豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒及檢測方法與流程

2023-04-23 06:34:26

本發明屬於動物疾病分子生物學檢測
技術領域：
，具體涉及一種豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
：豬傳染性胃腸炎(transmissiblegastroenteritisofswine,tge)是由豬傳染性胃腸炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirusofswine,tgev)引起的一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特徵的高度傳染性疾病，美國1945年首次證實該病病原，世界動物衛生組織(oie)將其列為b類疾病中必檢的傳染病。我國至20世紀50年代首次報導以來，目前我國大部分地區都有該病發生流行，秋冬為該病高發期，各種不同品種和周齡的豬都能感染tgev病發病，其中以2周齡內仔豬發病後死亡率最高，高達100％；5周齡以上的仔豬感染傳染性胃腸炎後死亡率較低，但會影響仔豬後期的生長，降低仔豬的飼料利用率，是重要的豬病毒性腹瀉病之一，給養豬業帶來了嚴重危害。然而，該病原與豬流行性腹瀉病毒(pedv)、豬輪狀病毒(rv)、呼吸道冠狀病毒(prcv)等其他病原所引起的臨床症狀相似，僅通過流行病學和臨床症狀不能作出準確診斷，行之有效的實驗室診斷方法對該病發生和流行的控制起到了至關重要的作用。tgev屬於冠狀病毒科冠狀病毒屬，其基因組為大的單鏈正股rna，n基因編碼其核衣殼蛋白，在病毒複製、轉錄及致病性等方面具有重要作用，且基因結構高度保守，在疫苗應用及分子診斷方面均有較大價值。實驗室檢測tgev的方法很多，這些常規檢測方法在技術上雖然比較成熟，但目前尚存在一些問題：病毒的分離鑑定是確認該病原最準確的病原學診斷方法之一，一般大多數傳染病的確定都是依靠病原的分離鑑定。但此方法耗時時間長(7～10天)，且存在成本高、操作過程複雜等缺點，很難滿足臨床診斷所要求的時效性，主要應用於科學研究。電鏡技術檢測tgev也是常用的病原學診斷方法之一，但由於tgev與pedv豬呼吸道冠狀病毒等冠狀病毒形態相似，僅靠電鏡觀察無法鑑別診斷，免疫電鏡法可以更敏感確切地檢測臨床樣品或細胞培養物中的tgev，並可提供病毒血清學鑑定。然而，不管是常規電鏡檢測技術還是免疫電鏡檢測技術，都存在操作複雜，成本高，對儀器設備要求高等缺點。也可用血清中和試驗、酶聯免疫吸附試驗、免疫螢光法和免疫過氧化物酶技術等免疫學技術檢測tgev，特異性抗體的質量是免疫學檢測準確度的首要因素，而prcv與tgev的抗原性有一定的相關性，很易出現假陽性反應，是該技術應用於檢測tgev的重要缺點之一。常規rt-pcr方法是目前疫控中心、科研機構所普遍選用的tgev檢測方法，可免去病毒分離培養的過程，同時，檢測靈敏度和準確度都較常規病毒分離和免疫學診斷方法高，但該方法對儀器設備要求較高，操作複雜，擴增產物極易造成氣溶膠汙染，不適合在基層推廣，多重pcr方法亦存在相同的缺陷。螢光定量pcr雖可解決氣溶膠汙染的問題，但昂貴的儀器設備一般的檢測機構難易承受。lamp方法是另外一種分子檢測方法，該方法廉價、快速、靈敏度和特異度高，且因其恆溫擴增不需要pcr儀等昂貴設備，且可通過觀察擴增副產物的有無判斷擴增結果。但是，有研究表明通過擴增副產物觀察結果沒有電泳法靈敏，而如果開蓋電泳觀察結果又將大大增加氣溶膠汙染的可能性，且lamp擴增產物所引物的氣溶膠假陽汙染比常規pcr/rt-pcr更嚴重，因此，怎樣有效的檢測lamp的擴增產物是制約該技術發展的一大因素。基因晶片技術也是未來疾病快速診斷的一個發展方向，但是目前該技術還不成熟。因此，尚沒有一種操作簡單、成本低廉、檢測效果靈敏的檢測方法用來檢測tgev。交叉引物恆溫擴增技術(crossingprimingamplification,cpa)是一種新型核酸等溫擴增技術(專利號：200810134583.1)。該技術利用一種鏈置換dna聚合酶在62℃左右的恆溫條件下保溫1小時即可特異、快速、高效地完成核酸擴增反應。該技術與一些快速檢測技術結合(如快速檢測試紙條[專利號：200610003429.1]、一次性全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置[專利號：200610109620.4]等)，可以為現場快速分子檢測提供一個平臺，操作簡單，僅需一臺水浴鍋或金屬浴即可完成核酸擴增，其擴增產物用密閉的核酸檢測試紙條進行結果判定，檢測結果肉眼可見，且可有效避免氣溶膠汙染。