誘導幹細胞向胰島樣細胞分化的方法
2023-05-24 23:54:21
專利名稱：誘導幹細胞向胰島樣細胞分化的方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及體外誘導幹細胞向胰島樣細胞定向分化的方法及胰島樣細胞的用途。
背景技術：
糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是胰島素分泌相對或絕對不足或胰島素受體作缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂性疾病。臨床上，I型及部分II型糖尿病多採用皮下注射胰島素來治療。細胞治療是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治療策略，對於已經喪失胰島細胞功能的糖尿病患者來說，植入能分泌胰島素的β細胞或其替代物是最理想的治療方法。近幾年，胰島細胞移植治療糖尿病取得了一些療效，但供者細胞來源不足、嚴重的免疫排斥反應等困難卻極大的限制了這種療法的應用。幹細胞具有極強自我更新能力及多向分化潛能，是基因治療的理想靶細胞。幹細胞分為全能幹細胞(如胚胎幹細胞，可以分化為機體所有組織細胞)、多能幹細胞(具有多向分化潛能，可以分化為多種組織細胞，如間充質幹細胞等)和專能幹細胞(維持某一特定組織細胞的單一方向自我更新，如腸上皮幹細胞等)。幹細胞技術的不斷突破及幹細胞本身所具有的特性使人類有可能在體外培養某些幹細胞，定向誘導其分化為我們所需要的各種組織細胞，或作為種子細胞用於組織工程以供臨床所需，以此為目的的幹細胞工程涉及人體幾乎所有重要組織器官及人類面臨的大多數醫學難題，如心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤、骨及軟骨缺損、老年性痴呆、帕金森病、燒傷、脊髓損傷和遺傳性缺陷等的治療。由於人羊水、臍帶血、外周血和骨髓中的多能幹細胞，具有增殖能力強、來源豐富、採集方便等優點，此類幹細胞移植在血液系統疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等的治療中發揮了重要的作用。神經元限制性沉默因子(Neuronalrestrictive silencer factor，NRSF)是一分子質量為116kD的Cys2/His2型鋅指蛋白，屬於Gli-Kruppel樣轉錄因子家族。整個分子包含N端阻遏結構域RD-I、近N端鋅指結構、DNA結合區域(含7個排列成簇的鋅指結構)、 賴氨酸富含區、脯氨酸富含區、C端阻遏結構域RD-2 (含一個鋅指結構)。NRSF廣泛表達於胚胎幹細胞及成體細胞中，僅在成熟神經元和胰島細胞中沒有表達。NRSF可以調控與胰島發育成熟相關的重要基因，同時，NRSF和β細胞的葡萄糖-胰島素分泌偶聯機制密切相關， NRSF過表達破壞這種偶聯機制並導致細胞減少。因此，NRSF下調表達可以促進細胞向胰島細胞分化。RNA幹擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。由於使用 RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，該技術已被廣泛用於探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。研究發現，利用攜帶有RNA聚合酶III啟動子的質粒載體操縱一段小的髮夾shRNA在哺乳動物細胞中表達同樣能夠引起特定靶基因的沉默。慢病毒載體(lentiviral vectors)系統具有如下特點病毒不具備自身複製能力，具有自身滅活機制；宿主範圍廣，人、鼠等多種屬多類型細胞都能被高效感染；在穩定整合宿主基因組的基礎上增加了高效感染靜止期細胞，高效表達外源蛋白，同時還能逃避甲基化抑制的特點。