一種用原位合成製備蛋白質晶片的方法

2023-04-22 23:24:06 3

專利名稱：一種用原位合成製備蛋白質晶片的方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質晶片的製備方法，具體說，是涉及一種採用原位電化學組合合成(combinatorial synthesis)方法和獨立尋址的微電極陣列技術，使帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體以活性自由基聚合方式與溶液中的苯胺共聚於電極上，一步直接在電極上原位生成具有生物活性並導電的電極覆蓋物，並在仿生條件下使接有多種蛋白質的卵白素與其牢固結合從而製得蛋白質晶片的方法。

背景技術：
生物晶片技術是上世紀九十年代以來在生命科學領域迅速發展起來的一項高新技術。它主要是指通過微加工和微電子技術在固體晶片表面構建微型生物化學分析系統，以實現對生命機體的組織、細胞、蛋白質、核酸、糖類以及其它生物組分進行準確、快速、大信息量的檢測。目前以DNA晶片為生物晶片市場的龍頭產品。而隨著蛋白質組學對基因功能的理解和疾病認識的深入，隨著蛋白質組學概念的提出及其研究的進行，人們需要一種新的技術來進行大規模的蛋白質分析，蛋白質晶片技術於是應運而生。在功能基因組時代，以生命活動的執行者和體現者一蛋白質為研究對象的蛋白質組學越來越顯得重要。在細胞中參與各種反應的都是蛋白質。因此，如果能製造出蛋白質晶片，而且如果蛋白質表達強度和鍵合物能被發現，就有可能將研究拓展到DNA晶片鞭長莫及的領域。蛋白質晶片或蛋白質傳感器的發展將會為蛋白質組學研究提供強有力的工具，從而推動疾病診斷、藥物篩選、個性化藥物的生產和應用等發生重大革新。因此，利用蛋白質晶片或蛋白質傳感器分析蛋白質功能是一種必然趨勢。
雖然蛋白質晶片可提供高通量蛋白質分析和蛋白質交互作用的研究，但目前大部分研究都僅限於使用螢光標記檢測或放射性同位素技術分析平臺。這些局限極大地制約了蛋白質晶片的潛力，並限制了此技術在蛋白質組學上得到更廣泛應用。且現有技術中，蛋白質晶片一般不能直接在原位合成，只能採用點樣或噴墨方法製作。製作蛋白質晶片或蛋白質傳感器最大的難題在於如何將蛋白與基底材料(如金屬表面)有效結合的同時，仍能保持其原有的生物活性(免疫性、抗體特異性)不變。蛋白質的固定有兩個與生俱來的困難1)背景(即非特異性鍵合)蛋白質往往非特異地吸附於大多數固體表面。這是因為蛋白質分子具有疏水性和各種帶電荷部位，可與疏水性或帶相反電荷的表面強烈結合。疏水作用尤為普遍，是一個造成表面汙染的主要原因。蛋白質分子和固體表面間的這種異動往往導致其三維結構的喪失乃至變性，即完全喪失活性。2)構象和取向蛋白質分子是通過特定的功能部位與其他分子間進行交互作用的。然而，固體表面上化學吸附力無視任何功能部位的存在。如果順其自然，固體表面上的蛋白質分子的構象和取向將不一定處於理想狀態。
綜上所述，雖然蛋白質晶片技術是一種強有力的蛋白質組學研究的新方法，從產生至今已有了很大的發展，但與基因晶片相比較，蛋白質晶片技術還處在初級階段，無論在晶片的製備，具體應用過程以及結果的檢測方面還有很多的不足。首先是成本問題，目前的蛋白質晶片的製作工藝還相當繁瑣、複雜，而且信號的檢測也需要專門的昂貴的儀器設備(如seldi-tof-ms)；其次，蛋白質晶片在製作過程中實驗條件發生微小的變化便可能引起最後結果的不同，實驗條件不易控制，使得實驗結果的可重複性相對不足。這些問題已成為蛋白質晶片技術亟需解決的難題。


