一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑的製作方法
2023-05-24 14:55:06 1
一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑，該試劑通過對等溫環介導擴增所使用的引物組中的前內引物標記一種抗原同時對後內引物標記另一種抗原，能夠在擴增沙門菌特異性目的基因的同時對該基因進行標記。標記後使用配套的膠體金試紙能夠快速檢測目的基因的擴增產物，從而檢測沙門菌。本發明的檢測試劑操作簡單快速、特異性強、靈敏度高。
【專利說明】—種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑【技術領域】
[0001]本發明涉及一種應用於核酸檢測的試劑，具體講，涉及一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑。
【背景技術】
[0002]沙門菌是一種腸道致病菌，常常因為誤食不潔食物引起，由沙門氏菌引起的疾病主要分為兩大類:一類是傷寒和副傷寒，另一類是急性腸胃炎。據世界衛生組織的報告，1985年以來，在世界範圍內，由沙門氏菌引起的已確診的人類患病人數顯著增加，在一些歐洲國家已增加五倍以上。在我國內陸地區，由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位。據資料統計，在我國細菌性食物中毒中，70%~80%是由沙門菌引起，而在引起沙門氏菌中毒的食品中，90%以上是肉類等動物性產品。動物性產品中含有多種豐富的營養成分，非常適宜於沙門菌的生長繁殖，人們一旦攝入了含有大量沙門菌食品，就會引起細菌性感染，進而在毒素的作用下發生食物中毒。沙門菌的快速檢測對沙門菌感染的防控具有重要的意義。 [0003]環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermal amplification)是一種新型的核酸檢測技術，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下,在60°C~65°C恆溫擴增，60分鐘左右即可實現IO9~IOltl倍的核酸擴增，具有操作簡單、特異性強等特點。該技術的優勢除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡單，對儀器設備要求低，一臺水浴鍋或恆溫箱就能實現反應。其擴增結果可以通過凝膠電泳、肉眼觀察焦磷酸鎂沉澱或加入螢光物質後的顏色改變來做初步的判斷。但該方法也有一定的缺陷，主要表現在擴增結果檢測環節，凝膠電泳檢測容易造成汙染，焦磷酸鎂沉澱檢測靈敏度較差，螢光物質變色方法受到螢光物質的成本或者需要使用檢測儀器的限制。因此，在產物檢測環節的限制，影響了該技術的推廣應用。
[0004]本發明公開了一種新型的等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑。該方法具有本發明的相對傳統環介導等溫核酸擴增技術具有靈敏度更高，結果判斷更準確的優勢。
【發明內容】
[0005]本發明的首要發明目的在於提供一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑。
[0006]本發明的第二發明目的在於提供一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測方法。
[0007]本發明的第三發明目的在於提供這種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑盒的應用。
[0008]發明的主要技術方案為:
1.等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑的組成為:
(I)核酸恆溫標記擴增反應試劑
核酸恆溫擴增反應液中含有前外引物、後外引物、前促環引物、後促環引物、前內引物、後內引物、dNTPs溶液、具有鏈置換活性的DNA聚合酶(如'Bst DNA聚合酶等)、MgSO4、無菌雙蒸水以及環介導等溫擴增的緩衝液。[0009]環介導等溫擴增的緩衝液的最終工作濃度為20 mM Tris-HClUO mMKClUO mM(NH4)2SO4,2 mM MgSO4 以及質量濃度為 0.1% Triton X-100，緩衝液的 pH 值為 8.8。