在慢病毒載體的基礎上改造出來的慢病毒幹涉載體能夠在細胞內對靶基因產生長期穩定的幹涉效果。對幹細胞進行適當的基因修飾，使之成為能分泌胰島素的細胞，是治療I型糖尿病的理想策略之一，而下調表達幹細胞中的NRSF，並且用誘導培養基對其進行誘導，有可能使我們獲得能分泌胰島素的細胞。因此，分離不同組織來源的成體幹細胞，將其在體外誘導分化為胰島樣細胞作為種子細胞用於胰島細胞移植、微囊化幹細胞製劑等的製備，同時誘導分化的胰島樣細胞可作為體外的藥代動力學模型用於細胞藥物篩選。此方法的建立將在以基因工程、細胞工程乃至組織工程等為基礎的再生醫學中具有極佳的應用前景，並將產生巨大的社會效益和經濟效益。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是建立體外誘導幹細胞分化為胰島樣細胞的方法。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是利用幹細胞具有多向分化的潛能，誘導其向胰島樣細胞分化，誘導分化的細胞可分泌胰島素，為胰島細胞移植、微囊化幹細胞製劑的製備提供種子細胞，同時誘導分化的細胞可作為體外的藥代動力學模型用於細胞藥物篩選。本發明中所用的誘導方法，其特徵在於利用載體下調NRSF在幹細胞中的表達水平，並同時添加營養素或細胞因子，分兩個階段誘導幹細胞向胰島樣細胞分化。本發明中的幹細胞包括人和哺乳動物羊水、胚胎、骨髓、動員的外周血、臍帶血以及其它組織來源的間充質幹細胞、胰腺幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞及神經幹細胞。本發明中所用的載體包括慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體，逆轉錄病毒載體，通過這些載體介導下調NRSF基因在幹細胞中表達。本發明所用的體外誘導方法是利用載體下調NRSF在幹細胞中的表達水平，並同時添加營養素或細胞因子，分兩個階段誘導幹細胞向胰島樣細胞分化。本發明用於基因轉染的載體中慢病毒載體是轉染NRSF基因的首選病毒載體。本發明選用的培養液為添加了營養素或細胞因子，包括Activin-A，bFGF，B27, BTC，nicotinamide，可以誘導下調表達NRSF的幹細胞向胰島樣細胞分化。本發明中所獲得的胰島樣細胞團能表達胰島相關基因及蛋白，包括葡萄糖轉運子、葡萄糖激酶、胰島素、胰高血糖素、生長抑素。本發明中體外誘導幹細胞向胰島樣細胞分化後的胰島樣細胞能分泌胰島素，可作為種子細胞用於胰島細胞移植、微囊化幹細胞製劑的製備及作為體外的藥代動力學模型用於細胞藥物篩選。具體實施方案如下1.分離不同組織來源的成體幹細胞，製備方法是(1)人羊水幹細胞的分離、純化及原代、傳代培養無菌條件下取羊水5-10ml， 1600r/min條件下離心8min，收集細胞沉澱培養低糖DMEM培養基(LD)+10 %胎牛血清 +100U/ml青-鏈黴素+4ng/ml bFGF。48h後更換培養液，棄掉未貼壁細胞，以後每2 3天
4換液一次。細胞達到80%匯合時進行傳代培養。0.25%-EDTA溶液消化細胞，消化時間控制在5分鐘以內。血清終止消化，輕輕吹打皿底並收集細胞，IlOOrpm離心5分鐘。細胞沉澱按1 4-6的比例傳代，計數每代細胞數目並計算累積細胞數。(2)骨髓間充質幹細胞的分離無菌條件下，經雙側髂後上棘穿刺，採集骨髓，經 Percoll(美國，Sigma公司產品，相對密度1. 073g/ml)密度梯度離心後收集人骨髓單個核細胞，貼壁培養72h，去除懸浮細胞後貼壁生長的即為骨髓間充質幹細胞。(3)大鼠肝幹細胞分離無菌條件下，沿正中線切開大鼠腹腔並暴露門靜脈，輸注無鈣鎂Hanks液至肝臟變成肉色後，保留門靜脈，離斷肝臟並將肝臟移入無菌平皿中，再輸注含IV型膠原酶的Hanks液，回收平皿內的膠原酶液，去除肝包膜及血管，鈍性撕裂肝組織，以培養基溶解，多層紗布過濾，反覆離心洗滌，再以培養基製備成單個肝細胞懸液。