疏水蛋白多肽作為滲透增強劑的用途的製作方法

2023-05-24 10:07:41

專利名稱：疏水蛋白多肽作為滲透增強劑的用途的製作方法
疏水蛋白多肽作為滲透增強劑的用途本發明涉及疏水蛋白多肽作為滲透增強劑(penetration intensifier)的用途。近年來滲透增強劑已在多個領域日益重要，例如作為化妝品或藥物組合物的成 分、作物保護組合物的成分或塗料組合物的成分。從W0 93/002669已知經皮滲透增強劑。其描述了極性和非極性滲透增強劑的組 合，該組合在經皮治療系統中包含活性成分的附著基質中。指定的極性滲透增強劑是多元 醇，指定的非極性滲透增強劑是脂肪酸酯。在所述經皮治療系統中，滲透增強劑使活性成分 (在水中不溶解或微溶的類固醇激素)的滲透速率增加。在該經皮治療系統中，通過阻塞效應，或通過諸如上述滲透增強劑或諸如二甲基 亞碸(DMS0)的滲透增強劑，使角質層的屏障作用暫時受損，從而允許低分子量物質滲透進 皮膚。用於治療製劑中的其他滲透增強劑是例如一元醇或多元醇類，如乙醇、1，2_丙 二醇、苄醇；具有8-10個碳原子的飽和和不飽和脂肪醇，如十二醇或十六醇；烴類，如礦物 油；烷類；酯類；azones，如1_十二烷基氮雜環庚_2_酮、丙二醇、脫乙醯殼多糖；飽和和不 飽和脂肪酸類，如硬脂酸或油酸；具有至多24個碳原子的脂肪酸酯類或具有至多24個碳原 子的二羧酸二酯類，如甲酯類、乙酯類、異丙酯類、丁酯類、仲丁酯類、異丁酯類、叔丁酯類； 和乙酸、己酸、十二酸、十四酸、十八酸和十六酸的單甘油酸酯類；磷酸鹽衍生物類，如卵磷 脂；萜類；尿素及其衍生物類；和醚類，如二甲基異山梨醇酯和二甘醇一乙基醚；膽酸鹽類； 聚乙氧基乙烯類；EDTA ；橙花叔醇；氧化薴烯類或磷脂類。其他已知的滲透增強劑是SDS(十二烷基硫酸鈉)、二甲基甲醯胺和N-甲基甲醯 胺。在作物保護領域，為確保作物保護組合物更容易的吸收，也使用滲透增強劑。疏水蛋白是存在於絲狀真菌(例如裂褶菌(Schizophyllum commune))中的約 100-150個胺基酸的小蛋白質。它們通常具有8個半胱氨酸單位。疏水蛋白可分離自天然 來源，但也可按例如W0 2006/082251或W02006/131564所公開，用遺傳工程方法獲得。疏水蛋白以水不溶性形式分布在多種真菌結構例如氣生菌絲、孢子和子實體的表 面。疏水蛋白的基因分離自子囊菌綱(ascomycetes)、半知菌綱(deuteromycetes)和擔 子菌綱(basidiomycetes)。一些真菌包含不止一種疏水蛋白基因，例如裂褶菌、灰蓋鬼傘 (Coprinus cinereus)、構巢麴黴(Aspergillus nidulans)。很明顯，不同的疏水蛋白參與 真菌發育的不同階段。推測所述疏水蛋白負責不同的功能(van Wetter等人，2000，Mol. Microbiol.，36，201—210 ；Kershaw 等人 1998，Fungal Genet. Biol, 1998,23，18-33)。所描述的疏水蛋白的生物學功能除了減少水的表面張力以產生氣生菌絲外，其還 包括孢子的疏水化(Wosten等人 1999，Curr. Biol.，19，1985-88 ；Bell 等人 1992，Genes Dev.，6，2382-2394)。此外，疏水蛋白用於內襯地衣的子實體中的氣體通道(gas channel) 以及通過真菌病原體鑑定植物表面的系統的組分(Lugones等人1999，Mycol. Res.，103， 635-640 ；Hamer 和 Talbot 1998，Curr. Opinion Microbiol.，第一卷，693-697)。現有技術中已提出了疏水蛋白對多種應用中的用途。
W0 96/41882提出疏水蛋白作為乳化劑、增稠劑、表面活性物質的用途，用於疏水 表面的疏水化，用於提高親水底物的抗水性，用於產生水包油型乳劑和油包水型乳劑。此 外，還提出了藥物應用(如軟膏劑或霜劑的生產)和化妝品應用(如皮膚保護或洗髮劑或 頭髮漂洗劑的保護)。EP 1 252 516公開了在30-80°C的溫度用包含疏水蛋白的溶液對多種底物的包 被，例如窗、鏡片、生物傳感器、醫療器械、容器、框或車體。此外，還提出了例如作為破乳劑(W0 2006/103251)、作為蒸發抑制劑(W0 2006/128877)、或汙染抑制劑(W0 2006/103215)的用途。US 20030217419A1描述了來自裂褶菌的疏水蛋白SC3對化妝品製劑、對治療材料 的處理的用途。在此，形成化妝品長效製劑，其可經受洗髮劑的幾次洗滌。疏水蛋白作為滲透增強劑的用途迄今尚未知。本發明的目的是提供疏水蛋白的新用途。此外，目標是對於迄今不通透或幾乎不通透相界的活性成分，達到允許或促進該 活性成分滲透相界的目的。另一個目的是在應用中降低活性成分的濃度。提供包含疏水蛋白作為滲透增強劑的化妝品和/或藥物組合物也是本發明的目 的，滲透增強劑確保活性成分的吸收提高，尤其不引起皮膚或黏膜刺激。提供包含疏水蛋白作為滲透增強劑的作物保護組合物是本發明的另一個目的，滲 透增強劑確保活性成分的吸收提高，尤其不引起對所處理植物的損傷或環境損傷。通過疏水蛋白作為滲透增強劑的用途達到目的。在本發明的上下文中，術語「滲透增強劑」和「滲透促進劑」是同義詞。關於本發明，可明確地作以下說明在本發明的上下文中，滲透指物質滲透通過相界。在本發明的上下文中，相界指從一相至鄰相的轉變(transition)。在本發明的上下文中，相指一個區域，其中其物理參數的任意項不存在急劇變化。 因此，在從一相至鄰相的轉變中，在直徑僅幾個分子的層內，選自密度、電性質、磁性質、折 射率、化學組成、晶體結構的至少一種物理或化學性質改變。在本發明的一種變通方案中，滲透通過相界的增強是指與具有相同化學、生物和 物理性質的對照相比，在相同的化學、生物和物理條件或前提下，相同時間內更大量的活性 物質滲透相界，或更短時間內等量的活性物質滲透相界。在本發明的一種變通方案中，滲透的增強或增加的滲透，或活性成分滲透通過相 界的增加指對於迄今不通透或幾乎不通透相界的活性成分，促進或提高相界的滲透。這與 具有相同化學、生物和物理性質的對照相比，在相同的化學、生物和物理條件或前提下，其 中在相同時間內更大量的活性成分滲透相界，或更短時間內等量的活性物質滲透相界。滲透增強劑是增強另一種物質滲透通過相界的物質。在本發明的上下文中，術語「疏水蛋白」在下文中理解為指一般結構式(I)的多肽。Xn-C1-X1_50-C2-X0_5-C3-X1_100-C4-X1_100-C5-X1_50-C6-X0_5-C7-X1_50-C8-Xm (I)其中X 可以是任意 20 種天然胺基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、lie Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)。在此，X 基團在各種情況中可能相 同或不同。在此，X旁的指數在各種情況中是各個部分序列中的胺基酸數目，C是半胱氨酸、 丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸，其中命名為C的基中至少四個是半胱氨酸，指 數n和m彼此獨立，為0-500之間的自然數，優選為15-300之間的自然數。式⑴的多肽表徵為以下性質在各種情況中，與相同大小的水滴在未包被的 玻璃表面的接觸角相比，室溫包被玻璃表面後，它們使水滴的接觸角增加至少8°、10°、 20°，優選至少25°和尤其優選30°。命名為G-C8的胺基酸優選為半胱氨酸；然而，它們也可用具有相似空間充填 (filing)的其他胺基酸替換，優選用丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸替換。然 而，位置C-C8的至少4個、優選至少5個、尤其優選至少6個和尤其至少7個應由半胱氨酸 組成。在本發明的蛋白質中，半胱氨酸可以還原形式存在或彼此形成二硫鍵。尤其優選形 成分子內C-C鍵，尤其是具有至少1個、優選2個、尤其優選3個和極其優選4個分子內二 硫鍵的C-C鍵。若用具有相似空間填充的胺基酸替換上述半胱氨酸，這些C位置可方便替 換為可彼此形成分子內二硫鍵的對。若半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸也用於以X表示的位置， 則可相應地改變通式中各C位置的編號。優選使用通式(II)的疏水蛋白實施本發明Xn-C1-X3-25~C2-X0_2-C3-X5_50-C4-X2_35~C5-X2_15-C6-X0_2-C7-X3_35~C8-Xm(II)，其中X、C，和X和C旁的指數具有上述意義，指數n和m是0_350之間的數字，優 選15-300之間的數字，此外蛋白質表徵為上述接觸角改變和此外命名為C的基團中至少6 個是半胱氨酸。尤其優選地，所有的C基團都是半胱氨酸。尤其優選使用通式(III)的疏水蛋白 Xn-cLxH-cLcf-Xm-cLXm-cs-XH-cLcLxHs-c8^ (III)其中X、C和X旁的指數具有上述意義，指數n和m是0_200的數字，此外蛋白質表 徵以上述接觸角改變和命名為c的基團中至少6個是半胱氨酸。尤其優選地，所有的C基 團都是半胱氨酸。基團可以是也天然連接至疏水蛋白的肽序列。然而，也可能一個基團或兩 個基團都不是天然連接至疏水蛋白的肽序列。這些也理解為指下述xn和/或xm基團，其中 疏水蛋白中天然存在的肽序列通過非天然存在於疏水蛋白的肽序列延長。