[0010]其中前外引物、後外引物、前促環引物、後促環引物、前內引物、後內引物均為人工合成的脫氧核糖核酸分子，其中前外引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:1、後外引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2、前促環引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:3、後促環引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:4、前內引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:5、後內引物的核苷酸序列為SEQ IDN0:6，上述引物分別與待測基因的相應位置互為反義互補序列，上述引物能夠在等溫條件下以環介導的方式檢測待測基因。將前內引物的5』端標記上生物素基團，將後內引物的5』端標記上異硫氰酸螢光素基團。
[0011]各引物的具體核苷酸序列如下:
SEQ ID NO:1 5』 - GCCATTCCACATCGAAGAGGT -3』，
SEQ ID NO:2 5』 - ATGAGAACATCAATGGTATGGC -3』，
SEQ ID NO:3 5』 - CAGGTGATCAACATCCCGCC -3』，
SEQ ID NO:4 5，- CGGTAAAGTGGTCAGCAAAGAT -3，，
SEQ ID NO:5 5』 - GGCGTGAGAGATCCACCTGGAATGCGCCGTAATAGCGGTC -3』，
SEQ ID NO:6 5』 - CACCATTATGGAAACGCTTATCCGCCGGATACAGCTGAAGCATC -3』。
[0012](2)標記核酸膠體 金檢測試紙條
該試紙條的組成包括樣品墊、金膠墊、醋酸纖維素膜(膜上由相應的抗體組成的檢測線和質控線)和吸水墊等，具體組成參見附圖1。該膠體金檢測試紙的金膠墊上含有標記後抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測試紙層析膜的檢測線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測試紙層析膜的質控線上包被有能和金顆粒上標記的抗生物素抗體結合的二抗。
[0013]2.使用等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑的具體步驟為:
(I)將待檢測的DNA溶液，加入到裝有恆溫擴增反應液的PCR管中；在對照PCR管中分別加入陽性對照試劑和陰性對照試劑，將上述PCR管在60~65°C下擴增反應30~60分鐘，優選條件為63°C下擴增反應60分鐘。
[0014](2)利用標記核酸膠體金檢測試紙條，檢測PCR管中反應後的核酸擴增產物。
[0015]下面對本發明的技術方案作進一步的解釋和說明:
等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑能夠在60~65°C下將沙門菌的DNA進行擴增，在擴增的同時，由於前內引物和後內引物分別標記有生物素基團和異硫氰酸螢光素基團，因此在DNA擴增產物上同時含有生物素基團和異硫氰酸螢光素基團。
[0016]上述擴增產物滴加在核酸膠體金檢測試紙條的樣品墊上，在層析作用下，擴增產物在經過金膠墊時雙標記的核酸擴增產物由於攜帶有生物素基團和異硫氰酸螢光素基團，因此能夠和標記有金顆粒的抗生物素抗體結合形成核酸抗體複合物；核酸抗體複合物在醋酸纖維素膜上層析，經過檢測線時該複合物由於帶有異硫氰酸螢光素基團，因此能夠和檢測線上的抗異硫氰酸螢光素抗體結合，形成複合物，該複合物由於攜帶有有色的標記物(納米金顆粒呈紅色)，此時檢測線呈現紅色；當核酸抗體複合物或者單獨的標記抗生物素抗體經過質控線時，由於質控線上含有能夠結合抗生物素抗體的二抗，所以只要有標記的抗生物素抗體層析至質控線，無論該抗體是否結合有標記的核酸，均能夠形成二抗和標記抗體的複合物，該複合物由於攜帶有有色的標記物(納米金顆粒呈紅色)，此時質控線呈現紅色。[0017]本發明的相對傳統環介導等溫核酸擴增技術具有靈敏度更高，結果判斷更準確的優勢。首先，本發明的新型恆溫環介導核酸標記檢測試劑，使用標記的引物，使得環介導等溫擴增後，擴增產物攜帶了兩種抗原標記物。這樣的雙標記核酸擴增產物，能夠被製備好的膠體金試紙條檢測出來。當含有雙標記擴增產物的樣本在膠體金試紙上層析時，雙標記產物能夠結合攜帶有有色顆粒標記的抗體，在檢測線上呈現紅色，這樣目的擴增產物可以通過試紙上檢測線的顏色改變顯示出來。即使有很少的擴增產物也能夠進行準確的檢測，因此有效地提高了檢測靈敏度。其次，檢測反應的結果通過膠體金檢測試紙的檢測線得到，相對於濁度觀察法和螢光燃料變色法讀取結果更加準確，避免了由於檢驗人員主觀判斷帶來的結果偏差。上述檢測方法擴大了該檢測試劑的應用範圍，使之可以廣泛應用於野外現場等特殊環境。此方法操作簡單、時間短，同時也降低了檢測成本，使得檢測結果更加快速、可靠，具有免疫與核酸診 斷試劑各自的優點。該技術由於操作簡單、快速、低廉的成本和防止核酸擴增物對實驗室的汙染，對於病原體的檢測具有重大意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]附圖1膠體金試紙條的組成。
