面向空間的微型微流控實時螢光pcr工作系統的製作方法

2023-05-24 10:19:26

專利名稱：面向空間的微型微流控實時螢光pcr工作系統的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種面向空間的微型微流控實時螢光PCR工作系統，是一種「功能集成結構縮微」型的PCR擴增反應裝置，屬於生物學、分析化學及醫學檢測領域。
背景技術：
分析測試是人類最頻繁的科學技術活動之一，創新分析測試技術及相應的創新分析測試儀器在很大程度上代表了一個國家的科技水平，並保證了技術先進的國家在相關領域的知識和技術的戰略儲備和可持續發展能力。在以生命科學為主導的21世紀，新一代的分析測試儀器應該更加微型化、自動化、快速化與便攜化。微型全分析系統(MiniaturizedTotal Analysis System, μ TAS)又稱晶片實驗室(lab on a chip，L0C)。μ TAS的目標是通過化學分析設備的微型化與集成化，最大限度地把分析實驗室的功能集成到便攜設備上，甚至是方寸大小的晶片上，即實現生化分析實驗室的「功能集成結構縮微」。隨著我國載人航天技術的日趨成熟，航天任務周期的逐漸延長，對航天員健康保障的要求也會越來越高。太空飛行器中處於非監控狀態的微生物嚴重威脅航天員的健康。由於宇宙射線與應激等因素的協同作用，導致人體免疫功能降低，患病機率增加，此時艙中的致病微生物會嚴重影響到航天員的身體健康。同時，航天飛行器上攜帶有能在太空環境下生存的微生物，有可能通過人類或太空飛行器帶到空間站、火星表面，會對人類研究太空生命形式造成不利影響。因此，太空飛行器上裝備生物危害實時自動報警系統是十分必要的。生物危害報警器中的微型螢光檢測系統，由於其關鍵技術的實質是要求功能集成和結構縮微，以實現重量輕體積小全自動檢測為目標。而目前的生物晶片螢光微檢測系統，也同樣要求體積小、功能多、自動化水平高。因此，生物危害報警器中螢光微檢測系統的研究，將可以移植在生物晶片螢光微檢測系統基礎上進行，並可以對檢測系統在失重條件下的計算進行修正研究，以實現「面向空間應用」。PCR微流控生物晶片是近年來在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術，它是將採樣、稀釋、加試劑、反應、分離和檢測等功能集成於一個晶片裡，其科學性和先進性集中體現在結構縮微和功能集成這兩個方面。生物晶片技術有4個基本要點晶片製備、樣品製備、生化反應和信號檢測。其原理是PCR反應混合物在精密注射泵的作用下按設定的流速進入生物晶片上分別處於三個恆溫區(94°C、50 60°C、72°C )的微通道，經過PCR的變性、復性和延伸，從而實現一次擴增循環，一個循環可以使DNA總量增加一倍。在合適條件下，這種循環不斷重複，η次循環後使產物DNA的量按2η方式擴增。最後待測液體經過激發光源照射發出螢光，由光敏元件採集並經過光電轉換後輸出螢光值的電信號。顯然目前的微流控PCR工作系統對於在空間進行PCR螢光實時檢測工作主要存在如下缺點I、溫度循環系統採用銅塊或鋁塊進行加熱和風扇冷卻相配合，整個裝置耗能多，體積大難以縮小，無法實現便攜性；
3[0009]2、目前螢光微光譜檢測器都是直接使用傳統的封裝光電管，如光電倍增管(PMT)或電荷耦合元件(CCD)。由於元件自身的體積就很大，而且又是分體使用，需要有配套的光路裝置，致使整個螢光檢測裝置的體積龐大，根本不可能嵌入到生物晶片中；3、由於在激發光傳導和反射光採集時需要各類光學器件和光纖組成的光路進行光路傳輸，不僅結構複雜難以實現集成化，並且影響實時螢光檢測的穩定性；4、由於檢測並未達到零距離接觸的測量方式，會使螢光微檢測受到非檢測對象物質，如組成微通道壁等物質的幹擾，造成測量誤差；5、PCR微流控生物晶片的進樣控制系統、溫度控制系統、螢光檢測系統一般採用各部分單獨控制，無法對微通道內溫度的變化、液體的流速及螢光檢測之間的信號進行實時反饋與集成控制。因此，實現對PCR微流控工作系統不同模塊間進行高度集成控制，以及研製體積小到可嵌入晶片且靈敏度高到能達到生物技術要求的微型螢光檢測裝置是實現PCR螢光實時檢測系統的集成可攜式以及微型化的主要研究方向。

