改良的凝血因子調節物的製作方法
2023-04-23 01:52:36 2
專利名稱:改良的凝血因子調節物的製作方法
改良的凝血因子調節物
本申請是申請號為200580019913. 7 (國際申請號為PCT/US2005/013926)、申請日為2005年4月22日、發明名稱為「改良的凝血因子調節物」的中國專利申請的分案申請。
發明領域
本申請要求2004年4月22日提交的美國臨時申請第60/564，873號的優先權。
本發明是改良藥物、組合物以及用核酸配體(例如適體)調節凝血因子藥理學活性的方法。
背景技術：
儘管治療和預防血栓形成事件相當努力，但動脈血栓形成仍舊是發達國家成年人群的主要死因。雖然存在眾多治療血栓形成的醫療策略，但沒有藥物能滿足生物利用度和效力二者的治療終點，同時又具有合理的安全特性(參見Feuerstein等(1999)Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19:2554-2562)。
在正常環境下，對鋪襯血管的血管內皮細胞的傷害通過一系列通常稱為凝血「級聯」的事件觸發止血反應。級聯最終將可溶性纖維蛋白原轉變成不溶性纖維蛋白，其與血小板一起形成局部凝塊或血栓，阻止血管外釋放血液組分。然後，可發生傷口癒合，接著凝塊溶解，並恢復血管完整性 和流量。
凝血的發生起因於兩個不同的途徑內在途徑和外在途徑。可通過使血液攜帶的因子接觸人造負電荷表面(如玻璃)體外觸發內在途徑。相反，當受傷後一般與循環系統隔絕的組織因子(TF)開始接觸血液時，可體內或體外啟動外在途徑。接觸血液的TF作為VIIa因子(「FVIIa」)的輔因子，催化IX因子(「FIX」)和X因子(「FX」)活化。這導致快速形成FXa和凝血酶，其隨後聚合，形成纖維蛋白凝塊。內在途徑和外在途徑二者的特徵在於在前凝血劑表面上組裝多種蛋白複合物，這使對傷害部位的反應局部化(參見Mann，K.G.等(1990)Blood 76:1)。
抗凝療法
香豆素藥物，例如華法林以及糖胺聚糖、肝素和硫酸乙醯肝素，經常用作抗凝血齊U。華法林是一種香豆素衍生物，通過與凝血酶原和其它維生素K依賴性凝血因子的維生素K依賴性翻譯後修飾競爭起作用。其作用比肝素稍微慢，持久作用稍微長。香豆素藥物通過抑制凝血酶與VI1、IX和X因子以及蛋白C和S的功能所必需的維生素K依賴性羧化反應來抑制凝血。這些藥物通過抑制維生素K的醌衍生物還原為其活性氫醌形式而起作用。因為香豆素藥物的作用模式，所以實現其最大作用需要幾天。肝素結合併活化抗凝血酶III，其然後抑制凝血級聯的絲氨酸蛋白酶。肝素和LMW肝素部分地由於其效力而存在缺點。在達7%的接受持續輸注的患者中和達14%的給予間歇性推注單次劑量的患者中，觀察到的主要併發症是不受控的出血。達到效力而沒有置患者於出血風險的治療範圍狹窄，約I至小於3 μ g肝素/ml血漿。在4 μ g/ml以上的肝素濃度未檢測到凝血活性。因此，必須非常小心地將患者的血漿濃度保持在治療範圍內。[0009]有些團隊使用凝血因子抗體調節凝血級聯。例如授予ScheringAktiengesellschaft的PCT公開號WO 03/093422公開了以比對單獨組織因子(TF)大的親和力結合VIIa因子/組織因子(FVIIa/TF)複合物的抗體。宣稱這些抗體不與VII因子和X因子競爭結合組織因子，並抑制FX活化。
授予Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc.的美國專利第6，001，820號提供了肝素輔因子II特異性催化劑，其能夠(I)選擇性失活結合凝塊中纖維蛋白或某些其它表面的凝血酶，但對游離凝血酶僅具有最小抑制活性；(2)抑制內在Tenase複合物組裝，和由此的通過IXa因子活化X因子；和(3)抑制通過XIa因子活化IX因子。
適體
常規上一般認為核酸在生物過程中主要起提供信息的作用。在過去的十年，已經清楚核酸的三維結構可帶給其與蛋白相互作用並調節蛋白的能力。這種核酸配體或「適體」是可以高親和性和特異性結合特定配體的短DNA或RNA寡聚體。作為一個類別，適體的三維結構是充分可變的，以允許適體結合和充當實際上任意化合物的配體，無論是單體還是聚體。適體已顯現為有前景的新診斷和治療化合物，特別是在癌症治療和凝血調節中。