(4)臍帶血單個核細胞的分離無菌及ACD抗凝液抗凝條件下經臍靜脈穿刺取血， 採集健康足月順產新生兒臍帶血，依次經過0.5%甲基纖維素(美國，Sigma公司產品)沉降及Ficoll(美國，Sigma公司產品，相對密度1.077g/ml)密度梯度離心後收集人臍帶血單個核細胞，洗滌後重懸於PBS中。2.構建NRSF幹涉載體，同時設計脫靶載體作為對照，進行慢病毒包裝並用慢病毒感染幹細胞後，檢測幹涉載體的幹涉效果。3.分兩個階段對下調表達NRSF的幹細胞進行誘導，使其分化成胰島樣細胞。4.對所誘導的胰島樣細胞的檢測1.按照本發明提供的技術方法，可以將人和哺乳動物羊水、胚胎、骨髓、外周血、臍帶血以及其它組織來源的間充質幹細胞、胰腺幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞及神經幹細胞等在體外定向誘導分化為能分泌胰島素的胰島樣細胞；2.按照本發明技術方法得到的體外誘導分化的胰島樣細胞，可作為種子細胞應用於胰島細胞移植及微囊化幹細胞製劑的製備；3.按照本發明技術方法得到的體外誘導分化的胰島樣細胞，可作為體外的藥代動力學模型用於細胞藥物篩選。4.本發明中誘導分化方法的建立將在以基因工程、細胞工程乃至組織工程等為基礎的再生醫學中具有極佳的應用前景，並將產生巨大的社會效益和經濟效益。
具體實施例方式實施例1、NRSF幹涉載體的構建利用網絡RNA幹涉片斷設計工具設計人NRSF基因的幹涉片斷以及幹涉的脫靶對照片斷，其中幹涉片斷序列為幹涉脫靶片斷序列為兩條片斷經過退火、T4單核苷酸磷酸化酶磷酸化後，用jM連接酶連接到HpaI和)(bal雙酶切後的pSicoR載體，轉化Dffia感受態細胞後，挑取克隆搖菌培養後提取質粒，以PSicoR質粒為陰性對照，經過BioI JbaI雙酶切後2%瓊脂糖凝膠電泳，能酶切產生400bp大小片斷的質粒為陽性克隆得到的質粒(見附
圖1)，該克隆送交測序公司測序。測序正確的幹涉載體質粒命名為pSicoR-GFP-siNRSF，測序正確的脫靶載體質粒命名為pSicoR-GFP-siControl。實施例2、慢病毒包裝培養^3-FT (購自hvitrogen公司)慢病毒包裝細胞，培養基為添加10% FBS,0. lmmol/L NEAA, 2mmol/L L-穀氨醯胺，1 %青-鏈黴素，500 μ g/mL G418 的高糖 DMEM 培養基(Sigma公司產品，Cat#D5648)。用步驟1構建的慢病毒幹涉載體pSicoR-GFP-siNRSF 以及脫靶載體pSicoR-GFP-siControl分別和包裝質粒pLPl (購自Invitrogen公司)、 PLP2 (購自Invitrogen公司)及包膜蛋白質粒pLP/VSVG (購自Invitrogen公司)按 5ug 4. 2ug 2ug 2. 8ug的比例混合後加入1.5mL無血清Opti-MEM I培養基(購自Invitrogen公司)中，輕輕混勻，在另一個無菌的5mL管中將42uL Iipofectamine 2000(購自Invitrogen公司)稀釋於1. 5mL的無血清Opti-MEM I培養基中，室溫靜置 5分鐘，混合以上兩種液體，室溫孵育20分鐘以形成DNA-Iipofectamine 2000複合物。用 0. 25%胰酶(Gibco公司產品，Cat#25200-056)消化收集培養的293-FT細胞，計數約6X IO6 個細胞，將其重懸到5mL不含抗生素的生長培養基(在高糖DMEM培養基(Sigma公司產品， Cat#D5648)的基礎上添加 10%胎牛血清(FBS) (Biochrom 公司產品，cat#S0115)，0. Immol/ L 非必需胺基酸(Non-Essential Amino Acids, NEAA)(購自 HyClone 公司)和 2mmol/L L-穀氨醯胺)中，再將293-FT包裝細胞懸液與3mL含有DNA-I