實用新型內容為了很好地解決上述問題，本實用新型涉及一種微型微流控實時螢光PCR工作系統，主要應用於空間範圍對PCR擴增反應進行實時螢光檢測。目的在於實現微型微流控實時螢光PCR檢測系統的集成自動化控制，以及實現整個工作系統的可攜式微型化。本專利是採用以下技術方案實現上述目的一種微型微流控實時螢光PCR工作系統，包括生物晶片I，注射泵2，步進電機3 ;所述的生物晶片I上依次設置有三個恆溫加熱區5，即高溫變性區、適溫延伸區、低溫退火區；所述高溫變性區的溫度為94°C、低溫退火區的溫度為56°C、及適溫延伸區的溫度為720C ;生物晶片I上還設計有微通道4，微通道4依次通過高溫變性區、低溫退火區、適溫延伸區，構成一個反應循環通道，然後在適溫延伸區折彎，再依次經過高溫變性區和低溫退火區到達適溫延伸區，構成下一個反應循環通道；微通道4中多個反應循環通道依次相連；為了避免高溫對檢測器件的損害，因此在微通道中溫度較低的退火區的折彎區設置有微型螢光檢測裝置8 ;微通道4的入口與連接有步進電機3的注射泵相連；步進電機3的控制端與微型螢光檢測裝置8的檢測信號連接至單片機控制系統10 ;高溫變性區、低溫退火區、適溫延伸區之間設置有隔熱風門7。所述的生物晶片I為微流控生物晶片。所述的反應循環通道的個數為20至30個。所述的單片機控制系統10包括液晶顯示裝置和鍵盤輸入裝置。所述的微通道4用光刻技術或蝕刻技術或熱壓法、注塑法、雷射燒蝕微加工法在玻璃、矽片或高聚物材料上製作，或將毛細管直接布在貼有加熱薄膜的載片上。所述的隔熱風門7為孔狀。所述的微型螢光檢測裝置8主要包括激發光光源單元11和螢光檢測單元12以及檢測裝置的電輸出入層9 ;其中激發光光源單元11為管狀，由激發光源13、組合濾光片14、光學微透鏡16和將整個激發單元的四周包圍起來的對導管內光波高反射和對導管外光波完全阻隔的作用的多層光學薄膜15組成；螢光檢測單元12為管狀，由光學微透鏡16、組合濾光片18、光電轉換器件17和將整個檢測單元的四周包圍起來的對導管內光波高反射和對導管外光波完全阻隔的作用的多層光學薄膜15組成；所述的激發光光源單元11的連接方式是將激發光源13與組合濾光片14用多層光學薄膜15包圍成管狀，然後在組合濾光片14上採用原位成型法製作光學微透鏡16，即將紫外光學固化膠液滴從組合濾光片14上垂直釋放，滴落到組合濾光片14上，並自上而下向 四周擴散流淌，用紫外雷射對液滴進行照射，使其固化，形成微光學透鏡16 ；螢光檢測單元12同樣是將光電轉換器件17和組合濾光片18用多層光學薄膜15包圍成管狀，然後在濾光片表面製作光學微透鏡16。所述的微型螢光檢測裝置8與生物晶片I的連接方式為在生物晶片I的微通道4的底部和兩側打孔，將激發光光源單元11置於底部孔內，光學微透鏡朝上，螢光檢測單元12置於左側，微透鏡朝右；在微通道4的頂部以及右側再嵌入另一套微型檢測裝置19，其中激發光光源單元11置於頂部，微透鏡朝下，螢光檢測單元12置於右側，微透鏡朝左；使光學微透鏡均朝向流有待測微流體的微通道4 ；所述的檢測裝置的電輸出入層9位於生物晶片I的下端與低溫退火區相隔開，或置於生物晶片I上刻蝕出的槽狀通道中，或直接置於生物晶片I表面。