若Xn和/或Xm是非天然連接至疏水蛋白的肽序列，則這種序列長度一般至少是 20、優選至少35個胺基酸。例如，這些序列可以是20-500、優選30-400和尤其優選35-100 個胺基酸的序列。這種非天然連接至疏水蛋白的基團還將在下文中稱為融合伴侶。這是為了表示蛋 白質可由至少一個疏水蛋白部分和一個融合伴侶部分組成，其在自然界中不以該形式一起 發生。融合伴侶和疏水蛋白部分組成的融合疏水蛋白已公開於例如W0 2006/082251(第2 頁第18行-第5頁第25行)、W0 2006/082253 (第2頁第20行-第6頁第13行)和TO 2006/131564 (第2頁第17行-第6頁第26行)。融合伴侶部分可選自多個蛋白質。例如在疏水蛋白部分的氨基端(Xn)和在羧基 端(XJ，可能只有單個融合伴侶連接至疏水蛋白部分，或兩個或多個融合伴侶連接至疏水蛋白部分。然而，也可能例如將兩個融合伴侶連接至本發明蛋白質的單一位置(乂11或乂111)。尤其適合的融合伴侶是在微生物中特別是在大腸桿菌(E. coli)或枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)中天然發生的蛋白質。這種融合伴侶的例子是序列yaad(W0 2006/082251 中的 SEQ ID NO 16)、yaae (WO 2006/082251 中的 SEQ ID NO 18)、泛素和硫 氧還蛋白。這些指定序列的片段或衍生物也高度適合，其僅包含指定序列的部分，例如指定 序列的70-99%、優選5-50%和尤其優選10-40%，或與指定序列相比其中單個胺基酸或核 苷酸已改變，百分數參考各種情況中胺基酸的數目。在另一個優選實施方案中，除指定的融合伴侶外，融合疏水蛋白還具有所謂的親 和結構域(親和標籤/親和尾)作為乂11或乂111基團之一或作為這種基團的末端成分。以理 論上已知的方式，這些是可與某種互補基團相互作用和可用於更容易的蛋白質處理和純化 的結合團。這種親和結構域的實例包含(His)k, (Arg)k, (Asp)k, (Phe)k或(Cys)k基團，其中 k 一般是1-10的自然數。優選地，其可以是(His)k基團，其中k為4-6。在此，或Xm 基團可僅由這種類型的親和結構域組成，或者天然連接或非天然連接至疏水蛋白的Xn或Xm 基團通過末端排列親和基團而延長。根據本發明使用的疏水蛋白是根據結構式(I)、(II)和(III)的疏水蛋白和融合 疏水蛋白。根據本發明使用的疏水蛋白也可在其多肽序列中修飾，例如通過糖基化、乙醯化， 或通過化學交聯，例如用glutardialdehyde。根據本發明使用的疏水蛋白或其衍生物的一種性質是用該蛋白質包被表面時表 面性質的改變。可用實驗測定表面性質的這種改變，例如，通過在用蛋白質包被表面之前和 之後測量水滴的接觸角，並測定兩個測量結果的差異。接觸角測量的實施為本領域技術人員已知。測量涉及室溫和5 U 1的水滴和用小 玻璃板作基質。適合作為實例，測量接觸角的方法的確切的實驗條件在實驗部分給出。在 其中指定的條件下，根據本發明使用的融合蛋白質具有以下性質在各種情況中，與相同大 小的水滴在未包被的玻璃表面的接觸角相比，其使接觸角增加至少20°，優選至少25°， 尤其優選至少30°、40°、45°，尤其是50°。對實施本發明尤其優選的疏水蛋白是dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2 型疏水蛋白。這些疏水蛋白(包括它們的序列)公開於例如W0 2006/82251中。除另作說 明外，下文給出的序列指公開於W0 2006/82251中的序列。具有SEQ ID號的概述表可見於 W0 2006/82251的第20頁(第1行-第5行)。根據本發明，尤其適合的是融合蛋白質yaad-Xa-dewA-his (SEQ IDN0 20)、 yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO :22)或 yaad-Xa-basfl-his (SEQID NO :24)，多肽序列和編 碼多肽的核苷酸序列在括號中給出，尤其是SEQ ID N0:19、21、23的序列。尤其優選地，可 使用yaad-Xa-dewA-hiS(SEQ ID N0:20)。作為所有胺基酸中至少一個(範圍至10)、優選 5個、尤其優選5%的替換、插入或缺失，但仍具有至少50%起始蛋白質的生物性質的結果， 從SEQ ID NO. 20、22或24所示多肽序列起始產生的蛋白質也是尤其優選的實施方案。在 此將蛋白質的生物性質理解為指已述的接觸角改變至少20°，優選至少25°、尤其優選至 少 30°、40°、45°，尤其是 50°。尤其適合於實施本發明的衍生物是通過縮短yaad融合伴侶衍生自 yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO 20)、yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO 22)或 yaad-Xa-basfl-his(SEQ ID NO 24)的衍生物。替代具有294個胺基酸的完整yaad融合伴 侶(SEQ ID NO :16)，可有利的使用縮短的yaad基團。然而，縮短的基團應包含至少20、優選 至少35個胺基酸。例如，可使用具有20-293、優選25-250、尤其優選35-150和例如35-100 個胺基酸的縮短的基團。這種蛋白質的一個實例是yaad40-Xa-dewA-his(W02007/014897 中的SEQ ID NO: 26)，其具有縮短至40個胺基酸的yaad基團。可用疏水蛋白和一個或多個融合伴侶之間的切割位點來切去融合伴侶並釋放非 衍生形式的純疏水蛋白(例如通過BrCN在甲硫氨酸處的切割、Xa因子切割、腸激酶切割、 凝血酶切割、TEV切割等)。根據本發明用作滲透增強劑的疏水蛋白可通過已知的肽合成方法進行化學製備， 例如通過按Merrifield法固相合成。可利用適合的方法從天然來源分離天然存在的疏水蛋白。作為實例，可參考 W6sten等人,Eur. J Cell Bio. 63，122-129(1994)或 W0 96/41882 (第 23 頁第 15 行-第 24頁第8行)。US 2006/0040349 (段落
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)描述了 從嗜熱踝節菌(Talaromyces thermophilus)產生無融合伴侶的疏水蛋白的遺傳工程產生方法。通過遺傳工程方法可優選地進行融合蛋白質的製備，其中將編碼融合伴侶的核 酸和編碼疏水蛋白部分的核酸(尤其是DNA序列)如此組合，使得通過組合的核酸序 列的基因表達，在宿主生物體內產生所需蛋白質。一種這樣的生產方法公開於例如W0 2006/082251 (第6頁第21行-第12頁第37行)或W0 2006/082253 (第5頁第33行-第 11頁第13行)。融合伴侶使疏水蛋白的產生明顯地更容易。遺傳工程方法產生融合疏水 蛋白比產生無融合伴侶的疏水蛋白具有明顯更佳的產量。通過遺傳工程法從宿主生物體產生的融合疏水蛋白可按基本已知的方式處理，並 利用已知的層析法純化。在一個優選實施方案中，可使用公開於W0 2006/082253第11/12頁(第11頁第 15行-第11頁第33行)的簡化的處理和純化方法。為此，首先從發酵液分離發酵細胞，破碎並將細胞碎片與內含體分離。後者可方便 地通過離心進行。最後，為了釋放融合疏水蛋白，可通過酸、鹼和/或去汙劑，以基本已知的 方式破碎內含體。具有根據本發明使用的融合疏水蛋白的內含體一般已可用0. lm NaOH在 約1小時內完全溶解。若所需pH建立後是適合的，得到的溶液可不經進一步純化而用於實施本發明。然 而，也可從溶液中將融合疏水蛋白分離為固體形式。優選地，可按W0 2006/082253 (第11 頁第35行-第12頁第21行)中所述，利用噴霧制粒或噴霧乾燥進行分離。除細胞碎片殘 餘外，通過簡化的處理和純化方法獲得的產品一般包含約80-90襯％的蛋白質。對於所有蛋 白質的量，依據融合構建體和發酵條件，融合疏水蛋白的量一般是30-80wt %。分離的包含融合疏水蛋白的產品可以以固體保存，並在各種情況中溶解於希望的 介質來使用。對實施本發明，融合疏水蛋白可就如此使用，或經切割並除去融合伴侶後以「純」 疏水蛋白使用。在分離內含體並將其溶解後，方便地進行切割。