簡便、快速、準確、靈敏，在食品安全檢測、傳染性病原檢測、日常病原監測、海關檢驗檢疫、突發公共衛生事業的戰略性技術儲備等領域有廣泛應用。技術實現要素：本發明要解決的技術問題為：現有技術缺乏一種操作簡單、成本低廉的檢測豬傳染性胃腸炎病毒的方法。本發明解決技術問題的技術方案為：提供一種豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒及檢測方法。本發明提供了一種豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒，包括：檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正向外圍引物f3、反向外圍引物b3、交叉引物cpr、正向探針df5f和反向探針df5b。其中，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，所述的正向外圍引物f3的核苷酸序列為seqidno.1所示核苷酸序列中的至少5個連續核苷酸。其中，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，所述的反向外圍引物b3的核苷酸序列為seqidno.2所示核苷酸序列中的至少5個連續核苷酸。其中，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，所述的交叉引物cpr的核苷酸序列為seqidno.3所示核苷酸序列中的至少5個連續核苷酸。其中，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，所述的正向探針df5f的核苷酸序列為seqidno.4所示核苷酸序列中的至少5個連續核苷酸，5』端標記有fam基團。其中，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，所述的反向探針df5b的核苷酸序列為seqidno.5所示核苷酸序列中的至少5個連續核苷酸，5』端標記有biotin基團。其中，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，所述核酸恆溫擴增反應液組成包括：每16μl中反應液中正向外圍引物f30.1～0.6μmol，反向外圍引物b30.1～0.6μmol，交叉引物cpr0.4～1.6μmol，正向探針df5f0.2～1μmol，反向探針df5b0.2～1μmol，mgso40～6mmol，dntp溶液0.1～0.6mmol，betaine0～1.5mol，gspf酶8u/μl4～12u，10×gspfbuffer2μl，amv0.02～0.5u，25×rnasecure0.8μl，餘量為雙蒸水。優選的，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，所述核酸恆溫擴增反應液組成包括：每16μl中反應液中正向外圍引物f30.1～0.3μmol，反向外圍引物b30.1～0.2μmol，交叉引物cpr0.9～1.0μmol，正向探針df5f0.3～0.4μmol，反向探針df5b0.7～0.8μmol，mgso41～3mmol，dntp溶液0.3～0.5mmol，betaine0.9～1.0mol，gspf酶8u/μl9～10u，10×gspfbuffer2μl，amv0.1～0.2u，25×rnasecure0.8μl，餘量為雙蒸水。更優選的，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，所述核酸恆溫擴增反應液組成包括：每16μl中反應液中正向外圍引物f30.26μmol，反向外圍引物b30.1μmol，交叉引物cpr1.0μmol，正向探針df5f0.4μmol，反向探針df5b0.8μmol，mgso42mmol，dntp溶液0.4mmol，betaine1.0mol，gspf酶8u/μl10u，10×gspfbuffer2μl，amv0.2u，25×rnasecure0.8μl，餘量為雙蒸水。