本實用新型中的裝置是這樣工作的注射泵2直接插入晶片上的微通道，由步進電機3推動注射泵完成樣品的進樣，同時可以通過單片機微處理系統10給予步進電機不同的指令實現對微流體流速的控制；4為充滿待測微流體的微通道，待測流體通過微通道流經三個不同的溫度區5實現一次DNA的擴增，即DNA經高溫變性(94°C )、低溫退火(56°C )以及適溫延伸(72°C)後完成一次循環，因此可以通過設定微通道在不同溫度區域的通道長度就可以確保待測流體在不同溫度區的反應時間；5、6組成恆溫控制系統，恆溫區5從晶片頂端依次向下三個溫度區的設定溫度分別為94°C、72°C和56°C，在加熱區表面粘貼的貼片式溫度傳感器6獲得實時溫度值後反饋到微處理系統10實現對溫度的實時監控；在此處嵌入微型螢光檢測裝置8對待測微流體進行檢測，同時也可對待測微流體的流速進行監測。其中激發光光源單元11可以採用導體發光二極體(LED)或半導體雷射二極體(LD)提供激發光，螢光檢測單元12所用光電轉換器件可以是光電二極體或矽蘭光電池來採集螢光信號；9為微型螢光檢測裝置的電輸出入層，待檢測物質由激發光激發出螢光，被檢測單元採集後變成電信號輸出；10為單片機微處理系統，主要對PCR反應的三大模塊進行集成化控制，即溫度控制模塊、樣品進樣測速模塊以及螢光檢測模塊。該微型微流控實時螢光PCR工作系統圖I所示，由於PCR擴增反應至少需要20 30個擴增循環，且每個PCR擴增循環的時間必須一致。當待測流體通道進入微通道4後流經高溫變性區、低溫退火區和適溫延伸區後為一個反應循環，因此至少需要30個相同的反應循環通道，且每個PCR擴增循環微通道的長短和布局是一樣的。本專利中溫度加熱區域5的加熱方式是將貼片式電阻加熱薄膜直接粘貼到微通道底部進行加熱，其溫度變化可通過溫度傳感器6採集並反饋回單片機微處理系統10進行微調整，其中溫度傳感器6直接粘貼在貼片式電阻加熱薄膜表面。為了實現微流控PCR反應的實時螢光檢測，本專利中提出每完成一次擴增循環對待測流體的螢光信號檢測一次，因此在每個循環微通道的同一位置設置有微型螢光檢測裝置8，每相鄰的兩個螢光實時檢測點在微流體流動方向上的長度為一個循環微通道長度。為了保證檢測的穩定性，因此從第二個PCR擴增循環開始，待測液體由單片機10控制步進電機3推動注射泵2注入微通道，待微流體按預先設定好的流速在微通道內流動，當到達檢測點時，微型螢光檢測裝置8檢測到待測液體的實際螢光信號值，同時根據螢光PCR試劑的前端是否流到正在檢測的螢光檢測點，計算機記錄微流體流經該通道的時間，就可獲得微流體在該通道內的實際的工作流速和實際流速需調整量，從而反饋給單片機控制系統後再將實際流速調整量反饋到步進電機完成下一個擴增循環。本專利所提出的工作系統具有以下優勢本實用新型集成了微流控實時螢光PCR工作系統的樣品進樣測控速系統、溫度控制系統以及微型實時螢光檢測系統，採用單片機微處理器集成控制，既減少了多餘的外圍設備，使工作系統更加集成微型化，這種「功能集成結構微縮」正適合面向空間應用，又使不同模塊之間及時反饋並做調整，極大縮短了整個系統的工作周期。本實用新型中的微型螢光檢測裝置8直接嵌入到微通道中，集成了多種非電要素，如激發光源、光的聚集、傳輸、光勻束、光米集、光檢測等。由於取代了無法嵌入晶片的光電倍增管PMT或電荷耦合元件(XD，使得整個裝置的特徵尺寸縮小到只有毫米數量級，甚至還可以再進一步微縮至微米量級，並在微通道每個反應循環的同一位置設置檢測點，可以根據螢光PCR試劑的前端是否流到正在檢測的螢光檢測點對待測液體的流速進行實時調難