根據本發明，疏水蛋白用作滲透增強劑。在一個實施方案中，疏水蛋白與至少一種其他的滲透增強劑組合使用，其中至少 一種其他的滲透增強劑選自DMS0;SDS(十二烷基硫酸鈉)；二甲基甲醯胺；N-甲基甲醯 胺；一元醇或多元醇類，如乙醇、1，2_丙二醇、苄醇；具有8-10個碳原子的飽和和不飽和 脂肪醇，如十二醇或十六醇；烴類，如礦物油 』烷類；酯類；azones，如1_十二烷基氮雜環 庚-2-酮、丙二醇、脫乙醯殼多糖；飽和和不飽和脂肪酸類，如硬脂酸或油酸；具有至多24 個碳原子的脂肪酸酯類或具有至多24個碳原子的二羧酸二酯類，如甲酯類、乙酯類、異丙 酯類、丁酯類、仲丁酯類、異丁酯類、叔丁酯類；和乙酸、己酸、十二酸、十四酸、十八酸和十六 酸的單甘油酸酯類；磷酸鹽衍生物類，如卵磷脂；萜類；尿素及其衍生物類；和醚類，如二甲 基異山梨醇酯和二甘醇一乙基醚；膽酸鹽類；聚乙氧基乙烯類；EDTA ；橙花叔醇；氧化薴烯 類或磷脂類。在另一個尤其優選的實施方案中，疏水蛋白與DMS0或聚乙二醇組合用作滲透增 強劑。在本發明的另一個實施方案中，疏水蛋白與至少一種皮革護理和皮革加工中的其 他滲透增強劑組合用作滲透增強劑。在另一個尤其優選的實施方案中，疏水蛋白與至少一種皮革護理和皮革加工中的 其他滲透增強劑組合用作酸和鹼(例如羧酸或氨)、緩衝系統、聚合物、無機顆粒(如Si02 或矽酸鹽)、色料(如染料)、香料或抗微生物劑的滲透增強劑。在本發明的另一個實施方案中，增強了滲透通過相界。在另一個實施方案中，促進了活性成分的滲透。在本發明的一個實施方案中，活性成分理解為指具有藥學或生物學效應的所有物 質。因此活性成分是選自以下化合物藥物活性化合物、治療有效的化合物和生物活性化合 物、化妝活性化合物、支持化妝品要求(為了銷售的目的)的物質(如珍珠蛋白質)，其在質 量上和/或數量上影響(即促進、完全容許或抑制)生物體內的生化和/或生理過程。此外，活性成分以小量產生大的藥物學、化學、生物學或生理學效應。在此，認為小量是與活性成分滲透相界後到達的生物體的質量相對的。這產生了滲透通過相界的活性成分質量與生物體質量的商，其選自由 以下區間[lppt(l 1012)-10 % (1 10)]、[lppb(l 109-1 % (1 100)]、 [lppt(l 1012)-lppb(l 109]、[lppt(l 1012-1 1000)]、[lppb(l 109-1 1000)]、 [lppt (1 1012-lppm (1 106)]、[lppb (1 109-lppm (1 106)]、 [lppm(l 106-1 1000)]、[(1 1000)-1% (1 100)]。在本發明的一個變通方案中，生物體選自來自原生生物、細菌、真菌、植物或動物 界的特定個體及其部分(如細胞和細胞組織)。在本發明的另一種變通方案中，生物體是死亡的生物體或其部分，例如用來生產 皮革的獸皮。通過使用疏水蛋白作為滲透增強劑，與對照相比，活性成分的滲透可增強0.5%、 0. 6%,0. 7%、0. 9%或 1%。滲透有利地增強2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或 10%， 滲透尤其有利地增強11%、12%、13%、14%或10%，滲透及其有利地增強16%、17%、 18%、19%或10%或更高百分數。
本發明還提供疏水蛋白在生產在局部應用上提高活性成分吸收的組合物中的用 途。根據本發明疏水蛋白作為滲透增強劑的用途的另一個使用領域是皮膚製劑的產生。在一個實施方案中，由此將疏水蛋白用於製備選自軟膏劑、霜劑、凝膠劑和糊劑的 半固體藥劑形式或化妝品製劑。按照例如"Arzneiformelehre [Pharmacology] 『『 Ursula Sch6fflillg著，第 4 版， Deutsche Apotheker Verlag，2003，第353-392頁中所述製備半固體藥劑形式。除其中的輔劑外，製劑包含選自0. 000001-10wt %,0. 0001-10wt
0. 001-10wt%,0. 01-10wt%,0. l-10wt%^P l_10wt%的疏水蛋白部分，還包含分數選自 0. 000001-10wt%,0. 0001-10wt%,0. 001-10wt%,0. 01-10wt%,0. l-10wt%，n 活性成分部分。根據本發明疏水蛋白作為滲透增強劑的用途的另一個使用領域是用於治療或預 防某些皮膚和黏膜疾病的藥劑的產生。因此應用領域尤其是-病毒病(例如皰疹、柯薩奇病毒、水痘帶狀皰疹、巨細胞病毒等)；-細菌病(例如TB、梅毒等)；-真菌病(例如念珠菌病、隱球菌病、組織胞漿菌病、麴黴病、毛黴菌病等)；-腫瘤病(例如黑素瘤、腺瘤等)；-自身免疫病(例如尋常型天皰瘡、大皰性類天皰瘡、系統性紅斑狼瘡等)；-曬傷；-寄生蟲發作(例如抽搐、蟎、蚤等)；-昆蟲接觸(例如吸血昆蟲，如按蚊等)。在本發明的一個實施方案中，用於上述應用的製劑是如例如"Arzneiformelehr e [Pharmacology] " Ursula Sch6ffling著，第 4 版，Deutsche Apotheker Verlag,2003, 336-352頁中所述的氣體分散劑的形式。在本發明的一個實施方案中，用於上文指定的應用的製劑是如例如"Arzneifor me lehre [Pharmacology] 『『 Ursula Schfiffling 著，第 4 版， Deutsche Apotheker Verlag， 2003,468-471頁中所述，選自納米顆粒、納米懸液、脂質體、微乳和生物黏附製劑形式的釋 放系統的形式。除其中的輔劑外，製劑包含選自0. 000001-10wt %,0. 0001-10wt
0. 001-10wt%,0. 01-10wt%,0. l-10wt%^P l_10wt%的疏水蛋白部分，還包含分數選自 0. 000001-10wt%,0. 0001-10wt%,0. 001-10wt%,0. 01-10wt%,0. l-10wt%，n 活性成分部分。根據本發明疏水蛋白作為滲透增強劑的用途的另一個應用領域是包含活性成分 的膜、基質或硬膏的生產，例如選自由經皮治療系統TTS。這些按例如〃 Arzneiformelehre [Pharmacology] 〃 Ursula Sch6fflillg著，第 4 版，Deutsche Apotheker Verlag，2003，462-468 頁中所述製備。除其中的輔劑外，製劑包含分數選自0. 00000l-30wt %,0. 0001_30wt
0. 001-30wt%,0. 01-30wt%,0. l-30wt%^P l_30wt %的疏水蛋白部分，還包含分數選自0. 000001-30wt %,0. 0001-30wt %,0. 001-30wt %,0. 01-30wt %,0. l-30wt %、l-30wt % 和 0. l-50wt%、l-50wt%的活性成分部分。根據本發明疏水蛋白作為滲透增強劑的用途的另一個實施方案是產生化妝品制 劑。在一種變通方案中，這些製劑是頭髮化妝品、皮膚化妝品或牙齒化妝品製劑。在根 據本發明指定的製劑或組合物中，在本發明的一個實施方案中，可將效應分子用作活性成 分。效應分子在下文中理解為指具有某種可預測效應的分子。這些分子可以是蛋白質 樣分子(如酶)、非蛋白質性的分子(如染料、光防護劑、維生素和脂肪酸)或包含金屬離子 的化合物。在蛋白質樣效應分子中，優選酶、肽和抗體。在酶中，優選以下作為效應分子氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶、酪氨酸酶、金 屬結合酶、乳過氧化物酶、溶菌酶、澱粉糖苷酶、葡糖氧化酶、超氧化物歧化酶、光解酶、 calalase0植物和動物來源的蛋白質水解產物也是高度適合的蛋白質樣效應分子，例如海洋 來源的蛋白質水解產物或絲水解產物。尤其適合的是確定用於抗衰老的肽，如Matrixyl (INCI名稱甘油-水-丁二醇-卡 波姆-聚山梨醇酯20-棕櫚醯五肽-4)、Argire 1 ine (INCI名稱水，乙醯基-六肽-3)、 Rigin (INCI名稱水(和)_甘油(和)Steareth-20 (和)棕櫚醯四肽_7)、Eyeliss (INCI名稱 水-甘油-Hespiridin 甲基查耳酮-Steareth-20-二肽-2-棕櫚醯四肽-7)、Regu_Age (INCI 名稱氧化還原酶_大豆肽-Hydrilyzed米糠提取物)和Melanostatin-5 (INCI名稱水-葡 聚糖_九氨酸肽-1)。在非蛋白質樣效應分子中，優選染料，例如半永久性染料或氧化染料。對本發 明的分子，適合的染料是所有常用的染髮劑。本領域技術人員從化妝品手冊已知適合的 染料，例如 Schrader， Grundlagen und Rezepturen derKosmetika[Fundamentals and Formulations of Cosmetics]，Hiithig Verlag，Heidelberg，1989，ISBN 3-7785-1491-1。此外，優選抗氧化劑作為效應分子。抗氧化劑也稱為自由基清除劑，能中和所謂的 自由基。這些自由基是許多代謝過程和能量生產中生理性形成的攻擊性化合物。它們對身 體的防禦反應很重要，但也可引起對遺傳物質(DNA)、細胞膜和身體蛋白質的損傷。這種損 傷可導致早熟性組織老化、組織死亡和癌症。抗氧化劑包含類胡蘿蔔素抗壞血酸(維生素 C，E300)和L-抗壞血酸鈉(E301)和L-抗壞血酸鈣(E302)；抗壞血酸棕櫚酸酯(E304) ；丁 羥基苯甲醚(E320) ；丁基羥甲苯(E321)；鈣-二鈉-EDTA(E385)；沒食子酸鹽和沒食子酸丙 酯(E310)、沒食子酸辛酯(E311)和沒食子酸十二酯(沒食子酸月桂酯)(E312)；異抗壞血 酸(E315)和異抗壞血酸鈉(E316)；卵磷脂(E322)；乳酸(E270)；多磷酸鹽類，如二磷酸鹽 類(E450)、三磷酸鹽類(E451)和聚磷酸鹽類(E452) ；二氧化硫(E220)和亞硫酸鈉(E221)、 亞硫酸氫鈉(E222)、二硫化二鈉(E223)、亞硫酸鉀(E224)、亞硫酸鈣(E226)、亞硫酸氫鈣 (E227)、亞硫酸氫鉀(E228)；硒；生育酚(維生素E，E306)和a -生育酚(E307)、Y _生育 酚(E308)、6 -生育酚(E309)；錫II錫II錫II氯化錫II (E512)；檸檬酸(E330)和檸檬 酸鈉(E331)和檸檬酸鉀(E332) ；L-穀胱甘肽、L-半胱氨酸、多酚、黃酮類、植物雌激素、穀胱甘肽和抗氧化酶超氧化物歧化酶、穀胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶。根據本發明，作為抗氧化劑，至少一種化合物選自上述抗氧化劑。其他適合的效應分子是類胡蘿蔔素。根據本發明，類胡蘿蔔素理解為單 個地或作為混合物的下列化合物』-胡蘿蔔素、番茄紅素、葉黃素、蝦青素、玉米黃 素、隱黃素、桔黃素(citranaxanthin)、斑蝥黃、胭脂樹橙、0 ~4~阿樸胡蘿蔔素醛 (beta-Apo-4-carotenal)、& _8_ 阿樸胡蘿蔔素H (beta_Apo_8_carotenal)、& _8_ 阿樸胡 蘿蔔酸酯(carotenoic ester)。優選使用的類胡蘿蔔素是0 -胡蘿蔔素、番茄紅素、葉黃 素、蝦青素、玉米黃素、citranaxanthin和斑蝥素。在本發明的上下文中，類視黃醇指維生素A醇(視黃醇)和其衍生物，如維生素A 醛(視黃醛)、維生素A酸(視黃酸)和維生素A酯(例如視黃乙酸酯、視黃丙酸酯和視黃 棕櫚酸酯)。此處術語視黃酸包含全反式視黃酸，還有13-順-視黃酸。術語視黃醇和視黃 醛包含全反式化合物。優選用於根據本發明的懸液的類視黃醇是全反式視黃醇，下文中稱
