抗j亞群禽白血病的多克隆抗體及其製備方法

2023-04-23 02:20:41 1

專利名稱：抗j亞群禽白血病的多克隆抗體及其製備方法
抗J亞群禽白血病的多克隆抗體及其製備方法
(-)技術領域 本發明涉及一種抗J亞群禽白血病的多克隆抗體及其製備方法 背景技術：
J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一種腫瘤性疾病。ALV-J 是具有囊膜的反轉錄病毒，禽臨床感染主要表現為髓細胞瘤、免疫耐受、高死亡率和生長遲 緩。1997-1998年間，ALV-J呈全球性爆發，對世界肉種雞業造成了毀滅性打擊。ALV-J感 染除引起髓細胞瘤外，成紅細胞瘤、血管瘤、腎瘤和肉瘤常在感染後期伴隨發生，通常死亡 率為-5%，高峰期可達50%。研究證實，ALV-J對免疫應答具有持久損害作用，使生產 力低下，繼發感染和混合感染頻發，J亞群禽白血病爆發對養殖業將產生重大的危害。1、J亞群禽白血病在我國頻發我國白羽肉種雞均從國外引進，且未對新出現的ALV-J採取任何防範措施，加之 我國的養殖條件相對落後，使ALV-J在我國造成的損失高於其它任何國家。2000年，J亞群 禽白血病在我國白羽肉種雞中全面爆發，造成了巨大的經濟損失；2002-2005年間，ALV-J 病毒突破種間屏障，造成廣東、廣西三黃雞群、中國麻雞群中爆發J亞群禽白血病，使許多 養殖場倒閉；2007年，和J亞群禽白血病密切相關的血管瘤病在蛋種雞群及商品蛋雞群中 爆發，並很快席捲全國。禽白血病J亞群在我國禽群發生具有如下特點(1)感染率及發病率居高不下。近10年來，在肉種雞、蛋種雞中感染率均在10% 左右ο(2)早期感染普遍、發病日齡明顯提前。目前在青年雞群或開產前的雞群中禽J亞 群白血病已成為常見病。(3)混合感染促使病毒重組頻率增高。調查顯示，禽白血病與馬立克氏病、網狀內 皮組織增殖病的混合感染日趨嚴重，為臨床診斷帶來了困難。(4)宿主範圍擴展。爆發血管瘤的蛋雞、我國特有雞種麻雞、柴雞及蘆花雞中也檢 出了 ALV-J。這表明J亞群白血病正在向蛋雞、地方雞種傳播，其宿主範圍正在明顯擴大。(5)腫瘤趨於多樣化。目前，我國感染禽群中出現了諸多以前罕見的腫瘤，如血管 瘤、成紅細胞瘤、肝細胞癌、腺癌、纖維瘤、纖維肉瘤、皮膚癌和輸卵管癌等。(6)致病性增強。許多在蛋雞及地方雞中發現的腫瘤要比之前肉種雞中的病變更 為嚴重，在肉雞體的某些器官體內從未見過髓細胞瘤，而在蛋雞中比較常見，如頸部髓細胞 瘤、腰薦髓細胞瘤、腸髓細胞瘤等。2、J亞群禽白血病的防控研究現狀一直以來，由於ALV-J病毒自身的特殊性以及引起疾病的複雜性，對ALV-J的防治 研究未見顯著成，至今無控制ALV-J的有效方法和防治ALV-J感染的藥物、疫苗。對ALV-J的防控，發達國家主要採取淨化淘汰，1997-1998年，全球爆發ALV-J後， 世界4大養禽公司先後投入巨資研究防制ALV-J策略，最終制定出一整套嚴格的淨化措施， 逐步控制了 ALV-J的持續爆發；2002年後，ALV-J祖代種雞群中已經基本淨化乾淨，但在商品肉雞中還有零星的爆發，其每周平均發病率仍在1. 5%左右。控制ALV-J是一個長期不懈 的工作。大範圍的全面淨化也帶來了一些問題，除養殖成本大量增加外，最潛在的影響是促 進了 ALV-J的進化。在目前狀況下，我國對J亞群禽白血病基本上沒有行之有效的防控措施，政府沒 有補貼，也沒有哪個公司能承擔得起高昂的淨化費用，由於ALV-J本身的特點及我國的養 殖現狀，生物安全措施對其收效甚微。同時，不科學、不合理的淨化措施，還會加速病毒的突 變和進化，使疾病癒加複雜。由於ALV-J為囊膜病毒，並且病毒囊膜決定了病毒的抗原性，而抗原性又有不斷 變動的特點，使之成為禽白血病疫苗研製無法逾越的瓶頸，因此，抗J亞群白血病的藥物的 研製成為目前的焦點和熱點。