iF. O工作系統中生物晶片中的微通道，可以採用光刻技術、蝕刻技術以及熱壓法、注塑法、雷射燒蝕微加工法等方式在玻璃、矽片或高聚物材料上製作，也可將毛細管直接布在貼有加熱薄膜的載片上，毛細管作為擴增反應所用的微通道與上述等方式具有以下優勢(I)製作工藝簡單易於加工，並且性價比高可以一次性使用；(2)毛細管內壁光滑，相比於以上方式減小了通道內的粗糙度以及層流效應；(3)採用毛細管作為微通道時，用固化膠固化成特定形狀通道，由於膠體成黑色，即可以滿足螢光檢測時所需的避光環境。生物晶片中不同的溫區之間設有隔熱孔(風門)7，使不同溫區的隔溫效果有效的提高。

圖I微型微流控實時螢光PCR工作系統總結構圖；圖2圖I所示方向的A-A剖面圖；圖3通道中微型螢光檢測裝置的局部放大圖；圖中1生物晶片；2注射泵；3步進電機；4微通道；5恆溫加熱區；6溫度傳感器；7隔熱風門；8微型螢光檢測裝置；9檢測裝置的電輸出入層；10單片機控制系統；11激發光光源單兀；12突光檢測單兀；13激發光源；14、18組合濾光片；15光學薄膜；16光學微透鏡；17光電轉換器件；19另一套微型螢光檢測裝置；20晶片微通道載片截面。
具體實施例
以下結合附圖I 3詳細說明本實施例。本專利的結構示意圖如圖I所示，這種面向空間的微型微流控實時螢光PCR工作系統主要包括三個控制模塊以及作為載體的生物晶片，即進樣測控速控制系統、溫度控制系統以及微型螢光檢測系統，由單片機微處理器進行集成控制。整個晶片的尺寸大約為80X60X10mm。具體實施內容為圖I中2與3構成進樣裝置，由步進電機控制注射泵將液體注入微通道4內，可通過單片機微處理系統10設定不同指令給步進電機來控制流體的流速，待測微流體按一定的流速流經三個恆溫加熱區5，其溫度變化可通過溫度傳感器6採集並反饋回單片機10進行微調整。待測液體到達微通道中的微型螢光檢測裝置8時，完成一個PCR擴增反應循環。在檢測點，微型螢光檢測裝置獲得待測微流體的實際螢光信號值。如圖3所示檢測裝置主要包括激發光光源單元11和螢光檢測單元12，激發光源13 —般採用半導體發光二極體(LED)或半導體雷射二極體(LD)，經特定峰值波長的組合濾光片14後經光學微透鏡16聚焦到被測生物微流體上，使相應的待測微流體發出螢光。15為多層光學薄膜，將整個激發單元的四周包圍起來，形成管狀，起到對管內光波高反射和對管外光波完全阻隔的作用。17為光電轉換器件，可以是光敏二極體或矽蘭光電池，螢光信號經光學微透鏡16聚焦後經過特定峰值波長的組合濾光片18後由光敏二極體採集並轉換為電信號經9輸出到單片機微處理系統10。同時根據螢光PCR試劑的前端是否流到正在檢測的螢光檢測點，微處理系統會記錄微流體流經該通道的時間，因此得到實際的工作流速=一個微通道的長度/微流體流經該通道實際所需時間，實際流速需調整量=理論設計流速-實際的工作流速，結果為正，說明實際的工作流速需增加；反之需減少；結果為零，說明實際的工作流速與理論計算設計的工作流速吻合，實際流速不需調整。從而實現了對實時螢光檢測和進樣測速控速同步控制，並與溫度控制系統結合起來均由單片機微處理系統控制，從而減少晶片的外圍設備，使工作系統更加集成化微型化，以達到空間作業的要求。
權利要求1.一種微型微流控實時螢光PCR工作系統，其特徵在於包括生物晶片(I)，注射泵(2)，步進電機(3);所述的生物晶片(I)上依次設置有三個恆溫加熱區(5)，即高溫變性區、適溫延伸區、低溫退火區；所述高溫變性區的溫度為94°C、低溫退火區的溫度為56°C、及適溫延伸區的溫度為72°C ;生物晶片(I)上還設計有微通道(4)，微通道(4)依次通過高溫變性區、低溫退火區、適溫延伸區，構成一個反應循環通道，然後在適溫延伸區折彎，再依次經過高溫變性區和低溫退火區到達適溫延伸區，構成下一個反應循環通道；微通道(4)中多個反應循環通道依次相連；為了避免高溫對檢測器件的損害，因此在微通道中溫度較低的退火區的折彎區設置有微型螢光檢測裝置(8);微通道(4)的入口與連接有步進電機(3)的注射泵相連；步進電機(3)的控制端與微型螢光檢測裝置(8)的檢測信號連接至單片機控制系統(10);高溫變性區、低溫退火區、適溫延伸區之間設置有隔熱風門(7)。