為視黃醇。其他優選的效應分子是維生素，尤其是維生素A及其酯。維生素是在動物和人體內不合成或僅合成不足量的必需有機化合物。基於此定 義，已將13種成分或成分族分類為維生素。脂溶性維生素包含維生素A(視黃醇類)、維生 素D (麥角鈣化固醇類)、維生素E (生育酚類、生育三烯酚類)和維生素K(葉綠醌類)。水 溶性維生素包含維生素BJ硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B6 (吡哆醛族)、維生素 B12 (鈷胺素)、維生素C(L-抗壞血酸)、泛酸、生物素、葉酸和煙酸。來自A、C、E和F族的維生素類、維生素原類(provitamins)和維生素前體類，尤其 是3，4- 二去氫視黃醇、0 _胡蘿蔔素(維生素A的維生素原)、抗壞血酸(維生素C)和抗 壞血酸的棕櫚酸酯類、抗壞血酸的葡糖苷類或磷酸酯類、生育酚類、尤其是a-生育酚，和其 酯例如乙酸酯、煙酸酯、磷酸酯和琥珀酸酯，以及理解為表示必需脂肪酸的維生素F，特別是 亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸。維生素E是一組具有抗氧化和非抗氧化效應的八種(至今)脂溶性物質的集合術 語。維生素E是動物細胞的所有膜的成分，但僅由具有光合活性的生物體形成，如植物和藍 細菌。已知的八種維生素E形式中，四種是生育酚類(a-生育酚、生育酚、生育酚 和S-生育酚)。迄今已知的維生素E的另外四種形式稱為生育三烯酚類(a-生育三烯 酚、生育三烯酚、生育三烯酚和生育三烯酚)。此外，這些物質的衍生物(如 a-生育酚乙酸酯)也可以是有利的。維生素A及其衍生物和維生素原有利地表現獨特的皮膚光滑效應。根據本發明，優先使用的維生素B族的維生素、維生素原或維生素前體或其衍生 物和2-呋喃酮的衍生物尤其是包含維生素&，俗名硫胺素，化學名3_[(4』 -氨基-2』 -甲基-5』 -嘧啶基)_甲 基]-5- (2-羥乙基)-4-噻唑氯化物。維生素B2，俗名核黃素，化學名7，8_ 二甲基-10-(1_D-核糖醇基(ribityl))-苯 並[g]蝶啶_2，4(3H，10H)_ 二酮。核黃素在例如乳清中以游離形式存在，其他核黃素衍生 物可從細菌和酵母分離。來素黃素是同樣適合於本發明的核黃素立體異構體，其可從魚粉 或肝臟分離，且具有D-阿糖醇基(arabityl)而非D_核糖醇基。
維生素B3。這個名稱常用於化合物煙酸和煙醯胺(尼克醯胺)。根據本發明，優 選煙醯胺。維生素B5 (泛酸和泛醇)。優選使用泛醇。根據本發明可使用的泛醇衍生物尤其 是泛醇的酯和醚，以及陽離子化衍生的泛醇。在本發明的另一個優選實施方案中，除泛酸或 泛醇外，也可使用2-呋喃酮的衍生物。尤其優選的衍生物還有市售物質，俗名泛內酯(默 克(Merck))的二氫_3羥基-4，4-二甲基1-2(3H)_呋喃酮、4羥甲基-Y-丁內酯(默克)、 3，3-二甲基-2-羥基-g-丁內酯(Aldrich)和2，5-二氫-5-甲氧_2_呋喃酮(默克)，明 確地包括所有立體異構體。維生素B6，其在此處不理解為表示均一的物質，而是俗名為吡哆醇、吡哆胺和吡哆 醛的已知的5-羥甲基-2-甲基吡啶-3-醇的衍生物。維生素B7(生物素)，也稱為維生素H或「皮膚維生素」。生物素是(3aS，4S， 6aR) -2-氧六氫噻吩[3，4-d]咪唑-4-戊酸。根據本發明尤其優選泛醇、泛內酯、煙醯胺和生物素。根據本發明，可使用適合的衍生物(鹽、酯、糖、核苷酸、核苷、肽和脂)。作為來自該類型的親脂的、可油溶性的抗氧化劑，優選生育酚和其衍生物、沒食子 酸酯、黃酮類和類胡蘿蔔素類，以及丁基羥甲苯/茴香醚。優選的水溶性抗氧化劑是胺基酸 (例如酪氨酸和半胱氨酸)和其衍生物，以及單寧酸，尤其是植物來源的單寧酸。三萜，尤其是三萜酸(triterpenoic acid)，如烏索酸、迷迭香酸、樺木酸、乳香酸 和瀉根酸。其他優選的效應分子優選低劑量果酸(a _羥酸)，例如蘋果酸、檸檬酸、乳酸、酒
石酸、乙醇酸。根據本發明，至少從上述果酸類型中選擇一種化合物作為效應分子。這些效應分子可按以0. 1% _35%、優選0. 1% -10%、尤其是_10%、1% -5% 的濃度存在。其他優選的效應分子是尿素及其衍生物。這些效應分子可以0. 1% -25%、優選 0. 1% -10%、尤其是-10%A% -5%的濃度存在。在本發明的一個實施方案中，將效應分子連接至疏水蛋白多肽序列。將效應分子連接至疏水蛋白多肽序列。效應分子和疏水蛋白多肽序列間的結合可 以是共價的或基於離子或範德瓦爾斯相互作用。優選共價連接。這可通過例如疏水蛋白多肽序列的側鏈進行，尤其是通過氨基官 能團或羧基官能團或巰基官能團進行。優選通過一個或多個賴氨酸基團的氨基官能團、一 個或多個半胱氨酸的巰基官能團、或通過疏水蛋白多肽的N端或C端官能團的連接。效應 分子與疏水蛋白多肽序列的連接可直接進行，即作為效應分子和疏水蛋白多肽序列中已有 的兩個化學官能團的共價連接，例如疏水蛋白多肽序列的氨基官能團與效應分子的羧基官 能團連接成醯胺。然而，也可通過所謂的連接體進行連接，即至少雙功能團分子，其用一個 官能團參與與疏水蛋白多肽序列的一個官能團形成的鍵，而用另一個官能團與效應分子連 接。若效應分子同樣由多肽序列組成，則效應分子和疏水蛋白多肽序列的連接可通過 所謂的融合蛋白質進行，即由這兩部分序列(即效應分子和疏水蛋白多肽序列)組成的連續多肽序列。也可能在效應分子和疏水蛋白多肽序列之間插入所謂的間隔元件，例如具有蛋白 酶、脂肪酶、酯酶、磷酸酶、水解酶的潛在切割位點的多肽序列，或允許融合蛋白質的簡單純 化的多肽序列，例如所謂的His標籤，即寡聚組氨酸基團。在非蛋白質樣效應分子的情況中，與疏水蛋白多肽序列的連接優選通過疏水蛋白 多肽上可功能化的基團(側鏈基團)進行，其該基團與效應分子化學官能團形成共價鍵。在此優選通過疏水蛋白多肽的氨基、巰基或羥基官能團的鍵連接，這些官能團可 選地在激活後，可與例如效應分子的羧基官能團形成對應的醯胺鍵、硫酯鍵或酯鍵。另一種優選的疏水蛋白多肽序列與效應分子的連接是使用定製的(tailored)連 接體。這種連接體具有兩個或多個所謂的結合團，通過結合團，其可連接疏水蛋白多肽序列 和一個或多個效應分子。例如，疏水蛋白肽的結合團可以是巰基官能團，通過該官能團，連 接體可與疏水蛋白多肽的半胱氨酸基團形成二硫鍵。效應分子的結合團可以是例如羧基官 能團，通過該官能團，連接體可與效應分子的羥基官能團形成酯鍵。這種定製的連接體的使用允許對希望的效應分子的連接的精確匹配。此外，從而 可能按確定的方式將多個效應分子與疏水蛋白多肽序列連接。所用的連接體由待偶聯的功能性決定。合適的分子例如利用巰基反應基團(例如 馬來醯亞胺、吡啶基二硫化物、a -滷代乙醯基、乙烯碸)偶聯至疏水蛋白多肽、利用下列基 團與效應分子偶聯的分子，所述下列基團是_巰基反應基團(例如馬來醯亞胺、吡啶基二硫化物、a-滷代乙醯基、乙烯碸)、 胺反應基團(例如琥珀醯亞胺酯、碳二亞胺、羥甲基膦、亞氨酸酯、PFP等)；-糖和氧化糖反應基團(例如胼類等)；-羧基反應基團(例如碳二亞胺類等)；-羥基反應基團(例如異氰酸酯類等)；-胸腺嘧啶反應基團(例如補骨脂素等)；-非選擇性基團(例如芳基氮化物類等)；-光活化基團(例如全氟苯基氮化物等)；-金屬絡合基團(例如EDTA、heXahis、鐵蛋白)；-抗體和抗體片段(例如單鏈抗體、抗體的F(ab)片段、催化抗體)。備選地，例如可利用碳二亞胺、戊二醛或本領域技術人員已知的其他交聯劑，在活 性成分/效應物質和角蛋白結合結構域間進行直接偶聯，連接體可以是穩定的、可熱切割的、可光切割的或可酶切割的(尤其是通過脂肪 酶、酯酶、蛋白酶、磷酸酶、水解酶等)。對應的化學結構為本領域技術人員已知並插入分子 的各部分之間。可用於本發明分子的可酶切割的連接體的實例在W0 98/01406(第3頁第30 行-第23頁第9行)中說明，其全部內容在此明確引用作為參考。根據本發明包含疏水蛋白作為滲透增強劑的製劑在人用化妝品(尤其是皮膚護 理和頭髮護理、牙齒護理)、動物護理、皮革護理和皮革加工中具有相對寬的應用領域。優選地，製劑用於皮膚、指甲、牙齒和頭髮化妝品。它們允許皮膚護理、指甲護理、 牙齒和頭髮護理或皮膚保護、指甲保護、牙齒保護和頭髮保護效應物質的高濃度和長作用時間。