發明內容
本發明為了解決困擾學術界已久的如何將蛋白質分子不失活地且永久地結合到金屬上、而且還能一步到位地將蛋白質分子固定於任何探測器金屬表面或獨立尋址電極上的難題，提供了一種用原位合成製備蛋白質晶片的方法，使蛋白質分子可實現一步到位固定於任何探測器的金屬表面，為無標記的分析方法奠定基礎，並使批量製作蛋白質晶片真正成為可能。
為實現上述發明目的，本發明採用的具體技術方案如下 本發明的用原位合成製備蛋白質晶片的方法，包括如下具體步驟 a)製備帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體 將帶有生物活性單元的甘醇亞磷醯胺溶解在無水乙腈中，然後加入苯胺衍生物的無水乙腈溶液，其中帶有生物活性單元的甘醇亞磷醯胺與苯胺衍生物的摩爾比為10∶1～1∶10；加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑(activator)，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌20～40分鐘後，進行減壓蒸鎦至粉末狀；加入過量氧化溶液(oxidation solution)，所述氧化溶液是由單質碘溶於四氫呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4％；室溫下攪拌5～15分鐘後，以硫代硫酸鈉還原至中性，然後減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫酸鈉乾燥後，減壓蒸乾有機溶劑；最後加入10％氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣後以0.2M鹽酸中和至中性，放入-4℃冰箱備用； b)製備蛋白質晶片 將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路晶片上，此電路上的每個電極由互補金屬氧化物半導體(CMOS)電晶體的開關連接，通過發送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的SRAM(靜態隨機存取記憶體)導通該開關；微電極陣列放置在一個流體反應器中，反應器中的反應液為步驟a)製備得到的帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體與其摩爾量的1～10倍的苯胺及適量作為電解質的氯化鉀混合而成；在邏輯電路控制下，以10毫秒開，10毫秒關的脈衝，在0.5～1.5伏，30秒總時間內，具有生物活性並導電的電極覆蓋物在原位迅速生成，經去離子水清洗後用氮氣吹乾，與帶有蛋白質的卵白素在PBS緩衝液中培養1～3小時，用PBS緩衝液反覆衝洗後即得。
所述的帶有生物活性單元的甘醇亞磷醯胺是指帶有DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞單元的甘醇亞磷醯胺，優選生物素甘醇亞磷醯胺。
所述的苯胺衍生物是指通式為

其中的n可為1、2或3；其中的R2可以是氫，也可以是游離於苯胺鄰位和間位的飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環)類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環)醚或硫醚類取代基、滷素類取代基、經矽烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、醯胺或磺醯胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。
所述電極可以是金屬、不鏽鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化矽、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料，優選金屬。
所述金屬可選自鉑、銥、鈀、金、銀、銅、汞、鎳、鋅、鈦、鎢或鋁，優選鉑。
正因為每個電極都與其下的獨立尋址邏輯電路連接，所以都具有智能傳感和訊號放大功能，當以一定的脈衝波掃描每個電極時，會產生一個微小的偶極化電子信號，此信號因電極所處的生物環境(有無分子識別反應)的變化而略有差異，因此，CMOS的運用提供了前所未有的可重複性，高度靈活的微米和亞微米範圍內合成聚合物微陣列的能力，使無標記分析方法得以成為現實。這種方法大大簡化了含多種內容的蛋白質晶片乃至蛋白質文庫的製作，聚苯胺的微觀結構不僅可將蛋白質伸展出電極表面，從而有利於其對目標分子的交互作用；而且它的導電性的優點對蛋白質的快速檢測和進而測定其對目標分子的交互作用(比方說抗體與抗原的作用)也有著無可比擬的優越性。
本發明人還研究發現通過調控單體濃度、電流密度和反應時間等活性自由基聚合條件，可以控制導電聚苯胺的聚合度。
與現有技術相比，本發明的突破點主要有以下幾點 1、使蛋白質分子通過高分子導體與電極連結，避免了蛋白質分子與固體表面的直接接觸，從而避免了表面非特異吸附。
2、使蛋白質分子可一步到位固定於任何探測器金屬表面或獨立尋址電極上，避免了繁雜的操作帶來的蛋白質構象和取向的不確定性。
3、穩定的共價鍵鍵合取代了其他不穩定的鍵合，使化學操作最小化，所有操作都在緩衝液中進行，使蛋白分子可保持活性。
4、可以實現高通量的實時檢測分析，為無標記的分析方法奠定了基礎，省卻了螢光標記及後續的光學模擬檢測和龐大昂貴的設備。
5、使批量製作蛋白質晶片真正成為可能，第一次從可操作層面上提供了自動化生產蛋白質晶片的可能性，將多個繁複的、技術性極強的操作分解成簡單的步驟，可重複性、重現性有很大的提高。