發明內容
本發明的目的是提供一種抗J亞群禽白血病的多克隆抗體及其製備方法，為J亞 群禽白血病的防治提供新的有效手段，降低養禽業因ALV-J感染而造成的經濟損失。本發明的主要內容ISU(免疫抑制區)小肽合成；偶聯；抗原乳化，免疫兔子；抗 體效價檢測；收集血清獲得多克隆抗體無菌保存。根據前期研究基礎確定gp37基因保守序列，按此序列合成ISU小肽並且將小肽分 別與鑰孔戚血藍素(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶聯。取磷酸鹽緩衝溶液(PBS)稀釋的ISU小肽-KLH偶聯物，與等量的完全弗氏佐劑充 分乳化，在兔頸部或背部皮下注射，每隻兔按抗原100-500 μ g的劑量注射。首免3-4周後 第一次加強免疫，每隻兔免疫的抗原劑量同第一次免疫，用不完全弗氏佐劑充分乳化；以後 每隔1-3周加強免疫1次；從第1次加強免疫開始，每次免疫後7-10天，經耳靜脈或者耳動 脈採血測定抗體的效價，經過加強免疫檢測符合要求後，頸靜脈採血，分離血清獲得多克隆 抗體，-20°C無菌分裝保存。所述ISU小肽偶聯物保存溫度為4°C，經PBS稀釋後的ISU小肽偶聯物保存溫度 為-20 0C ο與現有技術相比，本發明的優點是1、本發明所製備的多克隆抗體可以有效抑制J亞群禽白血病病毒的感染，並且不 會因J亞群禽白血病病毒變異而失去其有效性，這在國內外尚屬首次。2、本發明製備的多克隆抗體具有特異性強、高效抗病毒作用、性質穩定、保質期長 等優點。3、本發明解決了養禽業有效控制J亞群禽白血病病毒感染的難題，為養禽業防治 J亞群禽白血病開創了新的局面，可以大幅度降低J亞群禽白血病造成的直接和間接經濟 損失，這是現有禽白血病的防治手段所不能達到的效果。


圖1為本發明新產 品生產工藝流程圖。圖中1是ISU小肽合成，2是ISU小肽偶聯，3是小肽偶聯物乳化，4是免疫動物，5 是效價檢測，6是頸靜脈採血，7是血清分離，8是多克隆抗體。
圖2為間接免疫螢光(IFA)檢測結果A為接病毒加多抗的螢光檢測；B為未接病 毒加多抗的螢光檢測；C為未接病毒未加多抗的陰性對照。圖中B的結果說明了本發明的多抗可以與細胞核非特異性的結合，阻斷了病毒的 複製。圖中A說明了本發明多抗和ALV產生了特異性結合的效果。圖3為螢光定量PCR檢測結果圖柱1為先加多抗後接種ALV-J ；圖柱2為先接種 ALV-J後加多抗；圖柱3為僅接種ALV-J ；圖柱4為正常對照。實驗結果是按2_Δ ΔΕ 計算方 法進行分析的。
圖中結果說明了本發明對ALV-J產生了良好的抗病毒效果。 具體實施例方式下面將結合附圖對多克隆抗體的生產作進一步的詳細說明。1、根據前期研究基礎確定gp37基因保守序列為LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF， 按此序列由北京中科亞光生物科技有限公司合成ISU小肽並且將小肽分別與KLH和BSA偶 聯，採用高效液相色譜法(HPLC)法進行合成純化鑑定，純度達到97%以上，十二烷基硫酸 鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法鑑定偶聯效果良好。2、選用1. 5個月左右，雄性健壯，體重2Kg左右的紐西蘭大白兔，免疫前先耳靜脈 採血分離血清儲存備用作為效價檢測陰性對照，飼養7天待動物適應環境後，開始進行免 疫。3、取用PBS稀釋的ISU小肽-KLH偶聯物0. 5-1. 0ml，與等量的完全弗氏佐劑充分 乳化，在兔頸部或者背部皮下6-12點注射，每點0. 1-0. 2ml，每隻兔按抗原100-500 μ g的劑