ipofectamine2000複合物的培養基混勻後加入到含有5mL不含抗生素的生長培養基的IOcm細胞培養皿中，混勻，放於 37°C,5% CO2孵箱中培養，次日用含有lmmol/L丙酮酸鈉的完全培養基(在高糖DMEM培養基的基礎上添加10%胎牛血清，0. lmmol/L非必需胺基酸，2mmol/L L-穀氨醯胺，青-鏈黴素和lmmol/L丙酮酸鈉)更換含有DNA-1 ipofectamine 2000複合物的培養基進行包裝， 並分別在包裝24、72小時後取樣，對經包裝的293-FT細胞在螢光顯微鏡下進行觀察，結果包裝24小時後即可見到293-FT細胞內有綠色螢光蛋白EGFP表達(EGFP基因為慢病毒幹涉載體pSicoR攜帶)，表達綠色螢光蛋白EGFP的細胞超過95 %，表明包裝效率很高，且伴隨著包膜質粒pLP/VSVG中VSVG基因的表達，逐漸出現293-FT細胞的多細胞合胞體，包裝 72小時後培養上清為淡黃色，此時收集病毒液上清於15mL的無菌離心管中，4°C、3000rpm 離心15min去除細胞碎片，將病毒上清凍存於-70°C備用。實施例3、慢病毒幹涉載體幹涉效果的驗證1.慢病毒幹涉載體以及脫靶載體感染羊水幹細胞在細胞培養瓶裡培養羊水幹細胞，待其長到80 %密度時用病毒感染細胞。感染時， 每孔加入IOml病毒和終濃度為8 μ g/ml的聚凝胺(polybrene)，晃動培養瓶使病毒液能接觸到所有細胞。過夜培養後更換培養基。感染慢病毒幹涉載體和脫靶載體的細胞分別命名為SiNRSF-hAFSCs和SiControl-hAFSCs。此後按照正常細胞培養方法對細胞進行培養。2. RT-PCR 以及 real time PCR 驗證用TRIZOL(invitrogen)試劑，按照說明書方法提取siNRSF-hAFSCs和 siControl-hAFSCs細胞總RNA，然後反轉錄其中的mRNA為cDNA，反轉錄體系為體積(μ )5XAMV reverse buffer4dNTP (IOmM)2RNAse inhibitor1AMV反轉錄酶0· 5Mrna2/K11. 5
再進行PCR擴增目的基因NRSF，以人GAPDH基因為參照。PCR反應體系為體積(μ 1)10XPCR buffer2dNTP (2. 5mM)1.6引物(正反向)1模板1rTaq 酶0. 2水14. 2同時以real time PCR確定準確的幹涉效率，所用儀器為bio-rad公司的opticon 2，反應體系為體積(μ 1)10XPCR buffer2dNTP (2. 5mM)1.6引物(正反向)1模板1rTaq 酶0. 2syberGREEN0. 5水13. 7反應獨立重複三次以消除系統誤差。從RNA水平看，幹涉載體的幹涉效率為70%， 且未引發脫靶效應(見附圖2)。3. Western blotting 驗證各取107siNRSF_hAFSCs和siControl-hAFSCs細胞，用細胞核蛋白提取試劑盒(pierce)提取細胞核蛋白。用BCA法測定蛋白濃度為5100 μ g/ml。然後取等量的 siNRSF-hAFSCs和siControl-hAFSCs細胞核蛋白進行不連續SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，再用半乾式轉印的方法將蛋白質轉移至PVDF膜，接著用5%脫脂奶粉封閉2h， 一抗(兔來源抗NRSF抗體購於santa cruz公司，兔來源抗β -actin抗體購於中杉金橋公司)4°C過夜，TBST洗膜三次，每次10分鐘，然後加入辣根過氧化物酶偶連的抗兔二抗，室溫一個小時後，TBST洗膜四次。用ECL化學發光檢測試劑盒(購自Santa Cruz公司，Cat# SC-2048)於暗室自顯影以檢測目的條帶及幹涉效果。證明所構建的NRSF慢病毒幹涉載體能夠在蛋白水平上穩定幹涉細胞內源表達的NRSF(見附圖3)。