經合理設計以消除或降低與抗原結合的抗體。現有優選親和力降低的抗體是除CDR區以外在各方面都類似於野生型(天然)抗體的抗體，並且相對於野生型抗體幾乎沒有可辨別的三維結構變化。示例性抗體是顯示與抗原的結合親和力降低10倍的抗體。優選親和力降低的抗體與抗原結合，且與抗原的結合親和力降低100倍。更優選親和力降低的抗體與抗原結合，且與抗原的結合親和力降低1000倍。最優選親和力降低的抗體與抗原無顯著結合，並且相對於背景結合水平，檢測不到與抗原的特異性結合。可通過常用實驗方法包括表面等離振子共振，或放射性配體結合測定法，或流式細胞術，來測量親和力。在涉及使用抗體的許多體內和體外應用中，本發明親和力降低的抗體可用作其野生型(天然)對應物(其保持與抗原的特異性結合)的對照試劑。可採用各種已知技術，例如重組DNA技術和其它標準分子和細胞生物學技術，來產生本發明親和力降低的抗體。可採用本領域眾所周知的重組DNA技術和基因轉染方法，來製備重組的親和力逄低的抗體(Morrison, S. (1985) Science 229 :1202)。例如編碼序列、具有已知抗原特異 性的抗體編碼多核苷酸可通過標準分子生物學技術(例如聚合酶鏈式反應)擴增，並連接至表達載體(例如PME)中。可採用標準定點誘變技術將突變引入表達載體，以破壞所編碼抗體的抗原結合。可採用本領域已知技術(例如磷酸鈣沉澱、電穿孔、脂轉染)，將編碼經突變的抗體重鏈和輕鏈基因的表達載體轉染至宿主細胞(例如293T細胞、CHO-細胞)。在將表達載體導入宿主細胞後，細胞將開始產生突變抗體並將突變抗體分泌至培養基中。可通過例如鑑定和選擇表達突變抗體的細胞，來實現長期的大規模抗體生產。可採用本領域已知技術從這些培養上清液和/或細胞中分離和純化重組抗體。或者，突變抗體可在其它表達系統或完整生物體中產生，或者可合成產生。在另一個實施方案中，親和力降低的抗體可作為嵌合抗體產生，其中將抗體重鏈和/或輕鏈的可變區與來自各種物種的恆定結構域融合。另外，可按照標準方案例如公開於美國專利5，565，332的方案，製備人源化的親和力降低的抗體。在另一個實施方案中，可採用本領域已知技術，例如如美國專利5，565，332,5, 871，907或5，733，743中所述，將包含核酸分子的載體(其編碼特異性抗體鏈的多肽鏈與可複製基因展示包(replicable generic display package)組分的融合物)與含有編碼單一結合對成員的第二多肽鏈的核酸分子的載體之間的重組來產生抗體鏈。可採用本領域已知的重組DNA技術，例如採用描述於以下文獻的方法，來產生親和力降低的抗體Robinson等，國際專利公布號PCT/US86/02269 ;Akira等，歐洲專利申請 184, 187 ；Taniguchi, M.，歐洲專利申請 171, 496 ；Morrison 等，歐洲專利申請 173, 494 ；Neuberger 等，PCT 申請 WO 86/01533 ；Cabilly 等，美國專利號 4, 816, 567 ；Cabilly 等，歐洲專利申請 125,023 ；Better 等(1988) Science 240:1041-1043 ；Liu 等(1987) Proc.Natl. Acad. Sci. USA84:3439-3443 ;Liu 等(1987) J. Immunol. 139:3521-3526 ；Sun 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218 ；Nishimura 等(1987) CancerRes. 47:999-1005 ;Wood 等(1985) Nature 314:446-449 ;和 Shaw 等(1988) J. Natl.Cancer Inst. 80:1553-1559) ；Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207 ;0i等(1986) Biotechniques 4:214 ；ffinter 美國專利 5, 225, 539 ；Jones 等(1986) Nature321:552-525 ;Verhoeyan 等(1988) Science 239:1534 ；以及 Beidler 等(1988) J.Immunol. 141:4053-4060。在本發明的又另一個方面，部分或已知的抗體序列可用來產生和/或表達親和力降低的抗體。抗體主要通過位於6個重鏈和輕鏈互補決定區(OTR)的胺基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，各個抗體間的CDR內的胺基酸序列比CDR外的序列更加多樣化。