量注射。4、首免3-4周後進行第一次加強免疫，每隻兔免疫抗原的劑量同第一次免疫，用 不完全弗氏佐劑充分乳化，於兔頸部或者背部皮下6-12點注射；以後每隔1-3周加強免疫 1次。5、從第1次加強免疫開始，每次免疫後7-10天，經耳靜脈或者耳動脈採血2_4ml， 採用間接酶聯免疫吸附法(ELISA)測定抗體的效價，偶聯BSA的ISU小肽在間接ELISA檢 測法中作為抗原應用。6、在第四次加強免疫後檢測效價達到6. 4 X IO4-L 28 X IO5之間(如表1)，符合要 求，頸靜脈採血，分離血清，無菌分裝-20°C保存。表1間接ELISA測定多克隆抗體效價的數據 注P/N≥2為陽性，P/N =(陽性平均值_空白值)/(陰性平均值_空白值)突破病毒的免疫抑制是對抗禽白血病病毒感染的關鍵所在，我們在執行國家自然基金項目「跨膜蛋白(TM)主要功能區在ALV感染、免疫中的作用」過程中發現，由gp37基 因編碼的TM蛋白在病毒感染及免疫抑制中起決定作用，其中TM蛋白亞單位內27個胺基酸 組成的高度保守序列發揮著關鍵作用，且這一高度保守序列不存在毒株之間的差異性，本 發明以此為基礎，研製出了有效抑制J亞群禽白血病病毒感染的多克隆抗體。
該多克隆抗體應用於禽白血病的防治，可以大幅度降低養禽 業因ALV-J感染而造 成的經濟損失，為禽白血病的防控提供有力的技術保障，同時開創了禽腫瘤性病毒防治研 究的新思路。
權利要求
一種抗J亞群禽白血病的多克隆抗體及其製備方法，其特徵在於按確定的gp37基因編碼的跨膜蛋白內27個胺基酸組成的高度保守序列合成免疫抑制區小肽，並且將小肽分別與鑰孔戚血藍素和牛血清白蛋白偶聯，採用高效液相色譜法進行合成純化鑑定，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳方法鑑定偶聯效果；選用1.5個月左右，雄性健壯，體重2Kg左右的紐西蘭大白兔，取磷酸鹽緩衝溶液稀釋的免疫抑制區小肽-鑰孔戚血藍素偶聯物0.5-1.0ml，與等量的完全弗氏佐劑充分乳化，在兔頸部或背部皮下6-12點注射，每點0.1-0.2ml，每隻兔按抗原100-500μg的劑量注射；首免3-4周後第一次加強免疫，每隻兔抗原劑量同第一次免疫，用不完全弗氏佐劑充分乳化，於兔頸部或者背部皮下6-12點注射，以後每隔1-3周加強免疫1次，從第1次加強免疫開始，每次免疫後7-10天，經耳靜脈或者耳動脈採血2-4ml採用間接酶聯免疫吸附法測定抗體的效價，經過加強免疫檢測符合要求後，頸靜脈採血，分離血清獲得多克隆抗體，-20℃無菌分裝保存。
全文摘要
本發明涉及一種抗J亞群禽白血病的多克隆抗體及其製備方法，該多克隆抗體能夠有效抑制J亞群禽白血病病毒的感染。所述多克隆抗體是基於禽J亞群白血病病毒gp 37基因編碼的跨膜蛋白內27個胺基酸組成的高度保守序列合成小肽，通過偶聯鑰孔戚血藍素免疫兔子獲得的，該多克隆抗體具有與細胞核非特異性結合阻斷侵入的J亞群禽白血病病毒的複製、以及與J亞群禽白血病病毒特異性結合併予以消除的特點，有效地防治了J亞群禽白血病發生和傳播，進而大幅度地降低了養禽業因J亞群禽白血病病毒感染而造成的經濟損失，為禽白血病防控提供了新的方法和思路。
文檔編號C07K16/06GK101863977SQ20101017309
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者張利, 成子強, 王峰, 王曉偉 申請人:山東農業大學