2.根據權利要求I所述的一種微型微流控實時突光PCR工作系統,其特徵在於所述的生物晶片(I)為微流控生物晶片。
3.根據權利要求I所述的一種微型微流控實時突光PCR工作系統,其特徵在於所述的反應循環通道的個數為20至30個。
4.根據權利要求I所述的一種微型微流控實時突光PCR工作系統,其特徵在於所述的單片機控制系統(10)包括液晶顯示裝置和鍵盤輸入裝置。
5.根據權利要求I所述的一種微型微流控實時突光PCR工作系統,其特徵在於所述的微通道(4)用光刻技術或蝕刻技術或熱壓法、注塑法、雷射燒蝕微加工法在玻璃、矽片或高聚物材料上製作，或將毛細管直接布在貼有加熱薄膜的載片上。
6.根據權利要求I所述的一種微型微流控實時突光PCR工作系統,其特徵在於所述的隔熱風門(7)為孔狀。
7.根據權利要求I所述的一種微型微流控實時突光PCR工作系統,其特徵在於所述的微型螢光檢測裝置(8)主要包括激發光光源單元(11)和螢光檢測單元(12)以及檢測裝置的電輸出入層(9);其中激發光光源單元(11)為管狀，由激發光源(13)、組合濾光片(14)、光學微透鏡(16)和將整個激發單元的四周包圍起來的對導管內光波高反射和對導管外光波完全阻隔的作用的多層光學薄膜(15)組成；螢光檢測單元(12)為管狀，由光學微透鏡(16)、組合濾光片(18)、光電轉換器件(17)和將整個檢測單元的四周包圍起來的對導管內光波高反射和對導管外光波完全阻隔的作用的多層光學薄膜(15)組成；所述的激發光光源單元(11)的連接方式是將激發光源(13)與組合濾光片(14)用多層光學薄膜(15)包圍成管狀，然後在組合濾光片(14)上採用原位成型法製作光學微透鏡(16);螢光檢測單元(12)同樣是將光電轉換器件(17)和組合濾光片(18)用多層光學薄膜(15)包圍成管狀,然後在濾光片表面製作光學微透鏡(16);所述的微型螢光檢測裝置(8)與生物晶片(I)的連接方式為在生物晶片(I)的微通道(4)的底部和兩側打孔，將激發光光源單元(11)置於底部孔內，光學微透鏡朝上，螢光檢測單元(12)置於左側，微透鏡朝右；在微通道(4)的頂部以及右側再嵌入另一套微型檢測裝置(19)，其中激發光光源單元(11)置於頂部，微透鏡朝下，螢光檢測單元(12)置於右側，微透鏡朝左；使光學微透鏡均朝向流有待測微流體的微通道(4)；所述的檢測裝置的電輸出入層(9)位於生物晶片(I)的下端與低溫退火區相隔開，或置於生物晶片(I)上刻蝕出的槽狀通道中，或直接置於生物晶片(I)表面。
專利摘要面向空間的微型微流控實時螢光PCR工作系統，屬於生物學、分析化學及醫學檢測領域包括生物晶片，注射泵，步進電；所述的生物晶片上依次設置有高溫變性區、適溫延伸區、低溫退火區；生物晶片上還設計有微通道，微通道依次通過上述三區，構成一個反應循環通道，然後在適溫延伸區折彎，再依次經過高溫變性區和低溫退火區到達適溫延伸區，構成下一個反應循環通道；微通道中多個反應循環通道依次相連在微通道中溫度較低的退火區的折彎區設置有微型螢光檢測裝置；微通道的入口與連接有步進電機的注射泵相連；步進電機的控制端與微型螢光檢測裝置的檢測信號連接至單片機控制系統；本實用新型製作工藝簡單易於加工，並且性價比高可以一次性使用。
文檔編號C12M1/34GK202730131SQ20122007209
公開日2013年2月13日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者吳堅, 楊洋, 陳濤, 劉世炳 申請人:北京工業大學