因為CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，所以可能通過構建表達載體來表達模擬特異性抗體的性質的重組抗體，所述載體包括植入來自具有不同性質的不同抗體的構架序列中的特異性抗體的 CDR 序列(參見例如 Riechmann, L.等，1998,Nature 332:323-327 ;Jones,P.等，1986, Nature 321:522-525 ;以及 Queen, C.等，1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A.86:10029-10033)。所述構架序列可獲自包括種系或非種系抗體基因序列的公共DNA資料庫。這些種系序列將不同於成熟的抗體基因序列，因為它們將不包括完全裝配的可變基因，其在B細胞成熟期間通過V(D) J連接而形成。種系基因序列也可在均勻跨可變區的各處不同於高親和力二級庫抗體的序列。例如，體細胞突變在構架區的氨基端部分相對稀少。例如，體細胞突變在構架區I的氨基端部分和在構架區4的羧基端部分相對稀少。此外，許多體細胞突變不顯著改變抗體的結合性質。為此，不必要獲得特定抗體的完整DNA序列以產 生具有類似於原始抗體的結合性質的完整重組抗體(參見1999年3月12日提交的PCT/US99/05535)。對於此目的，跨越⑶R區的部分重鏈和輕鏈序列通常就足夠。使用部分序列以確定哪個種系和/或非種系可變和連接基因區段對重組的抗體可變基因產生影響。然後使用種系和/或非種系序列填補可變區的缺失部分。重鏈和輕鏈前導序列在蛋白質成熟期間被切割，且不會對最終抗體的性質產生影響。為了加入缺失序列，通過連接或PCR擴增將克隆的cDNA序列與合成寡核苷酸聯合。或者，整個可變區可合成為一組短的重疊寡核苷酸，並通過PCR擴增聯合以產生全部合成的可變區克隆。該方法具有某些優勢，例如消除或包括特定的限制位點，或使特定的密碼子最優化。該方法還可用來篩選一種物種(例如人)中特定免疫球蛋白編碼序列的文庫，以設計來自另一種物種(例如小鼠)中的已知抗體序列的同族(cognate)免疫球蛋白編碼序列。來自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉錄物的核苷酸序列用來設計一組重疊的合成寡核苷酸，以產生具有與天然序列相同的胺基酸編碼能力的合成V序列。合成重鏈和K鏈序列可在三個方面不同於天然序列重複核苷酸鹼基的串(string)被間斷以利於寡核苷酸合成和PCR擴增；按照Kozak規則摻入最適翻譯起始位點(Kozak，1991，J. Biol. Chem.);及在翻譯起始位點上遊對限制位點進行改造。對於重鏈和輕鏈可變區兩者，最優化編碼鏈序列和相應的非編碼鏈序列大致在相應的非編碼寡核苷酸的中點分解成30-50個核苷酸。因此，對於每條鏈，寡核苷酸可裝配成為跨越150-400個核苷酸區段的重疊雙鏈組。該庫(pool)然後用作模板以產生150-400個核苷酸的PCR擴增產物。通常，單一可變區寡核苷酸組可被分解成2個庫，將其單獨擴增以產生產兩個重疊的PCR產物。然後，通過PCR擴增使這些重疊產物聯合以形成完整的可變區。亦可期需的是，在PCR擴增中包括重鏈或輕鏈恆定區的重疊片段以產生可容易地克隆至表達載體構建體的片段。然後，將重新構建的重鏈和輕鏈可變區與克隆啟動子、前導序列、翻譯起始序列、前導序列、恆定區、3』未翻譯序列、聚腺苷酸化序列和轉錄終止序列聯合以形成表達載體構建體。可將重鏈和輕鍊表達構建體併入單一載體中，共轉染、依次轉染或單獨轉染至宿主細胞，然後使其融合形成表達兩條鏈的宿主細胞。用於該用途的質粒是本領域已知的，包括下面的實施例部分提供的質粒。可以構建類似的質粒用於表達其它重鏈同種型，或用於表達包含、輕鏈的抗體。本發明的抗體因此還包括來自不同物種的抗體的各種同種型(IgG、IgE、IgA、IgM和IgD)。在本發明的又另一個方面，可採用噬菌體和/或酵母展示技術，產生親和力降低的抗體。例如，具有已知抗原特異性的抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區可融合為單鏈Fv片段，並在噬菌體和/或酵母表面上展示。展示這類scFv可對其靶抗原顯示強的結合活性。可在Fv片段的一個或多個CDR上進行隨機誘變，從而構建噬菌體文庫。可針對不再顯示抗原結合的克隆對文庫進行選擇，從而鑑定消除或降低抗原結合的CDR突變。親和力降低的抗體的抗原特異性的降低和/或消除的驗證可採用本領域已知方法進行。可用於驗證抗原結合降低的技術包括例如FAC分析、免疫印跡法、競爭結合測定法、免疫組織化學和表面等離振子共振技術。