[0019]該試紙條的組成包括樣品墊(I)、金膠墊(2 )、醋酸纖維素膜(3 )、質控線(4 )、檢測線(5)和吸水墊(6)。該膠體金檢測試紙的金膠墊上含有標記後抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測試紙層析膜的檢測線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測試紙層析膜的質控線上包被有能和金顆粒上標記的抗生物素抗體結合的二抗。
[0020]附圖2沙門菌標記擴增檢測結果
加入的擴增DNA模板如下，I號條為沙門菌DNA模板標準品其中含目的基因約IO8拷貝；2號條為沙門菌DNA模板標準品其中含目的基因約10°拷貝；3號條為待測樣品；4號條加入的雙蒸水進行陰性對照。
[0021]下面結合具體實施例，進一步詳細地闡述本發明。
【具體實施方式】
[0022]本發明的【具體實施方式】僅對本發明做進一步的解釋和說明，並不對本發明的內容進行限制。
[0023]實施例1:沙門菌DNA基因組梯度稀釋標記擴增檢測
取濃度已知的沙門菌DNA基因組對其進行10倍梯度稀釋，稀釋至沙門菌DNA中的目的基因終濃度為10°拷貝/ y L，取沙門菌DNA模板標準品製備的陽性參照物，陰性參照物，以及沙門菌DNA梯度稀釋液(在PCR管中沙門菌特異性目的基因的終濃度分別為IO5拷貝、IO4拷貝、IO3拷貝、IO2拷貝、IO1拷貝和10°拷貝)，做為模板進行標記擴增檢測。
[0024]等溫擴增中的各組分構成比例如下:
【權利要求】
1.一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑，其特徵在於，所述的檢測試劑包括沙門菌等溫環介導核酸標記擴增反應液，該反應液中含有前外引物、後外引物、前促環引物、後促環引物、5』端標記生物素基團的前內引物、5』端標記異硫氰酸螢光素基團的後內引物、dNTPs溶液、具有鏈置換活性的DNA聚合酶(如-.Bst DNA聚合酶)、MgSO4、無菌雙蒸水以及環介導等溫擴增的緩衝液。
2.根據權利要求1所述的一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑，其特徵在於，使用的前外引物、後外引物、前促環引物、後促環引物、前內引物和後內引物的序列如下:
SEQ ID NO:1 5』 - GCCATTCCACATCGAAGAGGT -3』，
SEQ ID NO:2 5』 - ATGAGAACATCAATGGTATGGC -3』，
SEQ ID NO:3 5』 - CAGGTGATCAACATCCCGCC -3』，
SEQ ID NO:4 5，- CGGTAAAGTGGTCAGCAAAGAT -3，，
SEQ ID NO:5 5』 - GGCGTGAGAGATCCACCTGGAATGCGCCGTAATAGCGGTC -3』，
SEQ ID NO:6 5』 - CACCATTATGGAAACGCTTATCCGCCGGATACAGCTGAAGCATC -3』。
3.根據權利要求1所述的一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑，其特徵在於，使用該試劑，能夠在擴增目的基因的同時將擴增產物DNA上標記生物素基團和異硫氰酸螢光素基團。
4.根據權利要求1所述的一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑，其特徵在於，將提取得到的待測DNA溶液作為擴增模板加入到裝有核酸恆溫標記擴增反應液的PCR管中，在60~65°C下擴增反應30~60分鐘，優選63°C下擴增反應60分鐘。`
5.一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑所使用的膠體金檢測試紙，其特徵在於，膠體金檢測試紙的金膠墊上含有標記後抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測試紙層析膜的檢測線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測試紙層析膜的質控線上包被有能和金顆粒上標記的抗生物素抗體結合的二抗。
6.根據權利要求4所述的一種新型等溫環介導沙門菌核酸標記檢測試劑所使用的膠體金檢測試紙，其特徵在於，將待測標記擴增產物滴加在檢測試紙的樣品墊上，當檢測線和質控線都呈現紅色時表明DNA樣品中含有沙門菌的待測基因，當檢測線無色而質控線呈現紅色表明DNA樣品中不含有沙門菌的待測基因。
【文檔編號】G01N33/569GK103667504SQ201310737361
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】王馨, 關淳, 柴宏森, 祁軍, 劉寅 申請人:天津國際旅行衛生保健中心