實施例4、慢病毒幹涉載體以及脫靶載體感染幹細胞後對其進行誘導病毒感染後的幹細胞按照兩個階段進行誘導，第一階段是第1至7天，誘導培養基是 D/F12+2 % FBS+2 % B27+10ng/ml Activin-A+10ng/ml bFGF,第二階段是第 8 至 14 天，誘導培養基是 D/F12+2% FBS+2 % B27+10ng/mlBTC+10mM nicotinamide，其他條件按照正常細胞培養方法對細胞進行培養。實施例5、對誘導分化所獲得的胰島樣細胞的鑑定l.RT-PCR 鑑定用實施例3所述RT-PCR方法對分化細胞進行基因mRNA表達水平進行鑑定，鑑定基因 包括Soxl7，Foxa2, Pdxl,Hnf4 α，Pax4, Isl_l，Nkx6. 1，Insulin, Glut-2 (見附圖 4)，鑑定引物如下
權利要求
1.誘導幹細胞向胰島樣細胞分化的方法，其特徵在於利用幹細胞具有多向分化的潛能，誘導其向胰島樣細胞分化，誘導分化的細胞可分泌胰島素，為胰島細胞移植、微囊化幹細胞製劑的製備提供種子細胞，同時誘導分化的細胞可作為體外的藥代動力學模型用於細胞藥物篩選。
2.按照權利要求1所述的誘導方法，其特徵在於利用載體下調NRSF在幹細胞中的表達水平，並同時添加營養素或細胞因子，分兩個階段誘導幹細胞向胰島樣細胞分化。
3.按照權利要求1所述的誘導方法，其特徵在於，所述的幹細胞具有多向分化潛能，包括人和哺乳動物羊水、胚胎、骨髓、動員的外周血、臍帶血以及其它組織來源的間充質幹細胞、胰腺幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞及神經幹細胞。
4.按照權利要求1所述的誘導方法，其特徵在於，所述的載體包括慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體，逆轉錄病毒載體，通過這些載體介導下調NRSF在幹細胞中表達。
5.按照權利要求1或4所述的誘導方法，其特徵在於，所述的載體中慢病毒載體是轉染 NRSF基因的首選病毒載體。
6.按照權利要求1所述的誘導方法，其特徵在於，培養液中添加了營養素或細胞因子， 包括Activin-A，bFGF，B27，BTC，nicotinamide，可以誘導轉染NRSF幹涉載體的幹細胞向胰島樣細胞分化。
7.按照權利要求1所述的誘導方法，其特徵在於獲得的胰島樣細胞團能表達胰島相關基因及蛋白，包括葡萄糖轉運子、葡萄糖激酶、胰島素、胰高血糖素、生長抑素。
8.體外誘導幹細胞向胰島樣細胞分化後的胰島樣細胞的用途，其特徵在於誘導分化後的細胞可分泌胰島素，可作為種子細胞用於胰島細胞移植、微囊化幹細胞製劑的製備。
9.按照權利要求8所述的用途，其特徵在於誘導分化後的細胞可作為體外的藥代動力學模型用於細胞藥物篩選。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及體外誘導幹細胞向胰島樣細胞定向分化的方法及胰島樣細胞的用途。本發明的目的是提供體外獲得大量胰島樣細胞的方法，並將誘導分化的胰島樣細胞作為種子細胞用於胰島細胞移植、微囊化幹細胞製劑的製備以及作為體外的藥代動力學模型用於細胞藥物篩選。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案1)構建NRSF幹涉載體；2)分離、培養及擴增幹細胞；3)分兩個階段誘導幹細胞分化為胰島樣細胞；4)獲得的胰島樣細胞鑑定。此方法的建立將在以基因工程、細胞上程乃至組織工程等為基礎的再生醫學中具有極佳的應用前景，並將產生巨大的社會效益和經濟效益。
文檔編號C12N15/867GK102311940SQ20101022254
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者嶽 文, 師偉, 李保偉, 李豔華, 王思涵, 裴雪濤 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所