圖1是本發明中的獨立尋址邏輯電路晶片的結構示意圖；圖中1是指聚合反應驅動電路；2是指通過內部尋址連接導通的電極；3是指通過內部尋址連接的電極但在實驗中有意不通電而保持惰性； 圖2是獨立尋址邏輯電路晶片中的微電極陣列以螢光掃描儀(Axon4200A)掃描得到的照片； 圖3是獨立尋址邏輯電路晶片中的微電極陣列在室光下的照片(16微米直徑的電極經100倍光學放大得到)； 圖4是證明電流密度和反應時間與導電聚苯胺的聚合度的關係圖。

具體實施例方式 下面結合實施例對本發明做進一步詳細、完整地說明；實施例中所用化學試劑均向美國Sigma-Aldrich公司採購，生物素甘醇亞磷醯胺及接有螢光基團Cy5的卵白素以及供DNA合成之用的活化劑(activator)和氧化溶液(oxidationsolution)是從美國Glen Research公司採購。
實施例1製備帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體 將生物素甘醇亞磷醯胺溶解在無水乙腈中，然後加入苯胺鄰甲醇的無水乙腈溶液，其中生物素甘醇亞磷醯胺與苯胺鄰甲醇的摩爾比為10∶1～1∶10；加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌30分鐘後，進行減壓蒸鎦至粉末狀；加入過量氧化溶液，所述氧化溶液是由單質碘溶於四氫呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4％；室溫下攪拌10分鐘後，以硫代硫酸鈉還原至中性，然後減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫酸鈉乾燥後，減壓蒸乾有機溶劑；最後加入10％氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣後以0.2M鹽酸中和至中性，放入-4℃冰箱備用即可，本實施例的化學反應式如下