更優選的，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，所述的10×gspfbuffer含有摩爾濃度為500mmtris-hcl(ph8.5,25℃)，300mmkcl，300mm(nh4)so4和1％tritonx-100。進一步的，上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒中，還包括陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為含有豬傳染性胃腸炎病毒n基因的dna片段，序列為seqidno.6所示，所述陰性對照為無菌雙蒸水。本發明還提供了一種採用上述豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒檢測病毒的方法，包括以下步驟：a、用rna提取試劑盒從待檢測的標本中提取rna；b、將提取的rna與豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒混合，在58～65℃下擴增反應30～90分鐘，15min後與對照對比判讀結果。其中，上述採用豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒檢測病毒的方法中，步驟a中所述的待檢測的標本包括豬腸繫膜淋巴結、空腸、小腸或腸內容物、糞便或肺中的一種。其中，上述採用豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒檢測病毒的方法中，步驟b為在63℃下擴增反應60分鐘。本發明的有益效果為：(1)相比傳統生理生化檢測方法，交叉引物核酸恆溫擴增技術適用於直接從待檢樣品中擴增靶基因，只需要一次恆溫擴增就能夠檢測豬傳染性胃腸炎病毒是否存在，大大提高了效率節約了時間，擴增時間僅為常規rt-pcr的1/3～1/2；(2)擴增產物通過可視化核酸薄膜層析快速檢測試紙條觀察結果，相比傳統的pcr擴增法，省去配膠、電泳、凝膠成像等繁瑣的操作程序，且不接觸有潛在致癌風險的核酸染料，同時，檢測試紙條置於全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置中，可有效避免氣溶膠汙染引起的假陽檢測；(3)可同時滿足高通量和低通量的樣品檢測；(4)本發明提供了一種對豬傳染性胃腸炎病毒的實時快速檢測和出入境檢驗檢疫的新技術，對提高我國豬傳染性胃腸炎病免疫防控水平、引種、常規監測、疾病淨化、疾病檢測等具有重要意義。附圖說明圖1所示為實施例5中tgev-pcr細胞毒rt-pcr擴增結果；圖2所示為實施例5中tgev-pcr質粒rt-pcr擴增結果。具體實施方式本發明提供了一種豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒，包括：檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正向外圍引物f3、反向外圍引物b3、交叉引物cpr、正向探針df5f和反向探針df5b。該試劑盒中，有兩條外圍引物、兩條檢測探針和一條交叉引物。本發明試劑盒中的5條寡核苷酸序列依靠gspf酶的高活性的鏈置換特性，使得鏈置換dna合成不斷的自我擴增循環。本發明試劑盒的交叉引物恆溫擴增反應有有3個階段，首先，交叉引物位點的引入，然後在恆溫下核酸片段的自我循環擴增，最後擴增產物的產生。由於兩條探針分別標記有fam基團和biotin基團，特異性擴增產物同時帶有生物素和fam標記，從而使得產物可在核酸試紙條中呈陽性而被檢出。本發明中所述的交叉擴增引物是指用於交叉擴增的主要引物，其中5』端末端序列與fam標記探針序列相同。外圍引物是指位於交叉擴增引物後方的短鏈引物，其作用是在鏈置換bstdna聚合酶或gspfdna聚合酶的作用下，將擴增產物的延伸鏈從模板上剝離。探針引物為檢測引物，是指用生物素或半抗原fam標記的短鏈引物，其作用是使擴增產物帶有標記，以用於檢測。半抗原fam是指用於檢測引物的化學物質，它們與相應的抗體特異性的結合，用於檢測擴增產物。為了更充分地解釋本發明的實施方法，提供了用於檢測豬傳染性胃腸炎病毒的cpa試劑盒的實施例。這些實施實例僅僅是解釋，而不是限制本發明要求保護的範圍。其中所用的原料均為普通市售。