可通過例如分析抗原表面上的胺基酸與抗體 CDR區中的胺基酸之間的相互作用，來鑑定負責抗原和抗體之間相互作用的胺基酸(結合胺基酸)。這些相互作用的性質可分為3大類，範德華力、氫鍵和鹽橋。在抗原決定簇和⑶R胺基酸側鏈之間最常形成相互作用，但氫鍵也可能受抗原決定簇和CDR胺基酸側鏈之間的水分子介導。最頻繁參與範德華力相互作用的CDR胺基酸包括Ala、Phe、Ile、Leu、ASn、Pr0、Gin、Val、Trp和Tyr。最常形成鹽橋的⑶R胺基酸包括Asp、Glu、Arg和Lys。最常參與氫鍵相互作用的⑶R胺基酸包括Asp、Glu、His、Lys> Arg、Ser和Tyr。參與抗原相互作用的CDR胺基酸的分析顯示這樣的模式，其中某些胺基酸比其它胺基酸更可能參與抗體/抗原相互作用。通過CDR區內特定胺基酸的定點誘變(突變)，或者通過分析抗原-抗體複合物的晶體結構(x-tal)，來測定結合胺基酸/抗原相互作用。用於該分析的抗體列於表I中。表I.用於抗體/抗原相互作用分析的抗體
ImI抗原I方法—
0KT31_CD3_X-tal
23C32骨橋蛋白X - tal
5c83CD154X-tal
7G104白介素-23X-tal
B13I25_蚯蚓肌紅蛋白C-螺旋肽突變
Fab4-4-205 單鏈 DNA突變
FabDl. 35 雞卵溶菌酶突變
H576CD8X-tal
HyHEL-IO5 雞卵溶菌酶突變
HyHEL-55 雞卵溶菌酶突變
K411B7 _阿特拉津突變
McPC6035 _磷酸膽鹼突變
Rituxan8CD20X-tal
YTS1569|CD8|x-tal
I. Crystal structure of the human T cell receptor CD3 epsilon gammaheterodimer complexed to the therapeutic mAb OKT3 (與治療性 mAb OKT3 複合的人T 細胞受體 CD3 e y 異二聚體的晶體結構) Kjer-Nielsen L, Dunstone MA, KostenkoL, Ely LK, Beddoe T, Mifsud NA, Purcell AW, Brooks AG, McCluskey J, Rossjohn J.(2004) Proc Natl Acad Sci USA. 101:7675-7680。
2. Molecular basis of recognition of human osteopontin by 23C3， apotential therapeutic antibody for treatment of rheumatoid arthritis (—種潛在用於治療類風溼性關節炎的治療性抗體23C3識別人骨橋蛋白的分子基礎).Du J, HouS，Zhong C，Lai Z, Yang H，Dai J, Zhang D, Wang H，Guo Y，Ding J. (2008) J MolBiol. 382:835-842。3. Structure of CD40 ligand in complex with the Fab fragment of aneutralizing humanized antibody (與中和人源化抗體的Fab片段複合的⑶40配體的結構)o Karpusas M, Lucci J, Ferrant J, Benjamin C， Taylor FR， Strauch K， GarberE, Hsu YM. (2001) Structure. 4;9:321-329。4. Crystal structures of the pro-inflammatory cytokine interleukin-23and its complex with a high-affinity neutralizing antibody (促炎細胞因子白介素-23及其與高親和力中和抗體的複合物的晶體結構).Beyer BMj IngramR, Ramanathan L, Reichert P，Le HVj Madison V，Orth P. (2008) J Mol Biol. 382:942-955。5. Structure, function and properties of antibody binding sites (抗體結合部位的結構、功能和性質) Mian IS, Bradwell AR，Olson AJ. (1991) J Mol Biol.217:133-151。