對生產頭髮化妝品、牙齒化妝品或皮膚化妝品製劑，適合的輔劑和添加劑為本 領域技術人員已知和見於化妝品手冊，例如Schrader，Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika[Fundamentals andFormulations of Cosmetics],Hiithig Verlag,Heidelberg, 1989， ISBN 3-7785-1491-1。根據另一個實施方案，這種頭髮化妝品或皮膚化妝品或牙齒化妝品製劑用於皮膚 或頭髮或牙齒的護理和保護，它們是乳劑、分散劑、混懸劑、水性表面活性劑、奶、洗液、霜 劑、香脂劑(balm)、軟膏劑、凝膠劑、顆粒劑、粉劑、棒製劑(如唇膏)、泡沫、氣溶膠或噴霧的 形式。這種製劑高度適合於局部用製劑。適合的乳劑是水包油乳劑(0/W型)和油包水乳 劑(W/0型)或微乳。通常，頭髮化妝品、牙齒化妝品或皮膚化妝品製劑用於皮膚(局部)、牙齒或頭髮 的應用。局部用製劑在此理解為指適合以良好的分布和優選以可被皮膚吸收的形式將活性 成分塗至皮膚的那些製劑。對此具有適合性的是例如水和水_醇溶液、噴霧、泡沫、泡沫氣 霧劑、軟膏劑、水凝膠、0/W或W/0型乳劑、微乳或化妝棒製劑。根據本發明的化妝品組合物的優選實施方案，組合物包含載體。優選的載體是水、 氣體、基於水的液體、油、凝膠、乳劑或微乳、分散劑或其混合物。指定的載體表現良好的皮 膚相容性。水凝膠、乳劑或微乳對局部用製劑尤其有益。可使用的乳化劑是非離子表面活性劑、兼性離子表面活性劑、兩性表面活性劑或 陰離子乳化劑。根據組合物，乳化劑可按0. l_10wt%、優選1-5襯％的量存在於本發明的組 合物中。可使用的非離子表面活性劑是例如來自以下的表面活性劑2-30摩爾的環氧乙烷和/或0-5摩爾的環氧丙烷加成至具有8-22個碳原子的 直鏈脂肪醇、具有12-22個碳原子的脂肪酸，和烷基具有8-15個碳原子的烷基酚的加成產 物；1-30摩爾環氧乙烷加至甘油的加成產物的C12/18脂肪酸單酯或二酯；具有6-22個碳原子的飽和和不飽和脂肪酸的甘油單酯和二酯、脫水山梨糖醇單 酯和二酯，及其環氧乙烷加成產物；烷基中具有8-22個碳原子的烷基單糖苷或寡糖苷及其乙氧基化類似物；15-60摩爾環氧乙烷加成至蓖麻油和/或氫化蓖麻油的加成產物；多元醇酯，尤其是聚甘油酯，例如聚甘油聚蓖酸酯、聚甘油聚-12-羥基硬脂酸酯 或聚甘油dimerate。來自這些物質種類的兩種或多種化合物的混合物也同樣適合；2-15摩爾環氧乙烷加成至蓖麻油和/或氫化蓖麻油的加成產物；基於直鏈、支鏈、飽和或不飽和的(6/22脂肪酸類、蓖麻油酸和12-羥基硬脂酸、甘 油、聚甘油、季戊四醇、二季戊四醇、糖醇類(如山梨醇)、烷基葡糖苷類(例如甲基葡糖苷、 丁基葡糖苷、十二烷基葡糖苷)和聚葡糖苷類(例如纖維素)的偏酯；單烷基磷酸類、二烷基磷酸類和三烷基磷酸類、單PEG、二 PEG和/或三PEG烷基磷 酸類及其鹽；羊毛蠟醇類；聚矽氧烷_聚烷基_聚醚共聚物類或對應的衍生物；
如DE-C 1165574中的季戊四醇、脂肪酸、檸檬酸和脂肪醇的混合酯，和/或具有 6-12個碳原子的脂肪酸、甲基葡萄糖、多元醇(優選甘油或聚甘油)和聚二醇的混合酯；甜菜鹼。此外，兼性離子表面活性劑可用作乳化劑。兼性離子表面活性劑是用來指分子中 具有至少一個季銨基團和至少一個羧基基團或一個磺酸鹽基團的表面活性化合物的術語。 尤其適合的兼性離子表面活性劑是所謂的甜菜鹼，如N-烷基-N，N- 二甲銨甘氨酸鹽(例如 椰油烷基二甲銨甘氨酸鹽)、N-醯基氨基丙基-N，N 二甲銨甘氨酸鹽(例如椰油醯基氨基丙 基二甲銨甘氨酸鹽)、各種情況中在烷基或醯基內具有8-18個碳原子的2-烷基-3-羧甲 基-3-羥乙基咪唑啉，和椰油醯基氨基乙基羥乙基羧甲基甘氨酸鹽，尤其優選在CTFA名稱 Cocamidopropyl Betaine下已知的脂肪酸醯胺衍生物。兩性表面活性劑是同樣適合的乳化劑。兩性表面活性劑理解為指表面活性化合 物，其分子中除C8,18-烷基或醯基基團外，包含至少一個游離氨基和至少一個-C00H或-S03H 基團，並能形成內鹽。適合的兩性表面活性劑的實例是N-烷基甘氨酸、N-烷基丙酸、N-烷 基氨基丁酸、N-烷基亞氨基二丙酸、N-羥乙基-N-烷基氨基丙基甘氨酸、N-烷基牛磺酸、 N-烷基肌氨酸、2-烷基氨基丙酸，和各種情況中在烷基內具有約8-18個碳原子的烷基氨基 乙酸。尤其優選的兩性表面活性劑是N-椰油烷基氨基丙酸鹽、椰油醯基氨基乙基氨基 丙酸鹽和C12/18醯基肌氨酸。除兩性乳化劑外，季化乳化劑也適合，尤其優選esterquat類 型的四元乳化劑，優選甲基季銨化的二脂肪酸三羥乙基胺酯鹽。此外，可使用的陰離子乳化 劑是烷基醚硫酸鹽類、甘油一酯硫酸鹽類、脂肪酸硫酸鹽類、磺基丁二酸鹽類和/或醚羧酸 類。適合的油體是基於具有6_18(優選8-10)個碳原子的脂肪酸的Guerbet醇、直 鏈c6-c22脂肪酸與直鏈c6-c22脂肪醇的酯、支鏈c6-c13羧酸與直鏈c6-c22脂肪醇的酯、直鏈 C6-C22脂肪酸與支鏈醇(尤其是2-乙基己醇)的酯、直鏈和/或支鏈脂肪酸與多羥基醇 (例如丙二醇、dimerdiol或trimertriol)和/或Guerbet醇的酯、基於C6_C10脂肪酸的 甘油三酯類、基於C6-C18脂肪酸的液體甘油一酯/ 二酯/三酯的混合物、C6-C22脂肪醇和/ 或Guerbet醇與芳香羧酸(尤其是苯甲酸)的酯、C2_C12 二羧酸與具有1_22個碳原子的直 鏈或支鏈醇或具有2-10個碳原子和2-6個羥基的多元醇的酯、植物油、支鏈伯醇、取代環 己烷、直鏈C6-C22脂肪醇碳酸酯、Guerbet碳酸酯、苯甲酸與直鏈和/或支鏈C6_C22醇(例 如FinsoIv TN)的酯、二烷基醚、多元醇環氧化的脂肪酸酯的開環產物、矽油和/或脂肪 族或環烷烴類。矽氧烷化合物也是可用的油體，例如二甲基聚矽氧烷；甲基苯基矽氧烷；環 狀矽氧烷；氨基、脂肪酸、醇、聚醚、環氧、氟、烷基和/或糖苷修飾的矽氧烷化合物，其在室 溫下可以是液體或樹脂樣。根據組合物不同，油體可按l_90wt%、優選5-80wt%、尤其是 10-50wt %的量存在於本發明的組合物中。用於除臭劑的適合的效應分子(ii)尤其是芳香油、環糊精類、離子交換劑、蓖麻 油酸鋅、抗微生物/抑菌化合物(例如DCMX、Irgasan DP300、TCC)。以下適合用作止汗劑單寧類和鋅/鋁鹽。除已述輔劑外，製劑包含選自 0. 000001-10wt%,0. 0001-10wt%,0. 001-10wt%, 0. 01-10wt%,0. l_10wt%禾口 l_10wt%的疏水蛋白部分。
在本發明的一個實施方案中，將疏水蛋白用作作物保護組合物中的滲透增強劑。本發明還提供製備包含疏水蛋白的作物保護組合物的方法，以及包含疏水蛋白的 作物保護組合物。除已述輔劑外，作物保護組合物包含選自0. 00000l_10wt%、0.000l_10wt%、 0. 001-10wt%,0. 01-10wt%,0. l-10wt%禾口 l_10wt%的疏水蛋白部分。活性成分和/或效應物質的含量可在大範圍內變化。具體而言，兩性聚合物組合 物允許所謂活性成分濃縮物的製備，該濃縮物含至少5wt%的活性成分量，例如根據組合物 的總重量，以5-50wt%的量、尤其是5-20wt%的量包含活性成分。有利地，本發明的水性活性成分組合物可配製為無溶劑或低溶劑的，即根據組合 物的總重量，水性活性成分組合物中有機溶劑的部分通常是不超過10wt%，優選不超過 5wt%，優選不超過lwt%。大量不同的活性成分和效應物質可配製入本發明的水性組合物。本發明的特定實 施方案涉及用於作物保護的活性成分(即除草劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、殺蟎劑、殺蟲劑的 活性成分)和調節植物生長的活性成分的配製。可配製為本發明的水性活性成分組合物的殺真菌活性成分的實例包含-醯基丙氨酸，如苯霜靈、甲霜靈、呋醯胺、惡霜靈；-胺衍生物，如aldimorph、多果定、十二環嗎啉、丁苯嗎啉、苯鏽啶、雙胍鹽、雙胍 辛胺、spiroxamin、十三嗎啉；-苯胺基嘧啶，如嘧黴胺、嘧菌胺或cyrodinyl；-抗生素，如放線菌酮、灰黃黴素、casugamycin、遊黴素、多氧菌素和鏈黴素；-吡咯類，如聯苯三唑醇、bromoconazole、環丙唑醇、苯醚甲環唑、 dinitroconazole、氟環唑、腈苯唑、fluquiconazole、氟矽唑、粉唑醇、己唑醇、抑黴唑、種菌 唑、葉菌唑、腈菌唑、配那唑、丙環唑、咪鮮胺、丙硫菌唑、戊唑醇、氟醚唑、三唑酮、三唑醇、氟 菌唑、滅菌唑；-如通過通式描述於EP-A897904中的2_甲氧基二苯酮類，例如metrafenone ；-二羧醯亞胺類，如異菌脲、甲菌利、腐黴利、乙烯菌核利；-二硫代甲氨酸酯類，如福美鐵、代森鈉、代森錳、代森錳鋅、威百畝、代森聯、丙森 鋅、代森福美鋅、福美雙、福美鋅、代森鋅；-雜環化合物，如敵菌靈、苯菌靈、啶醯菌胺、苯咪氨甲酯、萎鏽靈、氧化萎鏽靈、 cyazofamid、福美甲酯、二氰蒽醌、famoxadone、fenamidone、氯苯嘧啶醇、麥穗寧、氟醯胺、 福拉比、異丙硫環、滅鏽胺、氟苯嘧啶醇、picobezamid、噻菌靈、proquinazid、碇斑肟、咯喹 酮、喹氧靈、silthiofam、噻苯咪唑、噻呋醯胺、甲基硫菌靈、tiadinil、三環唑、嗪氨靈；-硝基苯基衍生物，如樂殺蟎、消蟎普、消蟎通、nitrophthal-isopropyl；-苯基吡咯，如拌種咯和咯菌腈；—未分類的殺真菌劑，如 acibenzolar-S_methyl、benthiavalicarb、carpropamid、 百菌清、cyflufenamid、霜脲氰、噠菌酮、diclocymet、乙黴威、稻瘟光、ethaboxam、環醯菌 胺、醋酸三苯錫、氰菌胺(fenoxanil)、嘧菌腙、氟啶胺、三乙膦酸(fosetyl)、三乙膦酸鋁、 iprovalicarb、六氯苯、metrafenone、戊菌隆、霜黴威、苯酞、toloclofos-methyl、五氯硝基 苯、zoxamide ；