類似的合成方法也適用於帶有飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環)類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環)醚或硫醚類取代基、滷素類取代基、經矽烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、醯胺或磺醯胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基的苯胺鄰甲醇、苯胺鄰乙醇或苯胺鄰丙醇。
實施例2製備蛋白質晶片 將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路晶片上(見圖1所示)，此電路上的每個電極由互補金屬氧化物半導體(CMOS)電晶體的開關連接，通過發送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的SRAM(靜態隨機存取記憶體)導通該開關；微電極陣列放置在一個專門設計的流體反應器中，計算機以數字方式指示微電極陣列響應數字命令來組裝導電聚合物；反應器中的反應液為製備得到的帶有生物素取代基的苯胺單體與其摩爾量的1～10倍的苯胺及適量作為電解質的氯化鉀混合而成；在邏輯電路控制下，以10毫秒開，10毫秒關的脈衝，在0.5～1.5伏，30秒總時間內，具有生物活性並導電的電極覆蓋物在原位迅速生成，經去離子水清洗後用氮氣吹乾，在pH4的緩衝液中對每一電極進行掃描讀數(包括空白和對比(control))，與帶有螢光基團Cy5的卵白素在PBS緩衝液中培養2小時後，用PBS緩衝液反覆衝洗，以Axon4200A掃描得到圖2照片，室光下電極的照片見圖3所示(16微米直徑的電極經100倍光學放大得到，其中圓形為電極，電極周圍為絕緣體)。
重複在pH4的緩衝液中對每一電極的掃描讀數，得到卵白素的識別率在90％以上。此讀數是在全無優化的條件下取得，證明不必藉助光學方法，無標記的分析方法在蛋白質化學親和力分子識別中有很大的潛力。本方法在不少於兩個電極的晶片上操作，並採用不同蛋白質交聯的卵白素以分次電化沉積-培養的方式，可以得到多元化的蛋白質晶片。
實施例中使用的電極為鉑金屬，可由銥或其他金屬(例如鈀、金、銀、銅、汞、鎳、鋅、鈦、鎢、鋁)或不鏽鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化矽、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料所替代。
實施例3證明電流密度和反應時間與導電聚苯胺的聚合度的關係實驗 使正電荷在不同的脈衝間隔時間在電極上通過，總電荷是由脈衝與時間的積分決定。對數字1，脈衝是2毫秒開，10毫秒關；對數字2，脈衝是4毫秒開，10毫秒關；即對每下一個數字，脈衝開啟時間增加一倍，總時間不變一律為60秒，電壓始終維持在1.0伏，見表1所示。
表1數字與脈衝的對應關係 將電極經去離子水清洗後用氮氣吹乾，隨即進行光學測量。如圖4所示，數字1勉強可見，數字2以後逐步清晰，數字8呈藍色，說明隨著電流密度的增大和反應時間的延長，導電聚苯胺的聚合度逐漸增大，聚苯胺的氧化態逐步增高。
權利要求
1.一種用原位合成製備蛋白質晶片的方法，其特徵在於，包括如下具體步驟
a)製備帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體
將帶有生物活性單元的甘醇亞磷醯胺溶解在無水乙腈中，然後加入苯胺衍生物的無水乙腈溶液，其中帶有生物活性單元的甘醇亞磷醯胺與苯胺衍生物的摩爾比為10∶1～1∶10；加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌20～40分鐘後，進行減壓蒸餾至粉末狀；加入過量氧化溶液，所述氧化溶液是由單質碘溶於四氫呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4％；室溫下攪拌5～15分鐘後，以硫代硫酸鈉還原至中性，然後減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫酸鈉乾燥後，減壓蒸乾有機溶劑；最後加入10％氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣後以0.2M鹽酸中和至中性，放入-4℃冰箱備用；
b)製備蛋白質晶片
將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路晶片上，此電路上的每個電極由互補金屬氧化物半導體(CMOS)電晶體的開關連接，通過發送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的靜態隨機存取記憶體(SRAM)導通該開關；微電極陣列放置在一個流體反應器中，反應器中的反應液為步驟a)製備得到的帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體與其摩爾量的1～10倍的苯胺及適量作為電解質的氯化鉀混合而成；在邏輯電路控制下，以10毫秒開，10毫秒關的脈衝，在0.5～1.5伏，30秒總時間內，具有生物活性並導電的電極覆蓋物在原位迅速生成，經去離子水清洗後用氮氣吹乾，與帶有螢光的卵白素在PBS緩衝液中培養1～3小時，用PBS緩衝液反覆衝洗後即得。
2.根據權利要求1所述的用原位合成製備蛋白質晶片的方法，其特徵在於，所述的帶有生物活性單元的甘醇亞磷醯胺是指帶有DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞單元的甘醇亞磷醯胺。
3.根據權利要求2所述的用原位合成製備蛋白質晶片的方法，其特徵在於，所述的帶有生物活性單元的甘醇亞磷醯胺是指生物素甘醇亞磷醯胺。
4.根據權利要求1所述的用原位合成製備蛋白質晶片的方法，其特徵在於，所述的苯胺衍生物是指通式為
其中的n為1、2或3；其中的R2是氫或是游離於苯胺鄰位和間位的飽和或不飽和烴類取代基、芳香族類取代基、烴類和/或芳香族醚或硫醚類取代基、滷素類取代基、經矽烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、醯胺或磺醯胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。
5.根據權利要求1所述的用原位合成製備蛋白質晶片的方法，其特徵在於，所述電極是金屬、不鏽鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化矽、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料。
6.根據權利要求5所述的用原位合成製備蛋白質晶片的方法，其特徵在於，所述電極是金屬。
7.根據權利要求6所述的用原位合成製備蛋白質晶片的方法，其特徵在於，所述金屬選自鉑、銥、鈀、金、銀、銅、汞、鎳、鋅、鈦、鎢或鋁。
8.根據權利要求7所述的用原位合成製備蛋白質晶片的方法，其特徵在於，所述金屬選自鉑。
全文摘要
本發明為了解決困擾學術界已久的如何將蛋白質分子不失活地且永久地結合到金屬上、而且還能一步到位地將蛋白質分子固定於任何探測器金屬表面或獨立尋址電極上的難題，提供了一種蛋白質晶片的製備方法，通過採用原位電化學組合合成方法和獨立尋址的微電極陣列技術，使帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體以活性自由基聚合方式與溶液中的苯胺共聚於電極上，一步直接在電極上原位生成具有生物活性並導電的電極覆蓋物，並在仿生條件下使接有多種蛋白質的卵白素與其牢固結合從而製得蛋白質晶片。本發明為無標記的分析方法奠定了基礎，使批量製作蛋白質晶片真正成為可能，第一次從可操作層面上提供了自動化生產蛋白質晶片的可能性並且具有很高的重現性。
文檔編號B81C1/00GK101813701SQ20101014601
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月13日 優先權日2010年4月13日
發明者王巍 申請人:無錫中美億芯生物科技有限公司