可通過稱為指數富集配體系統進化(SELEX)的方法的相關方法鑑別核酸配體。SELEX包括由候選寡核苷酸混合物中選擇結合蛋白的核酸，並逐步地疊代結合、分配和擴增，以達到需要的結合親和性和選擇性標準。SELEX法首先由Gold和Tuerk描述於美國專利第5，475，096號，此後描述於美`國專利第5，270，163號(另參見WO 91/19813 ；Tuerk ^(1990)Science 249:505-10)。
許多第三方已申請和保護覆蓋適體鑑別、生產和使用的專利。如上所述，一般把分離適體的SELEX法的首先開發歸功於Gold和Tuerk，其方法在許多美國專利中都有描述，包括美國專利第 5，670，637,5, 696，249,5, 843，653,6, 110，900 和 5，270，163 號。ThomasBruice等在美國專利第5，686，242號中報導了適體生產方法，該方法與Tuerk和Gold報導的原型SELEX法不同，因為其在序列篩選過程中使用嚴格隨機寡核苷酸。在『242專利中篩選的寡核苷酸沒有在SELEX法篩選的寡核苷酸中存在的寡核苷酸引物。
幾個授予Gold等的專利包含覆蓋凝血酶適體的權利要求
。例如，美國專利第5，670，637號包含覆蓋結合蛋白的適體的權利要求
。美國專利第5，696，249號要求保護通過SELEX法生產的適體。授予O』Toole的美國專利第5，756，291和5，582，981號公開並要求保護一種使用含限定6核苷酸序列的標記適體檢測凝血酶的方法。美國專利第5，476，766和6，177，557號公開了使用SELEX鑑別凝血酶的核酸配體溶液的化合物和方法。
Sullenger, Rusconi, Kontos 和 White 在 WO 02/26932 中描述了與在止血和其它生物事件的調節中有用的凝血因子、E2F家族轉錄因子、AngU Ang2及其片段或肽、轉錄因子、自身免疫抗體和細胞表面受體結合的RNA適體。另參見Rusconi等，Thrombosis andHaemostasis 83:841-848 (2000)，White 等，J. Clin Invest 106:929-34 (2000)，Ishizaki等，Nat Med 2:1386-1389(1996)和 Lee 等，Nat. Biotechnol. 15:41-45 (1997))。
適體的調節
授予Duke University的PCT公開號WO 02/096926描述了通過給予調節劑調節核酸配體生物活性的物質和方法。說明書描述了由可為核酸的調節物控制的適體。據描述，可調節適體可用於治療其中抑制凝血、延伸因子2活性或血管生成很重要的疾病。控制凝血的可調節適體包括凝血因子VII或VIIa、VIII或VIIIa、IX或IXa、V或Va、X或Xa、與這些因子形成的複合物以及血小板受體的適體。調節物可改變核酸配體對其靶的結合，降解或以其它方式切割、代謝或分解核酸配體，同時配體發揮其作用。調節物可基於各種因素按照需要實時給予，這些因素包括患者的病情發展以及醫師對如何實現最佳治療的判斷。
最大化適體的應用
為了使適體成為有用的治療劑，其應當緊密結合蛋白、抑制該蛋白的特定功能(如果需要拮抗劑的話)以及沒有有害的副作用。未修飾的RNA實際上不能用作治療劑，因為血液富含核糖核酸酶。對單鏈RNA和DNA的某些修飾可產生在血液中穩定的分子，某些已知適體在各個嘧啶核苷酸中具有2』 F或2』 NH2基團。
但是，沒有手段來預測具體的修飾如何改變適體。具體地說，當需要額外限制時(可調節適體的情況就是這樣)，沒有技術來預測一種或多種修飾如何可影響適體調節其配體的能力，同時繼續受解毒劑結合的調節。
適體成功用作治療劑不僅取決於其效力和特異性，而且取決於經濟性。由目前可用適體的最成功的動物實驗外推，l-2mg/kg體重的適體劑量通常是有效劑量(源自對抑制VEGF, PDGF, L-選擇蛋白和P-選擇蛋白的適體進行的實驗)。對於70kg的成年人，這意味著每次注射劑量應為70-140mg。對於急性適應症，例如器官移植、心肌梗死、中毒性或膿毒性休克、血管成形術或肺栓塞，15天中每3天治療一次會涉及$700-$1400的藥物成本。顯然，對於慢性適應症，藥物成本是個問題。因此，有需要降低適體的生產成本。