-W0 03/075663中通過通式I描述的strobilurins，例如腈嘧菌酯、醚菌胺、 fluoxastrobin、苯丙菌酯、苯氧菌胺、肟醚菌胺、啶氧菌酯、pyraclostrobin和布洛芬；_次磺酸衍生物，如敵菌丹、克菌丹、抑菌靈、滅菌丹、對甲抑菌靈；-肉桂醯胺和類似物，如烯醯嗎啉、flumetover、flumorp；-描述於例如W0 98/46608,W0 99/41255 或 W0 03/004465 中的 6-芳基-[1，2，4] 三唑並[l，5-a]嘧啶(各種情況中通過通式I，第1頁第8行-第11頁第45行，以及式1A 和表1-44，和W0 03/00465中的表A描述的化合物)；-醯胺殺真菌劑，如環二氯磺胺和(Z)-N_[a-(環丙基甲氧乙氨基)_2，3_二 氟-6_( 二氟甲氧基)苄基]-2-苯乙醯胺。可配製為本發明的水性活性成分組合物的除草劑的實例包含-1,3,4-噻二唑，如丁噻咪草酮和三環塞草胺；_醯胺，如二丙烯草胺、新燕靈、溴丁醯草胺、草克樂、哌草丹、噻吩草胺、草乃敵、乙 氧苯草胺、甲基麥草伏、殺木膦、異惡草胺、吡唑草胺、甲草胺、乙草胺、異丙甲草胺、殺草利、 抑草生、拿草特、敵稗；-氨基磷酸類，如雙丙氨醯膦、buminafos、草銨膦、草甘磷、草硫膦；_氨基三唑類，如氨基連三唑、醯苯胺類(如莎稗磷)、苯噻醯草胺；-芳氧基鏈烷酸，如2，4-D、2，4-DB、氯甲醯草胺、2，4_滴丙酸、精2，4_滴丙酸、2，4， 5_涕丙酸、氟草煙、MCPA、MCPB、2-甲-4氯丙酸、精2-甲-4氯丙酸、草萘胺、napropanilide、 定草酯_苯甲酸類，如草滅平、麥草畏；-benzothiadiazinones,如苯達松；-漂白劑類，如異惡草松、吡氟醯草胺、氟咯草酮、氟胺草唑、氟啶草酮、吡唑特、磺 草酮；_氨基甲酸酯類，如雙醯草胺、氯炔靈、氯普芬、甜菜安、甜菜寧、滅草猛；_喹啉酸類，如二氯喹啉酸、氯甲喹啉酸；-二氯丙酸類，如茅草枯；-二氫苯並呋喃類，如乙氧呋草黃；- 二氫呋喃-3-酮，如呋草酮；-二硝基苯胺類，如氟草胺、地禾安、敵樂胺、乙丁烯氟靈、氟消草、異丙樂靈、甲磺 樂靈、氨磺樂靈、二甲戊靈、氨氟樂靈、環丙氟靈、氟樂靈；二硝基酚類(如溴酚肟)、地樂酚、 乙酸地樂酚、特樂酚、DN0C、minoterb acetate ；_ 二苯基醚類，如三氟羧草醚鈉、苯草醚、甲羧除草醚、草枯醚、枯莠隆、 ethoxyfen、消草醚、乙羧氟草醚、氟磺胺草醚、呋氧草醚、乳氟禾草靈、除草醚、三氟甲草醚 (nitrofluorfen)、乙氧氟草醚；_聯吡啶類，如牧草快(cyperquat)、野燕枯甲基硫酸鹽、敵草快、二氯百草枯；-咪唑類，如丁咪醯胺；-味唾琳麗類，如 imazamethapyr、滅草煙、滅草喧、imazethabenz—methyl、味草 煙、甲基咪草煙、甲氧咪草煙(imazamox)；-噁二唑類，如滅草唑、炔惡草酮、惡草酮；
-環氧乙烷類，如滅草環；-酚類，如溴草腈、碘苯腈；-苯氧基苯氧基丙酸酯，如炔草酯、氰氟草酯、禾草靈、惡唑禾草靈、精惡唑禾草靈、 fenthiapropethyl、吡氟禾草靈(fluazifop-butyl)、精吡氟禾草靈、氟吡乙禾靈、氟吡禾 靈、精氟吡禾靈、異惡草醚、惡草酸、喹禾靈、精喹禾靈、喹禾糠酯；-苯乙酸類，如伐草克；-苯丙酸類，如 chlorophenprop-methyl ；_無機焦磷酸鹽活性成分，如吡草酮、吲哚酮草酯、氟烯草酸、丙炔氟草胺、炔草胺、 flupropacil、，草P坐、甲石黃草月安、thidiazimin ；-吡唑類，如吡氯草胺(nipyraclofen)；-噠嗪類，如氯草敏、馬來酸醯酐、達草滅、噠草特；_吡啶羧酸類，如二氯吡啶酸、氟硫草定、毒莠定、噻草定(thiazopyr)；-嘧啶醚類，如pyrithiobac acid、嘧草硫醚、KIH-2023、KIH-6127 ；-氨磺醯，如唑嘧磺草胺、磺草唑胺；-triazolecarboxamides,如 triazofenamid ；-尿嘧啶類，如除草定、環草定、特草定；-還有草除靈、呋草黃、地散磷、氟草黃(benzofluor)、苯達松、抑草磷、唑草胺 (cafenstrole)、二甲基敵草索、環庚草醚、敵草腈、橋氧酞鈉、fluorbentranil、氟草磺、氟 草石黃月安(perf luidone)、！M草憐、topramezone 禾口 prohexanedione—calcium ；-磺醯脲類，如醯嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、環 胺磺隆、胺苯磺隆、啶嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、甲磺隆、煙嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺 隆、吡嘧磺隆、碸嘧磺隆、甲嘧磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆 (tritosulfuron)；-環己烯酮型的作物保護活性成分，如禾草滅、烯草酮、cloproxydim、噻草酮、稀 樂定和三甲苯草酮。尤其優選的環己烯酮型的除草活性成分是印ralOXydim(cf.AGR0W， No. 243，3. 11. 95，第 21 頁，caloxydim)和 2-(1_[2-{4_ 氯苯氧基}丙基-氧亞胺基]丁 基)~3~羥基-5- (2H-四氫噻喃-3-基)-2-環己烯-1-酮；尤其優選的磺醯脲型除草活性成 分是N- (((4-甲氧基-6-[三氟甲基]-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)羰基)-2-(三氟甲基) 苯磺醯胺。可配製為本發明的水性活性成分組合物的殺蟲劑的實例包含-有機磷酸鹽類，如高滅磷、保棉磷、毒死蜱、毒蟲畏、二嗪農、敵敵畏、甲基毒蟲畏、 蔬果磷、百治磷、樂果、乙拌磷、乙硫磷、EPN、殺螟松、倍硫磷、異噁唑磷、馬拉硫磷、甲胺磷、 殺撲磷、甲基對硫磷、速滅磷、久效磷、碸吸磷、對氧磷、對硫磷、稻豐散、伏殺硫磷、亞胺硫 磷、磷胺、甲拌磷、辛硫磷、甲嘧硫磷(pirimiphos-methyl)、丙溴磷、丙硫磷、嘧啶磷、吡唑硫 磷、噠嗪硫磷、sulprophos、三唑磷、敵百蟲、司替羅磷、蚜滅多；-氨基甲酸酯，如棉鈴威、丙硫克百威、噁蟲威、甲萘威、克百威、呋喃威、苯氧威、呋 線威、全壘打(indoxacarb)、滅蟲威、滅多蟲、草氨醯、抗蚜威、殘殺威、硫雙威、唑蚜威；-擬除蟲菊酯類，如聯苯菊酯、氟氯氰菊酯、乙氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、殺滅 阿菊酯、醚菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯、三氟氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氯菊酯、矽白靈(silafluofen), τ -氟胺氰菊酯、七氟菊酯、四溴菊酯、α -氯氰菊酯、ζ-氯氰菊酯、氯菊酯；_節肢動物生長調節劑a)殼多糖合成抑制劑，例如苯甲醯脲類，如氟啶脲、除蟲 脲、氟環脲、氟蟲脲(flufenoxuron)、氟鈴脲、氯芬奴隆、novaluron、氟苯脲、殺鈴脲；噻嗪 酮、diofenolan、噻蟎酮、etoxazole、clofentazine ；b)蛻皮激素拮抗劑，如氯蟲醯胼、甲氧 蟲醯胼、蟲醯胼；c) juvenoids，如吡丙醚、烯蟲酯、苯氧威；d)脂質生物合成抑制劑，如螺蟎酯。-neonicotinoids,如氟啶蟲醯胺、可尼丁、dinotefuran、吡蟲啉、快勝 (thiocyclam)、烯唆蟲胺、nithiazin、唆蟲脈、thiacloprid ；_其他未分類的殺蟲劑，如阿巴克丁、滅蟎醌、啶蟲脒、雙甲脒、印楝素、殺蟲磺殺蟲 齊U、巴丹、蟲蟎腈、氯苯脒、環丙馬秦、丁醚脲、dinetofuran, diofenolan、依馬菌素、硫丹、 ethiprole、喹蟎醚、氟蟲腈、伐蟲脒、伐蟎脒、Y-HCH伏蟻腙、吡蟲啉、全壘打、異丙威、速滅 威、噠蟎靈、吡蚜酮、spinosad、吡蟎胺、噻蟲嗪、殺蟲環、XMC和滅殺威；和-N-苯基縮氨基脲，如EP-A 462 456中通式I所描述，尤其是通式IV的化合物 其中Rll和R12彼此獨立地為氫、滷素、CN、C1-C4_烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-滷 代烷基或C1-C4-滷代烷氧基；R13為C1-C4-烷氧基、C1-C4-滷代烷基或C1-C4-滷代烷氧 基,例如Rl為3-CF3、R2為4-CN和R3為4-0CF3的化合物IV。可用的生長調節劑是例如矮壯素、縮節胺、調環酸鈣鹽或來自赤黴素家族的成員。 赤黴素包含例如赤黴素GAl、GA3、GA4、GA5和GA7等，和對應的外-16，17- 二氫赤黴素，及 其衍生物，例如與C1-C4羧酸的酯。根據本發明，優選外-16，17- 二氫-GA513-乙酸酯。本發明的優選實施方案涉及本發明的疏水蛋白在製備殺蟲劑的水性活性成分組 合物中的用途，尤其是strobilurins、吡咯和6-芳基三唑並[l，5a]嘧啶，如各種情況中通 過通式I描述於例如WO 98/46608、WO 99/41255或WO 03/004465 (第1頁第8行-第11 頁第45行，以及WO 03/00465中式IA以及表1_44和表A描述的化合物)，尤其是通式V的