實施例1製備豬傳染性胃腸炎病毒質粒dna包括下列步驟：(1)利用兩條外圍引物seqid.1和seqid.2進行pcr擴增獲得目的基因；(2)對步驟(1)得到的pcr擴增產物進行純化；(3)將步驟(2)得到的純化後的擴增產物通過質粒轉染及時和構建完整的含有目的基因seqidno.6所示的質粒序列；(4)將所抽提的質粒定量並稀釋至106拷貝/μl，﹣20℃保存。其中，在步驟(2)中，採用takara的minibestagarosegeldna膠回收試劑盒對pcr擴增產物進行純化；在步驟(3)中採用takara的pmdtm18-tvectorcloning質粒轉染試劑盒。實施例2配製檢測豬傳染性胃腸炎病毒的試劑盒反應液包括以下步驟：(1)rna提取試劑：購自市場上的商品化柱式法totalrna小量提取試劑盒；(2)豬傳染性胃腸炎病毒核酸恆溫擴增反應液：正向外圍引物f3(seqidno.1)0.2μmol，反向外圍引物b3(seqidno.2)0.1μmol，正向探針df5f(seqidno.3)0.4μmol，正向探針df5f(seqidno.4的5』端連接標記基團fam基團)0.8μmol，交叉引物cpr(seqidno.5的5』端連接標記基團biotin基團)1μmol10×buffer，mgso42mmol，dntp溶液0.4mmol,betaine1mol,gspf酶10u、amv酶0.2u、25×rnasecure和無菌雙蒸水組成，總反應液體積為16μl。(3)實施例1製備的豬傳染性胃腸炎病毒質粒dna(seqidno.6)作為陽性對照，無菌雙蒸水作為陰性對照。其中，所有引物和探針均交由有資質的基因公司合成；gspf酶和10×gspfbuffer：購自neb公司；amv：要求65℃有活性的逆轉錄酶；dntp、rnasecure和無菌雙蒸水均為普通市售產品。實施例3用實施例2的試劑盒檢測豬傳染性胃腸炎病毒包括以下步驟：(1)用柱式法totalrna小量提取試劑盒從待檢測的標本(腸繫膜淋巴結、腸及內容物、糞便)中提取rna；(2)取標本rna作為模板加入到裝有反應液的pcr管中，在63℃擴增反應60分鐘，其中標本rna與復溶緩衝液的比例為1:4，標本添加量不低於4μl；對照pcr管中分別加入陽性對照模板和陰性對照模板；(3)將溫浴後的pcr管放置到一次性核酸檢測裝置中進行檢測，15分鐘以後判讀結果。當樣本中含有豬傳染性胃腸炎病毒核酸時，試紙條的檢測線上呈紅色條帶；注意無論怎樣，對照線都應為紅色條帶；(4)取另外兩批次試劑盒重複實驗2次，總共3次臨床樣本檢測試驗，結果如下表1所示。其中，「+++」表示強陽性，「+」表示陽性，「-」表示陰性。表1不同批號試劑盒檢測結果由實施例3可看出：3個批次的試劑盒檢測結果無顯著差異，說明本發明試劑盒的不同批次間的檢測結果具有可比性，具有良好的重複性。本發明的檢測方法重複性好，且僅需要2小時就可完成，大大縮短檢測時間，同時僅需一個人就可完成操作，節約人力和檢測成本。實施例4本發明試劑盒檢測豬傳染性胃腸炎病毒的專一性按照實施例3的方法檢測豬流行性腹瀉病毒(pedv)、豬輪狀病毒(rv)、豬瘟病毒(csfv)、高致病豬藍耳病毒(hp-prrsv)、豬偽狂犬病毒(prv)、豬圓環病毒2型(pcv2)、陽性對照品，檢測結果如下表2所示。其中，「+++」表示強陽性，「+」表示陽性，「-」表示陰性。表2本發明試劑盒檢測不同病毒的結果由表2可知：本發明試劑盒檢測豬傳染性胃腸炎病毒核酸具有很強的專一性。實施例5採用本發明試劑盒檢測和pcr測定方法的靈敏度對比包括以下步驟：(1)將致弱的tgev華毒株(hstrain)細胞毒用生理鹽水依次作10倍梯度稀釋，然後按照實施例3的方法提取核酸後擴增、檢測，以確定本發明試劑盒用於檢測豬傳染性胃腸炎病毒核酸的靈敏度。擴增反應結束，取反應管於檢測裝置中，合上裝置，靜置15min觀察結果，陽性結果顯示為ct線處均為紅色條帶，陰性結果顯示僅c線處為紅色條帶，用本發明試劑盒檢測豬傳染性胃腸炎病毒的最低可以檢測到74tcid50/ml。將製備的tgev陽性對照質粒用用生理鹽水依次作10倍梯度稀釋，然後按照實施例3的方法對不同濃度質粒進行擴增、檢測，以確定本發明試劑盒用於檢測豬傳染性胃腸炎病毒陽性質粒的檢測限。擴增反應結束，取反應管於檢測裝置中，合上裝置，靜置15min觀察結果，陽性結果顯示為ct線處均為紅色條帶，陰性結果顯示僅c線處為紅色條帶，用本發明試劑盒檢測豬傳染性胃腸炎病毒的最低可以檢測到45copies/μl。(2)rt-pcr方法：擴增用引物：選用cpa擴增的正向外圍引物f3和反向外圍引物b3rt～pcr反應為20μl體系:擴增程序為：50℃30min擴增樣本：為上述不同稀釋度的致弱的tgev華毒株(hstrain)細胞毒核酸和不同濃度陽性質粒。