已開發了幾種方法來改良基礎SELEX方法，以獲得修飾的適體。例如，專利公開了在SELEX法中使用修飾的核苷酸，以獲得表現出改良特性的適體。美國專利第5，660，985號提供了宣稱表現出增強的體內穩定性的2,-修飾核苷酸。美國專利第6，083，696號公開了「混合的」 SELEX法，其中篩選共價連接至非核酸功能單位的寡核苷酸結合靶分子的能力。其它專利描述了對適體的SELEX後修飾，以降低其大小、增加其穩定性或增加靶結合親和性(參見例如美國專利第5，817，785和5，648，214號)。
在美國專利第5，245，022號中，Weis等公開了約12_25個鹼基的寡核苷酸，其末端被聚亞烷基二醇取代。這些修飾的寡核苷酸據報導對外切核酸酶活性有抗性。
授予Cook等的美國專利第5，670，633和6，005，087號描述了熱穩定的2'-氟代寡核苷酸，其與RNA或DNA鹼基序列互補。授予Cook等的美國專利第6，222，025和5，760，202號描述了含修飾嘧啶的2' _0取代嘧啶和寡聚物。EP 0593901B1公開了具有末端3'，3'-和5'，5'-核苷鍵的 寡核苷酸和核酶類似物。授予Gold等的美國專利第6，011，020號公開並要求保護由聚乙二醇修飾的適體。
目前，對於需要抗凝血治療的患者，仍強烈需要提供治療方法和組合物，具體地說是在手術或其它醫學幹預過程中。
因此，本發明的一個目標是為有抗凝血治療需要的患者提供治療方法和組合物，具體地說是在手術或其它醫學幹預過程中。
本發明的另一個目標是提供對抗凝療法的治療作用、藥動學和活性時程的更多控制。
發明內容
本發明公開了用於抗凝治療的改良核酸配體以及與解毒劑組合的改良核酸配體，其中解毒劑改變核酸配體與其靶的結合，或者降解或以其它方式切割、代謝或分解核酸配體，同時配體仍發揮其作用。這些改良適體提供對體內應用更有利的抗凝特性，包括在人或畜手術過程中。當外科醫生或其它醫療專家需要時，給予其解毒劑可便利地中和改良適體的抗凝功能。
在本發明的一個方面，提供凝血級聯中因子的改良核酸配體或適體。在某些實施方案中，所述因子包括IX因子(Fix)或切割產物IXa因子(FIXa)。在某些實施方案中，所述適體是由FIXa和VIIIa因子(FVIIIa)形成的複合物(也稱為「內在Tenase複合物」)的配體。在某些實施方案中，適體是抑制FIXa和FVIIIa之間形成複合物的配體。在一個子實施方案中，本發明的適體結合FIX和FVIIIa的複合物，並抑制X因子(FX)活化。在有或沒有另外的鈣存在時，適體可與FIX、FIXa或FIXa與FVIIIa形成的複合物相互作用。適體還可與細胞膜處的複合物的因子相互作用。在一個實施方案中，適體結合在膜表面的內在Tenase複合物。
·[0031]在本發明的另一方面，申請人已發現凝血因子IX(FIX)基因產物及其切割產物IXa因子(FIXa)的改良適體。在一個實施方案中，核酸配體包含至少一個通過Watson-Crick鹼基配對結合分子中的另一個區的區(莖),和至少一個在生理條件下不結合分子中的任何其它區的區(環)。在另一個實施方案中，核酸配體包含兩個莖(莖I和莖2)和兩個環(環I和環2)。通常，莖I為1-15或1-20個核苷酸對長。莖I還可為10、9、
8、7、6、5、4、3或2個核苷酸長。一般來說，莖2為1_10個核苷酸長。莖2還可為9、8、7、6、
5、4、3或2個核苷酸長。環I和環2的長度也是可變的。環2可為10個核苷酸長，但也可為8個或8個以下核苷酸長，包括7、6、5、4、3或2個核苷酸長。環I的長度也是可變的，在一個實施方案中其在5' -3'方向包含10或9個核苷酸，3' -5'方向包含I個核苷酸。
本發明IX因子基因產物的適體可包含核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其組合。一般來說，改良適體為至少25個核苷酸長,通常不長於35-40個核苷酸。在一個實施方案中，適體至少為25、30、35或40個核苷酸長。在具體的實施方案中，莖I的序列在5' -3'方向含5個核苷酸。在一個子實施方案中，莖I在5' -3'方向含3個鳥嘌呤(G)殘基。