6. Atomic structure of an alphabeta T cell receptor (TCR) heterodimerin complex with an anti-TCR fab fragment derived from a mitogenic antibody (與來源於促有絲分裂抗體的抗TCR fab片段的複合的a ^ T細胞受體(TCR)異二聚體的原子結構)。Wang J, Lim K，Smolyar A，Teng M, Liu J, Tse AG，Liu J, Hussey RE, ChishtiY， Thomson CTj Sweet RMj Nathenson SG， Chang HCj Sacchettini JCj Reinherz EL(1998) EMBO J. 17:10-26。7. Mapping of a hapten-binding site: molecular modeling andsite-directed mutagenesis study of an anti-atrazine antibody (半抗原-結合部位的作圖抗阿特拉津抗體的分子建模和定點誘變研究).Kusharyoto W，Pleiss JjBachmann TTj Schmid RD. Protein Eng. (2002) 15:233-41。8. Structural basis for recognition of CD20 by therapeutic antibodyRituximab (治療性抗體利妥昔單抗識別⑶20的結構基礎).Du J, Wang H，Zhong C，Peng B，Zhang Mj Li B，Huo S，Guo Y，Ding J. (2007) J Biol Chem. 282:15073-80。9. The Crystal Structure of CD8 in Complex with YTS156. 7. 7 Fab andInteraction with Other CD8 Antibodies Define the Binding Mode of CD8 alphabetato MHC Class I (與YTS156. 7. 7 Fab複合的⑶8晶體結構和與其它⑶8抗體的相互作用限定 CD8 a 0 與MHC I 類的結合方式) Shore DA, Issafras H，Landais E, Teyton LjWilson IA. (2008) J Mol. Biol.待發表。抗體/抗原相互作用的分析顯示，Tyr更頻繁地與抗原決定簇相互作用，佔全部相互作用的約四分之一，接著是Ser，其負責相互作用的約14% (表2，圖2)。與Asn和Glu —起，這些4種胺基酸佔全部接觸的一半以上(56%)。抗原接觸性CDR胺基酸的這類偏倚允許產生用於鑑定最可能與抗原決定簇相互作用的CDR胺基酸的算法。簡單地說，根據本領域已知的和上文描述的方法來鑑定CDR區。對於具有已知晶體結構的抗體，可對結構進行分析以確定接觸抗原決定簇的CDR殘基。對於其結構未知或無法獲得的抗體，可根據表2和圖3所示頻率，確定可能參與抗原相互作用的CDR殘基。可通過 改變在能夠結合抗原的抗體中參與抗體/抗原接觸的一個或多個胺基酸(結合胺基酸)，來產生本發明親和力降低的抗體。可採用本領域已知的或本文描述的任何技術，包括但不限於晶體結構分析和胺基酸接觸頻率統計數據應用(表2和圖3)，來鑑定結合胺基酸。在一些實施方案中，至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個結合胺基酸被改變。在一些實施方案中，至少10%、25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%的結合胺基酸被改變。可採用破壞結合胺基酸與抗原形成接觸的能力的任何方法，包括但不限於用非結合胺基酸替換結合胺基酸和/或使結合胺基酸缺失，來進行結合胺基酸的改變。可通過結合胺基酸(其破壞結合胺基酸接觸抗原的能力)上遊或下遊胺基酸序列的缺失、替換或插入，來改變結合胺基酸。表2.⑶R胺基酸接觸性抗原決定簇的頻率。
權利要求
1.一種用於產生具有降低的結合能力的抗體或抗體片段的方法，所述方法包括以下步驟 a)獲得靶抗原的信息； b)合理鑑定抗體或抗體片段內能夠與靶抗原相互作用的一個或多個結合胺基酸； c)改變抗體或抗體片段內一個或多個結合胺基酸序列使得所得抗體或抗體片段具有降低的結合抗原的能力；和 d)測試經改變的抗體或抗體片段與靶抗原的結合親和力，使得經改變的抗體或抗體片段具有降低的與抗原結合的能力。