rt-pcr產物取10μl於2％瓊脂糖凝膠電泳，100v電壓下40min，通過凝膠成像系統觀察，rt-pcr方法最低可以檢測到740tcid50/ml(圖1)，450copies/μl(圖2)。本發明方法與pcr方法的對比結果如下表3所示。其中，「+++」表示強陽性，「+」表示陽性，「-」表示陰性。表3採用不同方法檢測結果從實施例5的結果可知：本發明的方法靈敏度明顯高於rt-pcr方法的敏感度，能檢測出豬傳染性胃腸炎病毒含量更低的樣品。實施例6試劑盒反應液濃度摸索實驗包括以下步驟：(1)按照實施例2的方法配製豬傳染性胃腸炎病毒核酸恆溫擴增反應液，根據反應液中各成分的濃度不同分為a、b、c三組，每組反應液濃度如下表4所示。表4不同反應液濃度的試劑盒組a組b組c正向外圍引物f30.2μmol0.3μmol0.1μmol反向外圍引物b30.1μmol0.2μmol0.1μmol交叉引物cpr1μmol1μmol0.9μmol正向探針df5f0.4μmol0.4μmol0.3μmol反向探針df5b0.8μmol0.8μmol0.7μmolmgso42mmol3mmol1mmoldntp溶液0.4mmol0.5mmol0.3mmolbetaine1mol1mol0.9molgspf酶8u/μl10u10u9u10×gspfbuffer2μl2μl2μlamv0.2u0.2u0.1u25×rnasecure0.8μl0.8μl0.8μl無菌雙蒸水補足到16μl補足到16μl補足到16μl(2)將致弱的tgev華毒株(hstrain)細胞毒用生理鹽水依次作10倍梯度稀釋，按照實施例3的方法提取核酸，分別用上述組a、組b、組c的體系擴增後檢測，以確定本發明試劑盒中最優體系與次優體系檢測檢測豬傳染性胃腸炎病毒核酸的靈敏度。擴增反應結束，取反應管於檢測裝置中，合上裝置，靜置15min觀察結果，陽性結果顯示為ct線處均為紅色條帶，陰性結果顯示僅c線處為紅色條帶，詳細結果見下表5。其中，其中，「+++」表示強陽性，「+」表示陽性，「+/-」表示弱陽性，「-」表示陰性。表5採用不同組成的試劑盒靈敏度分析從表5結果可見，組a體系(即本發明試劑盒最優體系)檢測豬傳染性胃腸炎病毒的最低可以檢測到74tcid50/ml，組b和組c體系檢測豬傳染性胃腸炎病毒的最低可檢測限較組a差，為740tcid50/ml。由上述試驗可知，本發明提供了一種利用核酸恆溫擴增檢測豬傳染性胃腸炎病毒的試劑盒，對不同的反應條件進行了優化，如引物和探針的濃度，mg2+濃度，反應溫度等的優化，並將本發明與核酸檢測試紙條檢測系統相結合，建立了豬傳染性胃腸炎病毒核酸恆溫擴增定性檢測的方法。該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢測45copies/μl，可以滿足快速檢測豬傳染性胃腸炎病毒的要求，具有重要的意義。sequencelisting四川納比生物科技有限公司;杭州優思達生物技術有限公司豬傳染性胃腸炎病毒檢測試劑盒及檢測方法a1705876patentinversion3.5119dnaartificialsequence正向外圍引物f3的核苷酸序列1caatgggagcagtgccaag19222dnaartificialsequence反向外圍引物b3的核苷酸序列2taatctgctgaaggaattgttc22341dnaartificialsequence交叉引物cpr的核苷酸序列3attggctgaatgtgttcctggcaagtggtatttgtgtgtga41418dnaartificialsequence正向探針df5f的核苷酸序列4attggctgaatgtgttcc18522dnaartificialsequence反向探針df5b的核苷酸序列5tctgtgtctagcattttgtttg226182dnaartificialsequence豬傳染性胃腸炎病毒質粒dna的核苷酸序列6caatgggagcagtgccaagcattacccacaattggctgaatgtgttccatctgtgtctag60cattttgtttggaagctattggacttcaaaggaagatggcgaccagatagaagtcacgtt120cacacacaaataccacttgccaaaggatgatcctaaaactgaacaattccttcagcagat180ta182當前第1頁12