改良適體可包括「自殺位置」。在一個實施方案中，當解毒劑與改良適體結合時，該位置變成單鏈和不穩定的，並在解毒劑結合時允許循環中的酶(例如血液或肝核酸內切酶)切割改良適體，由此有效消除循環中的活性適體。自殺位置可位於莖2中羥化的鳥嘌呤處。在一個實施方案中，該核苷酸為雙鏈構型，直至與解毒劑結合該核苷酸才變成單鏈的，並可在解毒劑結合時用於切割。
在一個實施方案中，適體包含核苷酸序列gugg和互補序列ccac。在一個實施方案中，IX因子的適體包含核苷酸序列gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t (SeqID19)。
本發明的另一個實施方案包括與本發明適體成對的解毒劑寡核苷酸。解毒劑寡核苷酸可與適體的至少一部分互補。解毒劑例如可包含以下序列(5』-3』)序列cgcgguauaguccccau(Apt/AD ；SEQ ID NO:1) ； (5' -3')序列cgcgguauaguccc(Apt6/AD ;SEQ ID NO: 2) ; (5，-3，)序列cgcgguauaguccac (Apt7/AD ；SEQ ID NO: 3) ; (5，-3，)序列cgcgguauaguccauc (Apt8/AD ；SEQ ID NO :4) ； (5' -3')序
SEQ ID NO:5) ; (5，-3，)序列cgcgguauagucagg(AP 110/AD ；SEQ ID NO:6) ; (5，-3，)序列cgcgguauagucagag(Aptll/AD ；SEQ ID NO:7) ； (5' -3')序列cgcgguauaguccucac (Aptl4/AD ；SEQ ID NO: 8)，或其任意修飾物或衍生物。在某些實施方案中，解毒劑基本由以上的一種序列組成，或完全由以上的一種序列組成。
解毒劑序列不需要與改良抗凝適體完全互補，只要解毒劑與適體成功結合或雜交，以中和其活性。
本發明的適體對包括以下序列
權利要求
1.一種分離的核酸配體，其核酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
2.權利要求
1的核酸配體，被至少一個2』-O-甲基核苷酸修飾或至少一個2』 -氟代核苷酸修飾所修飾。
3.權利要求
1的核酸配體，其中如SEQID NO: 17所示的核酸配體中的至少一個尿苷被2』 -氟代核苷酸修飾或2』 -O-甲基核苷酸修飾所修飾。
4.權利要求
1的核酸配體，其中所述核酸配體不被2』-氟代修飾所修飾。
5.權利要求
1的核酸配體，其中SEQID NO : 17所示的核酸配體如SEQ ID N0:34 — 37所示進行修飾。
6.權利要求
1的核酸配體，其中SEQID NO : 17所示的核酸配體如SEQ ID NO:41 -49所示進行修飾。
7.權利要求
1的核酸配體，其中SEQID NO : 17所示的核酸配體如SEQ ID NO: 508.權利要求
1的核酸配體，其中SEQID NO : 17所示的核酸配體如SEQ ID NO:34所示進行修飾。
9.權利要求
1的核酸配體，其中SEQID NO : 17所示的核酸配體如SEQ ID NO:37所示進行修飾。
10.權利要求
1的核酸配體，所述核酸配體包括具有第一個和第二個莖的二級結構，其中第二個莖中至少一個鳥嘌呤被羥基糖(2』 -OH)修飾。
11.權利要求
1的核酸配體，所述核酸配體包括具有第一個和第二個莖的二級結構，其中第二個莖中至少一個胞苷被2』 -氟代修飾所修飾。
12.權利要求
1的核酸配體,其中所述核酸配體用至少一種水溶性聚合物修飾。
13.權利要求
12的核酸配體，其中所述水溶性聚合物為聚乙二醇。
14.權利要求
13的核酸配體，其中所述聚乙二醇是40kD聚乙二醇。
15.一種分離的核酸，其與SEQ ID NO :17的核酸配體中至少6-25個核苷酸互補，其中所述核酸是SEQ ID N0:8所示的核酸序列。
16.一種藥物組合物，所述組合物包含有效量的核酸配體連同藥物可接受的載體，所述核酸配體的核酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