2.一種用於產生具有降低的特異性結合能力的互補決定區(CDR)的方法，所述方法包括以下步驟 a)從重鏈或輕鏈可變區、CDR多肽序列內鑑定CDR多肽序列中能夠與抗原相互作用的至少一個胺基酸；和 b)改變CDR多肽的胺基酸序列，以降低或消除與抗原的相互作用。
3.權利要求2的方法，其中CDR多肽序列中的胺基酸改變通過用非相互作用的胺基酸替換至少一個胺基酸來進行。
4.權利要求2的方法，其中一個胺基酸與抗原之間的相互作用是選自以下的分子吸引力氫鍵、弱的共價相互作用、極性力、非極性力、鹽橋和範德華力。
5.權利要求2的方法，其中所述CDR多肽序列中的胺基酸選自天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬醯胺、組氨酸和穀氨醯胺。
6.權利要求2的方法，其中所述CDR多肽序列中的胺基酸選自酪氨酸、絲氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。
7.權利要求3的方法，其中所述非相互作用的胺基酸選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。
8.權利要求6的方法，其中所述非相互作用的胺基酸是丙氨酸。
9.權利要求2的方法，其中鑑定相互作用的胺基酸的步驟通過分析描述CDR多肽序列和抗原之間的複合物的晶體結構來進行。
10.權利要求2的方法，其中所述CDR多肽序列位於抗體或抗體片段內。
11.權利要求10的方法，其中所述抗體或抗體片段選自 (a)完整的免疫球蛋白分子； (b)scFv ； (c)Fab 片段; (d)Fab，片段； (e)F(abf )2 ； (f)Fv ； (g)Fd片段；和 (h)二硫鍵連接的Fv。
12.權利要求10的方法，所述方法還包括驗證抗原結合喪失的步驟。
13.權利要求12的方法，其中所述驗證步驟通過FACS、ELISA或放射免疫測定法實現。
14.權利要求10的方法，其中所述抗體具有大於或等於約10_7的近似解離常數(Kd)。
15.權利要求10的結合能力降低的抗體。
16.一種用於產生具有降低的結合能力的抗體或抗體片段的方法，所述方法包括以下步驟 a)從抗體或抗體片段內鑑定能夠與抗原相互作用的至少一個胺基酸；和 b)改變抗體或抗體片段的胺基酸序列，以降低或消除與抗原的相互作用。
17.權利要求16的方法，其中抗體或抗體片段中的胺基酸改變通過用非相互作用的胺基酸替換至少一個胺基酸來進行。
18.權利要求16的方法，其中一個胺基酸與抗原之間的相互作用是選自以下的分子吸引力氫鍵、弱的共價相互作用、極性力、非極性力、鹽橋和範德華力。
19.權利要求16的方法，其中所述抗體或抗體片段中的胺基酸選自天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬醯胺、組氨酸和穀氨醯胺。
20.權利要求16的方法，其中所述抗體或抗體片段中的胺基酸選自酪氨酸、絲氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。
21.權利要求17的方法，其中所述非相互作用的胺基酸選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。
22.權利要求21的方法，其中所述非相互作用的胺基酸是丙氨酸。
23.權利要求16的方法，其中所述鑑定相互作用胺基酸的步驟通過分析描述抗體或抗體片段與抗原之間的複合物的晶體結構來進行。
24.權利要求16的方法，所述方法還包括驗證抗原結合喪失的步驟。
25.權利要求24的方法，其中所述驗證步驟通過FACS、ELISA或放射免疫測定法實現。
26.權利要求16的方法，其中所述抗體或抗體片段具有大於或等於約10_7的近似解離常數(Kd)。
27.權利要求16的方法，其中所述抗體或抗體片段選自 (a)完整的免疫球蛋白分子； (b)scFv ； (c)Fab 片段; (d)Fab，片段； (e)F(abf )2 ； (f)Fv ； (g)Fd片段；和 (h)二硫鍵連接的Fv。
28.權利要求16的結合能力降低的抗體或抗體片段。
全文摘要
本發明提供用於製備合理設計的親和力降低的新抗體的方法。本發明的方法製備這樣的抗體，其具有設計成在不改變總體三維抗體結構的情況下降低或消除親代抗體的抗原結合活性的可變結構域。使用在不同測定法中採用本發明方法製備的抗體允許研究人員將特異性抗原-抗體相互作用產生的作用與其它非特異性抗體作用區分。
文檔編號C07K16/28GK102971342SQ201180017079
公開日2013年3月13日 申請日期2011年1月28日 優先權日2010年1月28日
發明者張秀青 申請人:Ab生物科學公司