活性成分， 其中
Rx是NR14R15基團或直鏈或支鏈的C1-C8烷基，其任選被滷素、OH、C1_C4_烷氧 基、苯基或C3-C6-環烷基、C2-C6-烯基、C3-C6-環烷基、C3-C6-環烯基、苯基或萘基，其中 所述的最後4個基團可具有選自滷素、0H、C1-C4-烷基、C1-C4-滷代烷氧基、C1-C4-烷氧基 和C1-C4-滷代烷基的1、2、3或4個取代基；
R14、R15彼此獨立，為滷素、C1_C8_烷基、C1-C8-滷代烷基、C3-C10-環烷基、 C3-C6-商代環烷基、C2-C8-烯基、C4-C10-鏈二烯基、C2-C8-商代烯基、C3-C6-環烯基、 C2-C8-商代環烯基、C2-C8-炔基、C2-C8-商代炔基或C3-C6-環炔基；R14和R15與它們結合的氮原子一起，是有5_8元雜環基，其通過N結合，可包含 1、2或3個來自0、N和S的其他雜原子作為環成員，和/或可攜帶一個或多個選自滷素、 C1-C6-烷基、C1-C6滷代烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-滷代烯基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-滷代 烷氧基、C3-C6-烯氧基、C3-C6-滷代烯氧基、(外)-C1-C6-亞烷基和氧-C1-C3-亞烷氧基 的取代基；L選自滷素、氰基、C1-C6-烷基、C1-C4-滷代烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C4-滷代烷 氧基和C1-C6-烷氧基羰基；Ll是滷素、C1-C6-烷基或C1-C6-滷代烷基，尤其是氟和氯；X是滷素、C1-C4-烷基、氰基、C1-C4-烷氧基或C1-C4-滷代烷基，優選滷素或甲基， 且尤其是氯。式V化合物的實例是5-氯-7-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a]嘧 啶；5-氯-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a]嘧 啶；5-氯-7-(嗎啉-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a]嘧啶；5-氯-7-(哌啶-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a]嘧啶；5-氯-7-(嗎啉-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a]嘧啶；5-氯-7-(異丙基氨基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-氯-7-(環戊基氨基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-氯-7-(2，2，2_ 三氟乙基氨基)-6-(2，4，6_ 三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a] 嘧啶；5-氯-7-(l，l，l-三氟丙烷-2-基氨基)-6-(2，4，6_三氟苯基)[1，2，4]三唑 並-[l，5_a]嘧啶；5-氯-7-(3，3_ 二甲基丁烷-2-基氨基)-6-(2，4，6_ 三氟苯基)[1，2，4]三唑 並-[l，5_a]嘧啶；5-氯_7-(環己基甲基)-6-(2，4，6_三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-氯_7-(環己基)-6-(2，4，6_三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-氯-7-(2-甲基丁烷-3-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧 啶；5-氯-7-(3-甲基丙烷-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧 啶；
5-氯-7-(4-甲基環己烷-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a] 嘧啶；5-氯 _7-(己烷-3-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a]嘧啶；5-氯-7-(2-甲基丁烷-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a]嘧 啶；5-氯-7-(3-甲基丁烷-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a]嘧 啶； 5-氯-7-(l-甲基丙烷-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[l，5_a]嘧 啶；5-甲基-7-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a] 嘧啶；5-甲基-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a] 嘧啶；5-甲基_7-(嗎啉-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-甲基-7-(哌啶-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-甲基_7-(嗎啉-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-甲基-7-(異丙基氨基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-甲基-7-(環戊基氨基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-甲基-7-(2，2，2_三氟乙基氨基)-6-(2，4，6_三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1， 5-a]嘧啶；5-甲基-7-(l，l，l-三氟丙烷-2-基氨基)-6-(2，4，6_三氟苯基)[1，2，4]三唑 並-[1，5-a]嘧啶；5-甲基-7-(3，3-二甲基丁烷-2-基氨基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並 [1,5-a]嘧啶；5-甲基_7-(環己基甲基)-6-(2，4，6_三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-甲基_7-(環己基)-6-(2，4，6_三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-甲基-7-(2-甲基丁烷-3-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a] 嘧啶；5-甲基-7-(3_ 甲基丙烷-1-基)-6-(2，4，6_ 三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a] 嘧啶；5-甲基-7-(4_甲基環己烷-1-基)-6_(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1， 5-a]嘧啶；5-甲基_7-(己烷-3-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a]嘧啶；5-甲基-7-(2_ 甲基丁烷-1-基)-6-(2，4，6_ 三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a] 嘧啶；5-甲基-7-(3-甲基丁烷-1-基)-6-(2，4，6-三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a] 嘧啶；5-甲基-7-(l-甲基丙烷-1-基)-6-(2，4，6_ 三氟苯基)[1，2，4]三唑並[1,5-a] 嘧啶。
本發明的另一個優選實施方案涉及用疏水蛋白作為滲透增強劑來生產殺蟲劑的 水性活性成分組合物的用途，尤其是芳基吡咯類(如蟲蟎腈)、擬除蟲菊酯(如聯苯菊酯、氟 氯氰菊酯、乙氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、殺滅阿菊酯、醚菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯、三氟 氯氰菊酯、λ -三氟氯氰菊酯、氯菊酯、矽白靈、τ -氟胺氰菊酯、七氟菊酯、四溴菊酯、α _氯 氰菊酯、ζ 「氯氰菊酯、氯菊酯)、neonicotinoids、式IV的縮氨基脲類、氟蟲腈的組合物。在本發明的一個實施方案中，用疏水蛋白作滲透增強劑導致產生預期效應所需 的活性成分濃度降低，這種降低達到1%、2%、3%、4%、5%、％、7%、8%、9%、10%，優 it 11%,12%,13%,14%,15%,16%,18%,20%,尤其優選 22%,25%,30%,35%,40%, 45%、50%，尤其是 60%、70%、80%、90%。
在本發明的一個實施方案中，首先將磷酸鹽緩衝溶液加至待處理的表面或相界。 將濃度為0. 01-0. 2wt%的疏水蛋白溶解於pH7. 5、50mM的NaH2P04。用疏水蛋白溶液孵育後，進行包含至少一種活性成分的製劑的應用。本發明還提供在局部應用中提高活性成分的吸收的方法，其中疏水蛋白的應用a)在活性成分之前；或b)與活性成分同時。本發明還提供在局部應用中改善活性物質吸收的組合物的生產方法，其中將固體 形式的疏水蛋白、有機或無機介質中的溶液或分散體形式的疏水蛋白引入至含有至少一種 活性成分的製劑中。
實施例實施例Ia背景是這樣的考慮細胞與能有效抗氧化的參考物質孵育，在作為滲透增強劑的 疏水蛋白 A(來自 W02007/14897 的 SEQ ID 20)或 B (來自 W02007/14897 的 SEQ ID 26)的 影響下，導致抗氧化能力增強。除已用參考物質和無滲透增強劑培養的培養物外，所用的對 照是未處理的培養物和載體處理的培養物。為確定劑量，在主要的實驗開始之前，利用細胞毒性測定(在此通過MTT轉化)測 試可用的濃度。基於這些預實驗，考慮到經濟的使用，選擇了 0. 001%的濃度來測定蛋白質對維生 素C、生育酚乙酸酯和五羥黃酮抗氧化能力的影響。使用的參考物質是維生素E ( α -生育酚 乙酸酯)、維生素C (Mg抗壞血酸磷酸酯)和五羥黃酮。使用的測試細胞是正常的皮膚結締 組織細胞(成纖維細胞)，因為這些細胞在評估方法中產生良好的信號強度。為確定溶液的抗氧化性質，將NHDF (正常的人皮膚成纖維細胞)接種至48-孔培 養板，培養至培養表面被完全覆蓋。然後用這些隨機培養物進行研究。首先，用測試溶液 處理培養物24小時。然後，去除培養基(含測試溶液)，用緩衝液洗滌細胞，與螢光染料 (DCFH)孵育。然後，去除所有未吸收的染料，洗滌樣品幾次，用無色的測定培養基處理細胞。 將包含細胞的培養板插入螢光閱讀器，並用沒有應激的預備階段開始測試。作為加入H2O2 的結果，在細胞內，自由基被反覆誘導，其與染料反應產生螢光衍生物。然而，若自由基預先 被抗氧化劑淬滅，則螢光衍生物的形成被阻止或減少。
因此，低螢光值指示高抗氧化能力。在3輪獨立的實驗中，這些實驗的每一個進行
6次重複。然後將研究結果表示為圖形。在全部135分鐘的運行時間中，為了清晰的目的，每90分鐘後攝取瞬時照片(完 整圖像見附件 )。y軸在此作為自由基與細胞內染料DCFH反應時發出的螢光，代表細胞內 的氧化應激(stress)。這意味著，低的條(bar)表示低氧化應激，從而作為補充的結果表示 細胞的高抗氧化能力。測量結束後用培養物的蛋白質含量對所有螢光值進行校正(用考馬 斯染色確定)。這補償了細胞數目的波動，這種波動也會引起螢光的波動(由於不同的染料 量)。因此顯示已經細胞計數校正的數據。生育酚乙酸酯自身對所進行的研究中使用的細胞系不具有抗氧化潛力。然而，在三輪實驗的兩輪中，在疏水蛋白A/生育酚乙酸酯和疏水蛋白B/生育酚乙 酸酯組合的情況中觀察到了氧化應激的降低。這可以解釋為蛋白質的弱陽性效應。在三輪實驗的兩輪中，疏水蛋白自身引起氧化應激的輕微下降，這僅可部分地負 責含生育酚乙酸酯的組合中氧化應激的下降。在第三輪中，這種影響最明顯。在這一輪中， 蛋白質自身未顯示出氧化應激的降低，而蛋白質和生育酚乙酸酯的組合顯示氧化應激的下 降(

圖1)。實施例Ib作為具有抗氧化潛能的另一種物質，在如實施例Ia的實驗條件、材料和方法下， 測試了五羥黃酮對氧化應激降低的影響。結果(圖2)顯示，與疏水蛋白蛋白質B組合，五羥黃酮的作用提高(0.05%的H蛋 白質B與0. 0006%的五羥黃酮組合)。實施例2疏水蛋白處理頭髮改善染髮劑中染料的吸收和結合。在這項測試中，使用了來自Kerling International Haarfabrik GmbH的歐洲人 自然金髮。對於染髮劑，測試了標準的商品化製劑(階段1)。測試變通方案1配製濃度為0. 01-0. 2wt%的疏水蛋白A或B。溶劑為pH 7. 5的50mMNaH2P04。為 了增加溶解速率，在室溫下用磁力攪拌器溶解1小時。此外，配製不含疏水蛋白的對比懸液。頭髮在32°C孵育1小時，然後用飲用水漂洗並乾燥。按生產商的說明應用染髮劑。用Penaten嬰兒洗髮香波溶液(1 % )反覆洗滌(1分鐘塗沫，1分鐘漂洗，室溫幹 燥)，然後在乾燥狀態評價。測試變通方案2配製濃度為0. 01-0. 2wt%的疏水蛋白A或B。溶劑為pH 7. 5的50mMNaH2P04。為 了增加溶解速率，在室溫下用磁力攪拌器溶解1小時。此外，配製不含疏水蛋白的對比懸液。頭髮在32°C孵育1小時，然後直接用頭髮乾燥器在50°C乾燥。
用飲用水漂洗頭髮並在室溫乾燥。按生產商的說明應用染髮劑(hair tint)。 用Penaten嬰兒洗髮香波溶液(1% )反覆洗滌(1分鐘塗沫，1分鐘漂洗，室溫幹 燥)，然後在乾燥狀態評價。尤其對於第一個測試變通方案，在用疏水蛋白A和B處理頭髮的情況中，可能觀察 到染料結合和吸收的增加。實施例3乳酸的皮膚滲透由於疏水蛋白處理而提高。疏水蛋白溶液的配製1.在Milipore水中配製的疏水蛋白A和B的濃溶液。通過在磁力攪拌器上 900轉/分劇烈攪拌45分鐘溶解疏水蛋白。2.配製Iml隨時可用的疏水蛋白溶液。800 μ 1 Millipore /K+100 μ 1 10 倍的緩衝液(500mM Tris, IOmM CaCl2, pH 8)+100 μ 1疏水蛋白溶液這對應於50mM Tris ImM CaCl2和pH 8中的0. 疏水蛋白濃溶液。實驗步驟1.將冰凍和脫毛的豬皮(未漂白)在室溫解凍。標記出尺寸約為2cmX2cm的應用區域；應用以下溶液(剝離)對照(無溶液)100 μ 1 0. H * A100 μ 1 0. H * B2.溶液在室溫孵育1. 5小時。為了去除存在的任何緩衝鹽，用2Χ500μ 1的Milipore水漂洗所有的應用區域並 用紙巾擦淨。3.在各種情況中對所有應用區域使用100 μ 1 15%濃度的乳酸。溶液在室溫孵育10分鐘；用紙巾去除過量的乳酸；在各應用區域測量豬皮的pH值。進行三次測量並使用平均值。用紙巾擦去pH測 量後存在的水。使用來自Courage & Khazaka的皮膚pH計PH 905。用來自Courage & Khazaka 的 Corneofix 粘帶(adhesive strip)去除最上面的 鬆弛細胞層。重新進行pH測量。共使用了 Corneofix粘帶三次並在其後測量了 pH。
結果可以看出，疏水蛋白包被(尤其是用疏水蛋白Β(Η女B)，但也用疏水蛋白Α(Η女 A))和隨後的乳酸處理導致下層皮膚層(剝離後)的皮膚pH比不用疏水蛋白的對照更低。這個結果清楚地表明，疏水蛋白導致乳酸滲透入皮膚增強，因此疏水蛋白可用作 這種物質的滲透增強劑。
權利要求
疏水蛋白作為滲透增強劑的用途。
2.權利要求1的用途，其中促進了通過相界的滲透。
3.權利要求1的用途，其中促進了活性成分的滲透。
4.權利要求1的用途，其中促進了效應分子的滲透。
5.權利要求1的用途，其與至少一種其他滲透增強劑組合。
6.權利要求5的用途，其中至少一種其他滲透增強劑選自以下DMSO；SDS (十二烷基 硫酸鈉)；二甲基甲醯胺；N-甲基甲醯胺；一元醇或多元醇類，如乙醇、1，2_丙二醇、苄醇； 具有8-10個碳原子的飽和和不飽和脂肪醇，如十二醇或十六醇；烴類，如礦物油；烷類；酯 類；azones，如1_十二烷基氮雜環庚_2_酮、丙二醇、脫乙醯殼多糖；飽和和不飽和脂肪酸 類，如硬脂酸或油酸；具有至多24個碳原子的脂肪酸酯類或具有至多24個碳原子的二羧 酸二酯類，如甲酯類、乙酯類、異丙酯類、丁酯類、仲丁酯類、異丁酯類、叔丁酯類；和乙酸、己 酸、十二酸、十四酸、十八酸和十六酸的單甘油酸酯類；磷酸鹽衍生物類，如卵磷脂；萜類； 尿素及其衍生物類；和醚類，如二甲基異山梨醇酯和二甘醇一乙基醚；膽酸鹽類；聚乙氧基 乙烯類；EDTA ；橙花叔醇；氧化薴烯類或磷脂類。
7.疏水蛋白在產生局部應用中提高活性成分吸收的組合物中的用途。
8.權利要求1-6中任一項的用途，其用於作物保護組合物。
9.權利要求1-7中任一項的用途，其是半固體藥劑形式，優選是選自軟膏劑、霜劑、凝 膠劑和糊劑的形式。
10.權利要求1-7中任一項的用途，其用於膜、基質或硬膏。
11.權利要求1-7中任一項的用途，其用於皮膚製劑。
12.權利要求1-7中任一項的用途，其用於化妝品製劑。
13.權利要求1-7中任一項的用途，其用於頭髮化妝品、皮膚化妝品或牙齒化妝品製劑中。
14.產生局部應用中提高活性成分吸收的組合物的方法，其中疏水蛋白以固體形式、有 機或無機介質中的溶液或分散體形式引入至包含至少一種活性成分的製劑中。
全文摘要
本發明涉及疏水蛋白多肽作為滲透增強劑的用途。
文檔編號A61K47/42GK101842118SQ200880106785
公開日2010年9月22日 申請日期2008年8月20日 優先權日2007年9月13日
發明者C·博爾施韋勒, H·巴爾格, M·考羅斯, T·薩布科夫斯基 申請人:巴斯夫歐洲公司