17.權利要求
16的藥物組合物，其中所述核酸配體被至少一個2』-O-甲基核苷酸修飾或至少一個2』 -氟代核苷酸修飾所修飾。
18.權利要求
16的藥物組合物，其中所述核酸配體中的至少一個尿苷被2』-氟代修飾或至少一個2』 -O-甲基修飾所修飾。
19.權利要求
16的藥物組合物，其中SEQID NO : 17所示的核酸如SEQ ID N0:34 — 37所示進行修飾。
20.權利要求
16的藥物組合物，其中SEQID NO : 17所示的核酸如SEQ ID NO:41 -49所示進行修飾。
21.權利要求
16的藥物組合物，其中SEQID NO : 17所示的核酸如SEQ ID NO: 5022.權利要求
16的藥物組合物，其中SEQID NO : 17所示的核酸如SEQ ID N0:37所示進行修飾。
23.權利要求
16的藥物組合物，其中SEQID NO : 17所示的核酸如SEQ ID N0:34所示進行修飾。
24.權利要求
16的藥物組合物，其中所述核酸配體序列用水溶性聚合物修飾。
25.權利要求
24的藥物組合物，其中所述聚合物為聚乙二醇。
26.權利要求
25的藥物組合物，其中所述聚乙二醇是40kD聚乙二醇。
27.一種藥物組合物，所述組合物包含有效量的核酸連同藥物可接受的載體，所述核酸與SEQ ID NO: 17的核酸配體中至少6-25個核苷酸互補，其中所述核酸是SEQ ID N0:8所示的核酸序列。
28.權利要求
16或27的組合物，其中所述組合物適於全身給予。
29.權利要求
16或27的組合物，其中所述組合物適於靜脈內給予。
30.權利要求
16或27的組合物，其中所述組合物適於口服給予。
31.權利要求
16或27的組合物，其中所述組合物適於胃腸外給予。
32.有效量的核酸配體在生產藥物中的用途，所述核酸配體的核酸序列如SEQIDNO: 17所示,所述藥物用於在有需要的宿主中抑制凝血。
33.有效量的結合SEQID NO :17的核酸配體的核酸在生產藥物中的用途，所述核酸是SEQ ID NO:8所示的核酸序列，所述藥物通過所述SEQ ID NO : 17的核酸配體在有需要的宿主中逆轉凝血抑制。
34.權利要求
32或33的用途，其中所述核酸配體序列任選地包含一個或多個選自2』 -O-甲基修飾或2』 -氟代修飾的核苷酸修飾。
35.權利要求
34的用途，其中SEQID NO : 17所示的核酸配體如SEQ ID NO:37所示進行修飾。
36.權利要求
32或33的用途，其中所述宿主經受治療方案。
37.權利要求
32或33的用途，其中所述宿主經受手術幹預。
38.權利要求
32或33的用途，其中所述宿主患有心血管疾病或幹預或處於心血管疾病 或幹預風險中。
39.權利要求
32或33的用途，其中所述宿主患疾病或處於患病風險中，所述疾病選自急性心肌梗死(心臟病發作)、腦血管意外(中風)、局部缺血、血管成形術、CABG(冠狀動脈旁路移植術)、心肺分流術、在心臟旁路裝置的循環中或在經受腎透析的患者中的血栓形成、不穩定心絞痛、肺栓塞、深靜脈血栓形成、動脈血栓形成和瀰漫性血管內凝血。
40.權利要求
32或33的用途，其中所述宿主患心臟病發作或中風，或處於患心臟病發作或中風的風險中。
41.有效量的核酸配體在生產藥物中的用途，所述核酸配體的核酸序列如SEQIDNO: 17所示，所述藥物用於預防凝血誘發的炎症。
42.權利要求
41的用途，其中所述凝血誘發的炎症與選自以下的疾病相關動脈粥樣硬化、急性冠狀動脈綜合症(ACS)、心肌梗死、再灌注損傷和血管成形術後再狹窄。
專利摘要
本發明提供抑制凝血的改良核酸配體和核酸的改良調節物，以提供理想的凝血調節物。這些改良的核酸和調節物尤其用於在經受治療方案(例如手術或冠狀動脈搭橋術)的宿主中抑制凝血。
文檔編號C12Q1/68GKCN103045601SQ201210545424
公開日2013年4月17日 申請日期2005年4月22日
發明者C.拉斯科尼 申請人:雷加多生物科學公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan