仙人掌果多糖在製備藥物或保健品中的應用的製作方法

2023-05-24 20:44:06

專利名稱：仙人掌果多糖在製備藥物或保健品中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及仙人掌果及仙人掌果多糖在製備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用 的藥物或保健品中的應用，屬於天然植物資源的利用技術領域。
背景技術：
廣西北海潿洲島是我國最大的死火山島，島上的熔巖給仙人掌生長提供了充足的 養分，加之適宜的熱帶氣候，形成了成片野生的仙人掌。而且島上的仙人掌四季都可以結出 數量可觀的仙人掌果。潿洲島產仙人掌果具有特有的胭脂紅色，其中富含礦物質(如硒) 和硫磺酸。但迄今為止，潿洲島盛產的仙人掌果除了極少量被當地居民或旅遊者食用外，絕 大部分都枯爛在地裡，或被鳥、蛇等作為了腹中之餐，造成了資源的極大浪費，嚴重影響了 仙人掌果的充分開發利用。中草藥及其活性成分的藥用功能具有多靶點、多途徑、多環節的特點，成為現代藥 物開發的熱點，因此近年來天然植物在疾病預防和治療方面的作用引起人們的廣泛關注和 重視。仙人掌作為一種天然植物，具有良好的觀賞價值、食用價值、保健價值和藥用價值，並 且藥源豐富，無毒無異味，開發產品安全方便。近年來，動物實驗及人體試驗證明，仙人掌 具有提高機體免疫力、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗菌、消炎等藥理作用。仙人掌果(Opimtia ficus-indica)為仙人掌屬(Opimtia)植物的果實，果肉含有豐富的微量元素、蛋白質、氨 基酸、維生素、多糖類、黃酮類和果膠等。印第安人和墨西哥人將其作為食物和藥物使用已 有幾千年的歷史。國內外對仙人掌根莖具有降血脂和降血糖等作用均有報導，但仙人掌果 是否也具有降血脂和降血糖等活性未見報導。鑑於仙人掌果資源充足，廣西北海潿洲島產 仙人掌果顏色鮮豔，口感甘甜，維生素和多糖的含量高，因此本申請人對仙人掌果以及從其 中分離出的有效部位仙人掌果多糖進行了相關的藥理試驗研究和探索。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是根據仙人掌果所含的成分，將仙人掌果及從其中 提取分離出的仙人掌果多糖用於製備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品 中。本發明是這樣構成的仙人掌果(Opuntia ficus-indica)在製備降血壓、降血 脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應用。仙人掌果多糖在製備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應用。所述仙人掌果多糖是從仙人掌果中提取出來的多糖類成分，其總糖含量為70%
380%。具體的仙人掌果多糖的製備方法為取仙人掌果，加4 10倍重量的水超聲提取 0. 5 2. 5小時，提取液濃縮，加入40 95%的乙醇，調節濃縮液的乙醇濃度至40 90% 進行沉澱，然後在1000 IOOOOrpm轉速下離心2 lOmin，離心沉澱物加水溶解，用體積比 為1 5 2 10的無水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水層用Sevage+木瓜蛋白 酶法去除蛋白，濃縮，乾燥，即得。其中Sevage+木瓜蛋白酶法的具體過程為用Sevage溶液(體積比氯仿正丁 醇=4 10 1 5)萃取水溶液1 3次後，取水層液，調pH至5 7，向水溶液中加入 1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65°C保溫20 28h，1000 IOOOOrpm離心2 IOmin, 去除底層沉澱，得仙人掌果多糖脫蛋白液。具體的說，仙人掌果、仙人掌果多糖的應用方法為取仙人掌果或仙人掌果多糖， 加入或不加藥用輔料，按照常規方法製備成藥物製劑。或者將仙人掌果或仙人掌果多糖與其它藥用成分組合，並加入或不加藥用輔料， 按照常規方法製備成藥物製劑。還可以取仙人掌果或仙人掌果多糖，加入或不加輔料，按照常規方法製備成保健
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ΡΠ O或者將仙人掌果或仙人掌果多糖與其它物質組合，加入或不加輔料，按照常規方 法製備成保健品。為了驗證本發明的效果，下面將通過仙人掌果多糖的製備及對仙人掌果原汁和仙 人掌果多糖進行的藥效試驗研究來進一步闡述本發明。一、仙人掌果多糖的提取純化取仙人掌果，加4 10倍重量的水超聲提取0. 5 2. 5小時，提取液濃縮，加入 40 95%的乙醇，調節濃縮液的乙醇濃度至40 90%進行沉澱，然後在1000 IOOOOrpm 轉速下離心2 lOmin，離心沉澱物加水溶解，用體積比為1 5 2 10的無水乙醇和乙 酸乙酯混合液萃取1 4次，水層用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，濃縮，乾燥，即得仙人 掌果多糖。Sevage+木瓜蛋白酶法用Sevage溶液(體積比氯仿正丁醇=4 10 1 5)萃取水溶液1 3次後，取水層液，調pH至5 7，向水溶液中加入1 4u/100ml的木 瓜蛋白酶，45 65°C保溫20 28h，1000 IOOOOrpm離心2 lOmin，去除底層沉澱，得仙 人掌果多糖脫蛋白液。經測定，所提取的仙人掌果多糖中多糖含量達60 80%。二、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血壓作用的試驗研究1.仙人掌果及仙人掌果多糖單次及連續9周給藥對原發性高血壓大鼠(SHR)的收 縮壓和心率(HR)影響1. 1實驗動物選擇16 周(w)齡雄性 SHR60 只，收縮壓(SBP)彡 23. 94kPa (IkPa = 7. 5mmHg)，體重 (250士50) g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號SCXK (滬)2003-0003 ； 同齡雄性Wistar大鼠，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號桂動許字2000第 OOl號。飼養在配備空調的動物房內，室溫(25士2) °C，自由飲水。
1. 2實驗方法1.2. 1分組及給藥實驗前馴化並行適應性測壓訓練2w，待適應環境，隨機分為6組即模型組(NC) 給蒸餾水；CPFP高劑量組(HD)、中劑量組(MD)、低劑量組(LD)分別給3. 06g · kg-1 · cf1， 1. 58g · kg—1 · d—1，。· 79g · kg—1 · cf1 的 CPFP ；仙人掌果原汁組(NJ)給 3. 15g · kg—1 · cf1 仙 人掌果原汁(CPNJ)；卡託普利組(PC)給0. Olg · kg-1 · cf1卡託普利；正常對照組(Wt) Wistar大鼠給蒸餾水。每組10隻，給藥途徑為灌胃。1. 2. 2測壓方法用小型電吹風機對準大鼠尾巴腹側烘熱，待大鼠尾巴皮膚變為微紅時，將血壓計 的壓脈套套至大鼠尾部近心端處，高敏換能器置於尾巴中上1/3處，換能器表面對準尾部 腹側，固定，鬆緊以換能器用手推不動為好。待大鼠平靜之後，打開記錄系統，可見有脈搏 波出現，用充氣囊使壓脈套內的壓力升高到脈搏波完全消失再加壓升高3. 99kPa，然後通過 充氣囊閥門緩慢放氣逐漸降低壓脈套內壓力，從開始放氣到管道內壓力為零一般維持時間 5 6秒。仔細觀察脈搏波從被阻斷到再次出現第一個波，這第一個波出現時所對應的壓 力即為SBP。取連續3次測壓值的平均值作為應測SBP值，分別測定第一次用藥前、用藥後 2小時(h)、4h、6h、8h、12h、24h及連續給藥9w期間每周SHR的SBP和HR。然後再根據脈搏 波間接推算出HR。1. 2. 3統計學處理應用SPSSl 1. 0軟體進行統計學處理，計量資料均採用± S表 示，兩組間計量資料比較採用t檢驗，多組均數比較採用方差分析。1. 3實驗結果 1. 3. 1單次給藥對SHR的SBP和HR影響單次給予CPFP後2h即有明顯的降壓效應，4h降壓效應達到高峰。4h時HD與 治療前相比有顯著性差異(P 0.05)。PC給予卡託普利後，2h血壓下降達到高峰，與NC和治療前比較 有顯著性差異(P 0. 05)。1. 3. 2連續9w給藥對SHR的SBP和HR影響各給藥組在用藥2w後SBP下降幅度開始明顯，至8w SBP降幅減緩，基本穩定在一 個較低的水平。PC、HD和MD分別在4w、5w和6w開始與治療前相比有非常顯著性意義(P <0.01)，LD和NJ自身前後比較也有差異(P<0. 05)。NC在實驗期間血壓趨於升高，9w後 SBP平均升高了 1. OOkPa,與治療前相比有非常顯著性差異(P < 0. 01)。組間對比PC、HD、 MD、LD和NJ分別在3w、4w、5w、6w和5w降壓效果均顯著優於NC (P 0. 05)。另外，從 降壓幅度來看CPFP連續給藥9w降壓也呈現明顯的量效和時效關係。用藥各組對HR的影 響較小，用藥前後經統計學處理無顯著性差異(P > 0. 05)。2.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發性高血壓大鼠(SHR)血漿腎素(RA)和血管緊
5張素II (AngII)的影響2.1實驗動物同實驗1。2. 2實驗方法2. 2. 1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。2. 2. 2實驗步驟連續給藥9w，末次給藥後禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml ·1 Ρ)，自腹主動脈取血各2ml分別置於預冷的含乙二胺四乙酸(EDTA)、二巰基丙醇和 8-羥基喹啉試管中，混勻，4°C，3000轉/分(rpm)離心lOmin，分離血漿，_20°C密封保存待 測。血漿RA活性的測定，即測定血漿中血管緊張素I (AngI)產生的速率。取雙份血 漿，一份讓其直接與抗體反應，測其AngI的濃度，作為對照管；另一份在37°C溫育30min後 再讓其與抗體反應，測其AngI的濃度為測定管。測定管AngI的濃度減去對照管AngI的濃 度並除以溫育時間，則為單位時間內AngI的產生速度，稱RA活性。AngI I水平的測定操作步驟嚴格按照分析藥盒使用說明書進行，待加樣操作結束 後混勻，室溫放置15min，3500rpm離心15min，吸上清液測定各管沉澱的放射性計數(cpm)， 並由r計數器預先編制的程序直接給出有關參數、標準曲線和樣品濃度。2. 2. 3統計學處理同實驗1。2. 3實驗結果HD和PC有降低血漿腎素活性的作用，與NC相比均有顯著性差異(P 0. 05)。在降低血漿AngII方面，PC最強，HD次之，與NC 比較均有非常顯著性差異(P .05) ；LD和 NJ相對較差，與NC比無顯著性差異(P > 0. 05)。從而提示HD有類似於血管緊張素轉換酶 抑制劑的作用機制。3.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發性高血壓大鼠(SHR)血漿內皮素(ET)和一氧化氮(NO)的影響3.1實驗動物同實驗1。3. 2實驗方法3. 2. 1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。3· 2. 2實驗步驟連續給藥9w，末次給藥後禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主動脈各取血2ml置於含10% EDTA30 μ 1試管中，混勻。4°C放置約2h 後，3000rpm離心IOmin分離血漿，-20°C密封保存待測。測試前復融，按照ΕΤ、Ν0分析藥盒 說明書進行嚴格操作。3. 2. 3統計學處理同實驗1。3. 3實驗結果與NC相比較，HD和MD有明顯降低SHR血漿ET的作用(P 0. 05) ；PC、HD和MD能顯著增加NO含量(P < 0. 01或P 0. 05)。4.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發性高血壓大鼠(SHR)血漿NA和腎上腺素(Adr)的影響4.1實驗動物同實驗1。4. 2實驗方法4. 2. 1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。4. 2. 2色譜條件色譜柱為C18色譜柱(250mmX4. 0mm, 5 μ m)；柱溫為室溫；流動相為甲 醇-0. 15mol化―1磷酸二氫鉀緩衝液(1 9，ρΗ6· 0)；流速為Iml .mirT1 ；檢測波長為280nm。 此條件下分別以NA和Adr計算理論塔板數不低於3000。4. 2. 3實驗步驟連續給藥9w，末次給藥後禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg"1),自腹主動脈取血1.5ml置於含肝素試管中，混勻，4°C條件下2000rpm離心 15min，分離血菜；取血漿100 μ 1，加0. 05mol .L-1高氯酸200 μ 1，IOOOOrpm離心2min，倒入 Millipore Ultra-free-Mc 離心管，IOOOOrpm 離心 3min 後置 _20°C冰箱待測。4. 2. 4統計學處理同實驗1。4. 3實驗結果血漿樣品的測定取「4. 2. 3」項處理好的血樣超濾液按上述色譜條件分析，給藥 9w後HD和PC與NC比較，NA顯著降低(P < 0. 05)。5.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發性高血壓大鼠(SHR)心臟重量及其指數的影 響5.1實驗動物同實驗1。5. 2實驗方法5. 2. 1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。5. 2. 2實驗步驟連續給藥9w，末次給藥後禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主動脈取血後，快速取心，置預冷生理鹽水中洗淨，剪去殘餘組織，用濾紙 吸乾表面水分，分離左右心室並稱重，室間隔歸左室。稱取左心室重量，計算表示左心室肥 厚程度的左室重量指數(左心室重與體重比)。5. 2. 3統計學處理同實驗1。5. 3實驗結果與NC相比，各給藥組的左室重量、左室重量/右室重量和心室重量/體重有顯著 性差異(P < 0. 05或P . 05)。6.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發性高血壓大鼠(SHR)主動脈和腎動脈組織形 態學的影響6.1實驗動物同實驗1。6. 2實驗方法6. 2. 1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。6. 2. 2實驗步驟 6. 2. 2. 1主動脈HE染色病理形態觀察 連續給藥9w，末次給藥後禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉(5ml ·1^)，自腹主動脈取血後，迅速摘取胸主動脈，用福馬林固定，石蠟包埋，HE染色。用 光學顯微鏡觀察並拍照。6. 2. 2. 2主動脈和腎動脈bFGF、Ki_67的免疫組化檢測連續給藥9w，末次給藥後禁食(不禁水)24小時，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主動脈取血後，迅速摘取胸主動脈和腎動脈，福馬林固定，脫水、透明、 浸蠟、包埋、切片。組織切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化後，浸泡於水中待用。酸性修復取配置好的檸檬酸緩衝液(pH = 6.0士0. 1)800 1500ml於壓力 鍋中，電爐加熱至沸騰。脫蠟水化後的組織切片置於耐高溫塑料染色架上，放入已沸騰 的緩衝液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，從噴氣開始記時，1. 5min後壓力 鍋離開熱源，冷卻至室溫。取出玻片，先用自來水衝洗後，置放於卵育盒中。PBS(NaCl 9. 0g+Na2HP04 ·12Η20 6. 0g+NaH2P04 ·2Η20 0. 4g+ 蒸餾水 1000ml)衝洗三次，每次間隔 3min, 除去PBS液。每張切片加50μ1 3%過氧化氫，室溫下孵育lOmin，以阻斷內源性過氧化物 酶的活性。PBS衝洗三次，每次間隔3min，除去PBS液。每張切片加50μ 1的bFGF-2 (sc-79)或Ki_67 (cloneSP6)兔抗大鼠多克隆抗體 (均按1 50稀釋)，在4°C下孵育過夜。PBS衝洗三次，每次間隔3min，除去PBS液，每張 切片加50 μ 1即用型二步法(非生物素)PV6001兔二步法檢測試劑盒，室溫下孵育15min。 PBS衝洗三次，每次間隔3min，除去PBS液。DAB顯色850 μ 1蒸餾水與DAB試劑中Α、B、C試劑各50 μ 1混勻，配製成ImlDAB 顯色液。每張切片加50 μ 1新鮮配製的DAB溶液，自來水衝洗，蘇木素復染30秒，自來水衝 洗，返藍。切片經梯度酒精脫水乾燥、中性樹膠封固。結果判定①bFGF染色結果判定參考Mattern方法，從以下兩方面評分陽性染 色深度(未見染色為0，輕度染色為1，中度染色為2，深度染色為3)和陽性細胞的百分比 (未見染色記為0，染色細胞 50%為3)，將這兩方面得分相加。 在未知病理診斷的條件下，在高倍鏡下分別觀察10個視野後，平均得分、記錄。得分0-2分 為陰性表達，超過2分(3-6)為陽性表達，其中3-4分為弱陽性，5-6分為強陽性。②Ki-67標記指數判定參照文獻，以胞核染成均一棕黃色，胞漿及胞膜不著色為 陽性細胞，隨機計數5個以上高倍視野1000個細胞，平均每100個細胞中陽性染色細胞核 數為 Ki-67 指數(Ki-671)。6. 2. 3統計學處理同實驗1。6. 3實驗結果6. 3. 1對SHR組織病理形態的影響6. 3. 1. 1組織學檢查各組變化不明顯。6. 3. 1. 2光鏡下檢查Wt 主動脈大部分接近正常，個別內皮細胞腫脹，中膜未見明顯增厚(6-8層)，外 膜結締組織未見沉積物。NC 主動脈動脈壁厚薄不一，內膜增生，呈現小的高低起伏狀，內皮 下間隙可見少量沉積物，內皮細胞不完整，內膜表面可見紅細胞附壁，部分中膜平滑肌細胞 增生，管壁中膜明顯增厚(達11-13層)，外膜結締組織未見沉積物。HD 主動脈內膜輕度增 生，部分增厚，內皮細胞腫脹，部分中膜輕度增厚(8-10層)，外膜結締組織未見沉積物。MD 主動脈內膜輕度增生，可見小的突起。內皮細胞不完整，部分中膜增厚(10-11層)，外膜結締組織未見沉積物。LD 主動脈內膜輕度增生，呈現小的高低起伏狀，內皮下間隙可見少量 沉積物，內皮細胞不完整，內膜表面可見紅細胞附壁，部分中膜平滑肌細胞增生，中膜明顯 增厚(10-12層)，外膜結締組織未見沉積物。NJ:主動脈內膜輕度增生，可見小的突起。內 皮細胞不完整，部分中膜增厚(9-11層)，外膜結締組織未見沉積物。PC:主動脈內膜輕度 增生，部分增厚，內皮細胞腫脹，部分中膜輕度增厚(8-10層)，外膜結締組織未見沉積物。6. 3. 2對SHR主動脈和腎動脈平滑肌細胞(VSMC) bFGF和Ki_67的影響6. 3. 2. 1對各組主動脈和腎動脈VSMC bFGF含量的影響bFGF陽性染色主要瀰漫性分布於動脈中膜VSMC胞漿中，在高倍視野下觀察呈 顆粒狀；細胞核幾乎不著色。與NC相比，Wt主動脈和腎動脈VSMCbFGF含量明顯降低(P
<0. 01)，HD和MD主動脈VSMC bFGF含量顯著下降(P < 0. 01或P < 0. 05)，HD的腎動脈 VSMC bFGF的含量也明顯下降(P . 05)。6. 3. 2. 2對各組主動脈和腎動脈VSMC Ki-671的影響Ki-67陽性反應均分布於主動脈中膜VSMC的細胞核中，胞漿無染色。與NC相比， Wt、HD和PC的主動脈和腎動脈VSMC Ki-671明顯減少(P < 0. 01或P < 0. 05), NJ的腎動 脈VSMC Ki-671也明顯降低(P 0. 05)。降壓實驗研究表明單次給予仙人掌果多糖後2h即有明顯的降壓效應，4h降壓效 應達到高峰，降壓幅度最大值為0. 68士8. 02kPa。4h時HD與治療前相比有顯著性差異(P
<0. 05)。從降壓療效維持的時間來看，仙人掌果多糖各給藥組給藥12h後SBP恢復到治療 前水平。從降壓幅度來看仙人掌果多糖降壓呈現明顯的量效和時效關係。在連續9w給藥 過程中，仙人掌果多糖對SHR顯示持續的降壓作用，各劑量組之間呈現量效和時效依賴趨 勢，其作用特點是平緩、穩定。HD和MD與治療前和NC相比有顯著性差異(P<0.01) ；LD和 NJ與NC相比也有顯著性差異(P <0.01)，但自身前後比較不是非常明顯，但也有差異(P
<0. 05)。HD、MD、LD 和 NJ 降壓的最大均值分別為 2. 16士0. 18、1. 59士 1. 44、1. 42士0. 16、 0. 87士0. 18和0. 82士0. IQkPa0由此說明仙人掌果多糖具有良好的降血壓的作用。因此，仙人掌果多糖可明顯降低SHR的收縮壓，並呈明顯的時效和量效關係；能明 顯降低SHR血漿RA、AngII、ET、去甲腎上腺素(NE)和升高NO的含量；保護SHR主動脈內皮 細胞，逆轉平滑肌細胞增殖，在某種程度上具有逆轉SHR靶器官損害的作用。三、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血脂作用的試驗研究1.仙人掌果及仙人掌果多糖對高脂血症(HLP)大鼠血脂及肝臟形態學的影響1. 1實驗動物SD大鼠60隻，雄性，體重160士 10g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號 為SCXK桂2003-0003 ；動物飼料由廣西醫科大學實驗動物中心生產(標準飼料)。實驗期 間大鼠自由攝食、飲水、通風和自然採光。1.2實驗方法1. 2. 1模型建立及實驗分組取大鼠60隻，隨機分成為空白組(KB) 10隻和高脂造模型組(ZM)50隻。常規飼養 1周(w)後，禁食不禁水12小時(h)，採血，檢測基礎血脂。參照文獻方法製備高脂飼料，即
9由87. 3%基礎飼料、10%豬油、2%膽固醇、0. 5%豬膽鹽、0. 2%丙基硫氧嘧啶配製而成。ZM 大鼠以高脂飼料餵飼3w後，禁食(不禁水)12h，採血，檢測血脂。與造模前的血脂比較以確 定HLP模型是否建成。HLP模型造成後，將HLP大鼠按血清總膽固醇(TC)水平分為5組: CPFP高劑量組(HD) XPFP低劑量組(LD)、仙人掌果原汁組(NJ)、陽性對照組(LF)及HLP模 型組(HL)，每組10隻。1.2. 2給藥方法大鼠造模結束各組分別給予相應藥物灌胃。HD和LD分別給3. 06g · kg—1 · cf1和 0. 79g · kg-WCPFP，NJ 給 3. 15g · kg—1 · cf1 仙人掌果原汁；LF 給 3. Omg · kg—1 · cf1 洛伐他 汀，空白組(KB)及HL以IOml · kg—1生理鹽水灌胃。每日1次，連續3w。各組均自由飲水。1.2. 3攝食量和體重每日同一時間記錄進食量，每w同一時間記錄各組大鼠體重，以便調整給藥劑量。1.2.4TC、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-膽固醇 (LDL-C)、載脂蛋白AI (apoAI)和載脂蛋白B(apoB)的測定給藥3w，末次給藥前禁食12h，給藥Ih後，取血，裝入抗凝或不抗凝試管中，在4°C 下3000轉/分(rpm)離心lOmin，分別取血清或血漿，在全自動生化分析儀上分別測定TC、 TG、HDL-C, LDL-C, apoAI 和 apoB 的含量。1. 2. 5LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C比值和動脈硬化指數(Al)的計算根據單項的血脂測定結果(TC、TG、HDL-C和LDL-C含量)分別計算血脂綜合 指數(LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C比值以及Al)，其中AI根據Frieldwald公式計算=AI = (TC-HDL-C)/HDL-C。1.2. 6肝重和肝臟係數各組大鼠處死後，迅速摘取肝臟，用預冷生理鹽水漂洗再用濾紙吸乾表面水分後， 稱重。根據肝重計算肝臟係數肝臟係數=肝臟重量(g)/體重(g)X100%。1.2.7肝組織病理學觀察取肝組織，切成4_5mm3小塊，10 %中性福馬林固定，梯度乙醇脫水75%乙醇 90min 95% 乙醇 90min 100% 乙醇 90minX3 次 100%二甲苯 60minX 2 次，62°C浸石 蠟2hX2次，包埋後切片6 μ m，貼於普通載玻片上。經HE染，光學顯微鏡下觀察並拍照。1. 2. 8統計學處理應用SPSSl 1. 0軟體進行統計學處理，計量資料均採用〒土 S表 示，兩組間計量資料比較採用t檢驗，多組均數比較採用方差分析。1.3實驗結果1. 3. 1造模期間大鼠攝食量和體重變化造模期間大鼠平均日攝食量和體重均有不同程度的增加。ZM大鼠平均日攝食量均 低於KB，其中第Iw有顯著性差異(P 0.05) ；ZM大鼠體重均高於KB，但無顯著性差異(P >0.05)。1. 3. 2大鼠HLP模型的建立餵飼高脂飼料的ZM大鼠3w後測血脂。與造模前相比，血清TC、TG、LDL-C水平顯 著升高(P < 0. 01), HDL-C水平明顯下降(P < 0. 05)。說明ZM大鼠存在著血脂代謝紊亂， HLP模型複製成功。1. 3. 3對大鼠攝食量和體重的影響
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給藥期間，各組大鼠生長良好，活動正常。給藥前各組大鼠攝食量和體重均無明顯 差別(P>0.05)。給藥3w後，大鼠平均日攝食量和體重均穩步增加，與KB、HL相比，各給 藥組大鼠平均日攝食量和體重無顯著性差異(P > 0. 05)，說明CPFP對大鼠攝食量和體重變 化無不良影響。L 3. 4 對 HLP 大鼠 TC、TG 和 LDL-C 的影響給藥前，各HLP模型組間大鼠的血清TC、TG和LDL-C水平相互比較無顯著性差異 (P > 0. 05)，但都明顯高於 KB (P 0.05) ；HL大鼠血清TC、TG和LDL-C分別升高 23. 84%,27. 27%和31. 82%，均有顯著性差異(P < 0. 05) ；HD、LD、NJ及LF血脂分別降低 TC(23. 10%U8. 29%U9. 60%禾口 31. 64% ) ,TG(34. 37%,27. 27%,24. 64%禾口 35. 48% )和 LDL-C(26. 70%,24. 76%、19. 29%和 38. 42% )，各組 TC、TG和 LDL-C均顯著降低(P < 0. 01 或 P < 0. 05)。與HL比較，各給藥組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均非常明顯下降(P 0. 05)，說明CPFP能顯 著降低HLP大鼠血清TC、TG和LDL-C，HD和LF效果均較好。L 3. 5對HLP大鼠HDL-C的影響給藥前，各HLP模型組間大鼠血清HDL-C水平相互比較無顯著性差異(P > 0. 05)， 但都明顯低於KB (P 0. 05) ；HL 降低 8. 70%,無顯著性差異(P > 0. 05) ；HD,LD,NJ和 LF分別升高 19. 78%、 8. 51%、8. 60%和13. 83%，HD大鼠血清HDL-C升高有顯著性差異(P 0. 05)。與HL比較，各給藥組大鼠血清HDL-C水平均有所升高，HD和LF有顯著性差異(P 0. 05) ；HD, LD、NJ和LF血清apoB分別降低 49. 26%,40. 16%,47. 18%和50. 15%，均有非常顯著性差異(P 0. 05)。1. 3. 7對HLP大鼠血脂綜合指數(LDL_C/HDL_C、TG/HDL-C比值和Al)的影響給藥3w後，與HL比較，HD、LD、NJ和LF血脂綜合指數分別降低LDL_C/ HDL-C(57. 68%,52. 66%,49. 84 % 和 62. 38 % ), TG/HDL-C(63. 89 %,57. 41 %,52. 78 % 和 66. 67% )、AI (62. 23%,53. 68%,51. 54%和 65. 80% )，均有非常顯著性差異(P 0. 05)，LD和NJ大鼠血清LDL-C/HDL-C和AI比值有顯 著性差異(P < 0. 01或P < 0. 05)。1. 3. 8對HLP大鼠肝重和肝臟係數的影響給藥3w後，與HL比較，HD、LD、NJ和LF大鼠的肝重和肝臟係數都有不同程度的 降低，肝重依次降低15. 16%、10. 15%、11. 25%和16. 99%, HD和LF降低有顯著性差異(P<0.05)；肝臟係數依次降低 12. 10%、9. 80%、10. 09%和 13. 26%，HD、LD、NJ 和 LF 降低有 顯著性差異(P < 0. 01或P 0. 05)。1. 3. 9對HLP大鼠肝臟脂肪變性的影響1.3.9. 1組織學檢查KB 肝臟無異常變化，肝臟表面光滑，有光澤，未見充血、水腫等現象；HL 肝臟體 積增大，包膜緊張，邊緣圓鈍，切面油膩，無光澤，呈奶黃色，可見針頭大的細小顆粒，屬典型 肝細胞脂肪變性；各給藥組肝臟色澤、質地、體積均有明顯改善。1.3. 9. 2 光鏡觀察KB 肝組織的形態學表現正常，肝小葉結構清晰，肝細胞排列呈條索狀，以中央靜 脈為中心放射狀走行，未見肝細胞濁腫、脂變和壞死，匯管區可見小葉間小血管和毛細膽 管，未見炎細胞浸潤和淤膽形成等改變，10隻大鼠肝細胞均未見脂肪變性(0/10)；HL:肝小葉結構欠清晰，10隻大鼠均出現了中度至重度的肝細胞脂肪變性 (10/10)，胞漿中出現大小不等的脂肪空泡，肝細胞體積普遍變大變圓，細胞核被擠在一邊， 肝竇明顯變窄或消失，肝細胞著色較正常細胞為淺，胞漿淡染，腺泡內多見點狀或灶狀壞 死，匯管區伴有輕-中度炎症細胞浸潤，未見明顯肝纖維化，大部分肝小葉中央靜脈周顯現 膽固醇結晶；各給藥組肝組織均有不同程度的改善，尤其是HD和LF肝組織有較大程度改善。2.仙人掌果及仙人掌果多糖對高脂血症(HLP)大鼠血液流變學的影響2.1實驗動物同實驗1。2. 2實驗方法2. 2. 1血液流變學的測定給藥3w，末次給藥前禁食12h，給藥Ih後，取血3. 5ml，用血清洗旋轉式粘度計，測 全血粘度(高、中、低切)，血漿粘度和紅細胞壓積值等血液流變學指標。2. 2. 2統計學處理同實驗1。2. 3實驗結果對HLP大鼠血液流變學的影響給藥3w後，與HL比較，HD、LD、NJ和LF全血粘度(高切、中切、低切)、血漿粘度、 紅細胞(RBC)壓積值均有顯著性降低(P < 0. 01或P < 0. 05)；與LF比較，HD的RBC壓積 值、全血粘度(高切)和血漿粘度均顯著性降低(P < 0. 01或P < 0. 05)，效果優於LF ；LD 和NJ的RBC壓積值也顯著降低(P < 0. 05)，說明CPFP對HLP大鼠的血液流變學異常具有
明顯改善作用。3.仙人掌果及仙人掌果多糖對高脂血症(HLP)大鼠抗氧化作用的影響3.1實驗動物同實驗1。3. 2實驗方法3. 2.1樣本處理給藥3w，末次給藥前禁食12h，給藥Ih後，取血，裝入不抗凝試管中，在4°C下 3000rpm離心lOmin，取血清，分裝，_20°C保存。3. 2. 2血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定
測定原理以黃嘌呤氧化酶法測定，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超 氧陰離子自由基，後者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色。嚴格按照SOD 測試盒說明書操作，在550nm處測定SOD的吸光度(OD)，根據下列公式計算血清SOD活性血清SOD活性(U/ml)=(對照管OD值-測定管OD值)+對照管OD值+ 50 % X 樣品測試前稀釋倍數。注每Iml反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD 活力單位⑶。3. 2. 3血清丙二醛(MDA)含量的測定測定原理採用硫代巴比妥酸(TBA)法。過氧化脂質降解產物中的MDA可與TBA 縮合，形成紅色產物。嚴格按照SOD測試盒說明書操作，在532nm處測定MDA的OD值，根據 下列公式計算血清MDA含量MDA含量(nmol/ml)=(測定管OD值-測定空白管OD值)+ (標準管OD值-標 準空白管OD值)X標準品濃度X樣品測試前稀釋倍數。3. 2. 4統計學處理同實驗1。3. 3實驗結果對HLP大鼠抗氧化作用的影響給藥3w 後，HD、LD、NJ 和 LF 血清 SOD 活性分別升高 50. 06%、40. 64%、37. 24% 和34. 33% ；與HL比較，HD、LD和NJ有非常顯著性差異(P < 0. 01)，LF有顯著性差異(P < 0. 05)。血清MDA含量分別降低36. 33%,32. 72%,27. 78%和28. 66%，各給藥組均有非 常顯著性差異(P 0. 05)。實驗結論1.仙人掌果多糖具有降脂及調節脂蛋白代謝的作用能降低高脂血症 大鼠血中的TC、TG、LDL-C和apoB水平，升高HDL-C和apoAI水平；並保護肝臟細胞結構功 能的改變，增強其對脂質代謝的作用。2.仙人掌果多糖能改善血液粘度和流變性，直接改善血液成分能降低高脂血症 大鼠的全血粘度(高、中和低)、血漿粘度、RBC壓積，而改善血液流變性。通過改善血液濃、 粘、聚狀態，促進脂類物質的代謝。3.仙人掌果多糖能清除自由基，減少脂質過氧化物的產生可以有效降低高脂血 症大鼠血清中MDA含量，升高血清中SOD活性，提示仙人掌果多糖可能通過提高自由基清 除酶的活性，維護體內自由基穩態與平衡，增加LDL的抗氧化能力，減少脂質過氧化物的產 生，從而發揮防治高脂血症和動脈粥樣硬化的作用。因此，仙人掌果多糖具有降脂及調節脂蛋白代謝的作用，能改善血液粘度和流變 性，直接改善血液成分，清除自由基，減少脂質過氧化物的產生，從而發揮防治高脂血症和 動脈粥樣硬化的作用。四、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血糖作用的試驗研究1.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠糖代謝和一般體徵的影響1.1實驗動物SD大鼠，雌雄各半，體重(200士 10) g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證 號為SCXK桂2003-0003 ；動物飼料由廣西醫科大學實驗動物中心生產(標準飼料)。DM模 型鼠自由攝食、飲水，通風，自然採光。1.2實驗方法
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1. 2. IDM大鼠模型建立及指標測定1.2. 1. IDM大鼠模型建立及分組SD大鼠禁食12小時(h)，以60mg · kg—1鏈脲黴素(STZ)腹腔注射(STZ溶解於 0. Imol · L—1、pH4. 2的檸檬酸/檸檬酸鈉緩衝溶液中，現配現用，置於冰上)。正常對照組 (Sd)大鼠腹腔注射等量上述緩衝液。72h後(大鼠採血前禁食12h)用血糖(BG)測定儀測 定空腹血糖(FBG)值，凡FBG彡13mmol · L—1視為DM大鼠模型。將成模DM大鼠按BG濃度由高到低排序進行物理編號，隨機將DM大鼠分為DM模 型對照組(NC)、胰島素組(IN)、原汁組(NJ)、CPFP中劑量組(MD)和CPFP高劑量組(HD)。1.2. 1.2給藥劑量與方法IN 給 10U. kg—1 · Cf1 胰島素(Ins)，NJ 給仙人掌果原汁 3. 15g · kg—1 · d-1，MD 和 HD 分別給1. 58g · kg-1 · cf1』· 06g · kg-1 · cf1。每天上午空腹給藥1次，連續灌胃8周(w)。1. 2. 1. 3—般體徵觀察觀察大鼠的精神活動、毛髮改變、飲水量、進食量和大小便等一般狀況，並記錄體 重變化情況。1.2. 1.4血糖的測定給藥第4w和第8w，用BG測定儀測定各組FBG，計算並統計分析藥物對DM大鼠BG 水平的影響。1. 2. 1. 5糖化血紅蛋白(GHB)的測定給藥8w末，拔大鼠眼球採血2-4ml置於離心管中，以500 1000轉/分(rpm)，離 心5 10分鐘(min)，棄上清留沉澱的紅細胞，然後用生理鹽水洗滌2 3次。用GHB測定 試劑盒測定GHB含量，具體操作詳見試劑盒說明書，計算並統計分析藥物對DM大鼠GHB水 平的影響。計算公式每IOg GHB吸光度(OD)=測定管0D/2ml血液中GHB克數X2X IOg1. 2. 2統計學處理應用SPSSl 1. 0軟體進行統計學處理，計量資料均採用〒士 s表 示，兩組間計量資料比較採用t檢驗，多組均數比較採用方差分析。1.3實驗結果1. 3. 1對STZ所致DM大鼠的一般狀況的影響1. 3. 1. 1—般狀態觀察Sd大鼠精神振奮，活動頻繁，毛髮純白有光澤，墊料乾燥；NC大鼠精神萎靡，活動 度低，尾巴溼冷，毛髮枯黃、無色澤、脫落，豎毛弓背，墊料極潮，下腹部及外陰部毛浸溼，大 便稀澹，出現「三多一少」的症狀；給予CPFP和Ins後，DM大鼠精神逐漸好轉，活動增多，皮 毛光澤漸好，墊料比較乾燥，大便稀塘減少，「三多一少」的症狀減輕。1. 3. 1. 2對DM大鼠體重的影響在實驗中Sd和IN大鼠體重呈持續增長趨勢；NC大鼠體重逐步下降，說明DM大 鼠體內產生代償，代謝紊亂；給予CPFP後，DM大鼠體重8w時顯著高於NC同期體重(P < 0. 05)。1.3.2藥物對STZ所致MD大鼠FBG的影響給藥4w和8w後，各組FBG均有不同程度的降低。與同期NC比較HD、MD和NJ均 有顯著降血糖作用(P 0. 05)。
1.3.3藥物對STZ所致DM大鼠GHB的影響結果顯示與NC相比，HD、MD和NJ的GHB含量顯著降低(P < 0. 01或P 0. 05)。提示HD、MD、NJ均能較穩定地降低血糖。2.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠脂代謝的影響2.1實驗動物同實驗1。2. 2實驗方法2.2.1血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、L DL-C和高密度脂蛋白-膽固醇 (HDL-C)的測定給藥8w末，取血，4 °C，3500rpm離心IOmin，在全自動生化分析儀上測定血清 TC、TG、LDL-C和HDL-C含量，並根據Frieldwald公式計算動脈硬化指數(Al) =AI = (TC-HDL-C)/HDL-C。2. 2. 2統計學處理同實驗1。2. 3實驗結果與Sd相比，NC大鼠TC、TG和LDL-C顯著升高(P < 0.01)，HDL-C含量顯著下降 (P < 0. 05)；給藥8w後，與NC相比，HD和IN的TC和TG含量顯著下降(P < 0. 05)，LDL-C 含量也有所減少，其中HD的LDL-C含量降低效果顯著(P < 0. 05)；同時，HD和IN的HDL-C 含量顯著升高(P < 0. 05)。3.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠胰腺組織形態學的影響3.1實驗動物同實驗1。3. 2實驗方法3. 2. 1胰腺組織HE染色形態觀察給藥8w末，取血後，迅速取胰腺，用福馬林固定，石蠟包埋，HE染色。光鏡下觀 察心肌組織病理學變化並拍照。3. 2. 2胰腺組織α細胞和β細胞的免疫組化檢測給藥8w末，剖腹取胰腺，福馬林固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。組織切片經 二甲苯脫蠟，梯度酒精水化後，浸泡於水中待用。酸性修復取配置好的檸檬酸緩衝液(pH = 6. 0士0. l)800_1500ml於壓力鍋中，電 爐加熱至沸騰。脫蠟水化後的組織切片置於耐高溫塑料染色架上，放入已沸騰的緩衝液中， 蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，從噴氣開始記時，1. 5min後壓力鍋離開熱源，冷卻 至室溫。取出玻片，先用自來水衝洗後，置放於卵育盒中。PBS(NaCl 9. 0g+Na2HP04 · 12H20 6. 0g+NaH2P04 · 2H20 0. 4g+蒸餾水1000ml)衝洗三次，每次間隔3min,除去PBS液。每張切片加50 μ 1 3%過氧化氫，室溫下孵育lOmin，以阻斷內源性過氧化物酶的 活性。PBS衝洗三次，每次間隔3min,除去PBS液。每張切片加50 μ 1的Glucagon Ab-I或 Insul in Ab_5 (均按1 50稀釋)，在4°C下孵育過夜。PBS衝洗三次，每次間隔3min，除 去PBS液，每張切片加50 μ 1即用型快捷免疫組化Maxvision 抗兔-HRP檢測試劑盒，室溫 下孵育15min。PBS衝洗三次，每次間隔3min，除去PBS液。DAB顯色850 μ 1蒸餾水與DAB試劑中Α、B、C試劑各50 μ 1混勻，配製成ImlDAB 顯色液。每張切片加50 μ 1新鮮配製的DAB溶液。自來水衝洗，蘇木素復染30秒，自來水 衝洗，返藍。切片經梯度酒精脫水乾燥、中性樹膠封固。
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鏡下觀察各組免疫組化片進行綜合評分。1、表達面積①陽性表達細胞數為0計 為0分。②陽性表達細胞數75%計為4分。2.表達強度 ①陽性信號強烈，呈棕褐色，小塊狀，計為3分，②陽性信號中等，呈棕色，粗顆粒狀，計為2 分；③陽性信號較弱，呈淡棕色，細顆粒狀，計為1分；④無陽性信號，計為0分。兩項相加， 0分為陰性(_)，2-3分為弱陽性(+)，4-5分為中度陽性(++)，6-7分為強陽性(+++)。計數 採用雙盲法。3. 3實驗結果3. 3. 1對DM大鼠組織病理形態的影響Sd胰腺中胰島數量較多，體積較大，胰島呈圓形或橢圓形的細胞團，邊界清晰，胰 島內細胞數量較多，排列整齊，胞漿豐滿，核多為圓形；NC胰島數量明顯減少，結構破壞，輪 廓消失，胰島內細胞數量明顯減少，細胞排列不規則，邊界不清，部分細胞腫脹或皺縮壞死， 胰島內出現空泡；IN胰島數量明顯增多，輪廓完整，分布規則，細胞邊界清晰；HD和MD與NC 相比胰腺病變較輕，胰島輪廓完整，胰島內細胞數量增多，分布規則，胞漿疏鬆，淡染，細胞 邊界較清晰。3. 3. 2藥物對STZ所致MD大鼠胰島β細胞和α細胞的影響3. 3. 2. 1胰島β細胞Ins表達情況結果顯示與NC相比較，各給藥組Ins表達陽性率顯著升高(P 0. 05)。免疫組 化染色顯示各組表達胰高血糖素程度與NC相比，Sd和各給藥組α細胞胰高血糖素表達 無顯著差異(P > 0. 05)。4.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠抗氧化作用的影響4.1實驗動物同實驗1。4. 2實驗方法4. 2. 1心肌中丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)測定給藥8w末，取血後，取心臟，用冰生理鹽水清洗，濾紙吸乾，稱重後，用生理鹽水配 成10%心肌勻漿，於冷凍離心機3000rpm離心15min，取上清液，按要求用生理鹽水稀釋成 一定倍數後用於心肌MDA和SOD測定。4. 2. 1. 1血清MDA含量的測定測定原理採用硫代巴比妥酸(TBA)法。過氧化脂質降解產物中的MDA可與TBA 縮合，形成紅色產物，在532nm處有最大吸收。嚴格按照SOD測試盒說明書操作，在532nm 處測定MDA的OD值，根據下列公式計算血清MDA含量MDA含量(nmol/ml)=(測定管OD值-測定空白管OD值)+ (標準管OD值-標 準空白管OD值)X標準品濃度X樣品測試前稀釋倍數。4. 2. 1. 2血清SOD活性的測定
測定原理以黃嘌呤氧化酶法測定，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超 氧陰離子自由基，後者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色。嚴格按照SOD 測試盒說明書操作，在550nm處測定SOD的吸光度(OD)，根據下列公式計算血清SOD活性血清SOD活性(U/ml)=(對照管OD值-測定管OD值)+對照管OD值+ 50 % X 樣品測試前稀釋倍數。注每Iml反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD 活力單位⑶。4. 3實驗結果4. 3. 1藥物對DM大鼠心肌MDA和SOD的影響鏈脲黴素(STZ)所致NC大鼠心肌MDA含量較Sd有顯著增高，SOD活性則顯著降 低，顯示DM大鼠心肌抗氧化能力下降。用藥8w後，與NC比較，HD、MD和NJ心肌MDA值均 顯著降低(P <0.01)，相應SOD活性明顯增高(P <0.01)，但與IN相比均有顯著差異(P < 0. 01)。5.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠心肌超微結構的影響5.1實驗動物同實驗1。5. 2實驗方法給藥8w後，取血後，摘取心臟，迅速放入預冷的2. 5%戊二醛(用磷酸緩衝液配製， PH7. 2)固定，之後用PBS (pH7. 2)漂洗IOmin三次，放入1 %鋨酸(四氧化鋨)，固定2h，PBS 漂洗IOmin三次，50 % 90 %乙醇逐級脫水，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，38°C、45°C、60°C依 次聚合36h，LKB-V超薄切片機切片，約70nm，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在H-500型透射電 子顯微鏡下觀察心肌線粒體和心肌纖維等超微結構的變化並拍照。5. 3實驗結果電鏡下觀察Sd心肌纖維未見異常，心肌肌節對位整齊，無肌原纖維溶解，線粒體 結構完整，嵴排列規則，清晰可見。NC可見心肌肌節對位錯亂，呈過度收縮，部分肌原纖維 溶解，線粒體腫脹，線粒體邊界不清，部分嵴斷裂溶解，形成線粒體內小空泡，表明鏈脲黴素 STZ所致DM大鼠心肌有一定損傷。各給藥組大鼠心肌肌節對位基本整齊，僅見少部分錯位， 肌原纖維溶解較少，線粒體稍見腫脹和空泡。6.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠肝和骨骼肌胰島素受體(InsR)及 骨骼肌葡萄糖轉運蛋白4(GLuT4)mRNA表達的影響6.1實驗動物同實驗1。6. 2實驗方法6. 2. IRNA 抽提6. 2. 2RNA純度和完整性分析6. 2. 3 總 RNA 逆轉錄成 cDNA6. 2. 4逆轉錄-聚合酶鏈式擴增反應(RT-PCR)6. 3實驗結果6. 3. 1藥物對鏈脲黴素(STZ)所致DM大鼠肝臟和骨骼肌InsR的影響結果顯示各給藥組DM大鼠肝臟和骨骼肌InsR的數量較NC均有增加(P < 0. 01)。6. 3. 2藥物對STZ所致DM大鼠骨骼肌GLuT4的影響
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結果顯示各給藥組大鼠骨骼肌GLuT4的數量較NC均有增加(P < 0. 01)。實驗結論通過觀察仙人掌果多糖對STZ所致糖尿病大鼠糖代謝、脂代謝及抗氧 化作用的影響，並從組織學上研究了仙人掌果多糖對胰腺及糖尿病心肌病的影響。然後從 基因水平探討了仙人掌果多糖降糖作用的可能機制。提示1.本研究採用60mg · kg—1 —次腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，以適宜劑量給 糖尿病大鼠灌胃仙人掌果多糖8w後，結果顯示仙人掌果多糖能改善糖尿病「三多一少」的 症狀，顯著降低BG和GHB。同時，也降低糖尿病大鼠的TC、TG、LDL-C和Al，升高HDL-C的含 量，這表明仙人掌果多糖促進了糖和脂肪的利用，減輕了糖毒性和脂毒性對機體的損傷，有 利於糖尿病的恢復和防止併發症的產生。2.組織形態學觀察顯示仙人掌果多糖在降糖和降脂的同時，改善了 STZ所致糖 尿病大鼠胰腺的損傷程度，增加胰島β細胞和胰島素的分泌，因此促進胰島β細胞修復， 增加胰島素分泌可能是仙人掌果多糖作用機制之一。3.糖尿病降低了大鼠抗氧化功能，使MDA水平升高，SOD活性降低。給予仙人掌果 多糖後降低了 MDA水平，升高SOD活性，這表明仙人掌果多糖能提高機體的抗氧化功能，減 輕過氧化損傷。4.電鏡觀察顯示仙人掌果多糖對STZ所致糖尿病大鼠心肌肌節對位錯亂、肌原 纖維溶解和線粒體腫脹有不同程度的改善，表明其能減輕糖尿病導致的心肌損害。5.通過RT-PCR對肝臟和骨骼肌InsR、骨骼肌GLuT4分析可知，仙人掌果多糖能提 高InsR和GLuT4的含量，說明其降糖機制可能是通過增加InsR和GLuT4含量而產生降糖 作用的。因此，仙人掌果多糖能降低血糖、糖化血紅蛋白和血脂，改善糖代謝和脂代謝紊 亂，提高機體的抗氧化能力，延緩併發症的發生發展，改善機體的狀況，這與其修復受損的 胰島β細胞、促進胰島素分泌、增加InR和GLuT4含量有關。五、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)抗腫瘤作用的試驗研究(一 )體外抗腫瘤作用的研究1.實驗材料1. 1細胞株人肝癌細胞株HEPG-2、人卵巢癌細胞株SK0V3、人胃癌細胞株SGC7901 由醫學科學實驗中心細胞室提供；人肝癌細胞株HCC-LM3、人肝正常細胞株L02等由第二軍 醫大學腫瘤所提供。2.實驗方法2. 1細胞的培養、凍存與復甦本實驗選用人肝癌、胃癌、卵巢癌4種細胞株，於37°C、5% CO2的培養箱中，10%新 生牛血清以及青鏈黴素各100U/ml的1640培養液中培養。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況， 0. 25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用於實驗。凍存時，取對數生長期細胞，消化、離心、去上清。加入凍存液，使細胞密度約為 1 X IOVml分裝於凍存管中，先置於4°C 60分鐘，再置於-20°c 60分鐘，再置_80°C超低溫 冰箱中保存。復甦時，將超低溫冰箱中的腫瘤細胞凍存管迅速轉入37°C水中，保持凍存管管口 部位於水面之上，攪拌加速解凍，待完全解凍後，用75%酒精棉球擦拭凍存管壁。將解凍後
18細胞轉移到離心管中，加入約6倍凍存液量的培養基IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，重複此 步一次。再加入培養液，混勻細胞，轉至培養瓶中培養。2. 2噻唑藍(MTT)法確定仙人掌果多糖提取物對腫瘤細胞的抑制作用本實驗選擇胃癌7901、肝癌HEPG_2、LM3卵巢癌SK0V3、人正常肝細胞L02細胞株， 採用MTT法研究仙人掌果多糖的抗癌效果。取對數生長期的腫瘤細胞株，濃度為5X IO4個 /ml，加入到96孔板，每孔加含細胞的培養液100μ 1，置37°C，5% CO2培養箱孵育48h後， 分別加入不同濃度的仙人掌果多糖，用PBS溶液調整每孔細胞總體積為200 μ 1，48h後加入 20 μ IMTT (2mg/ml)，37°C，5% CO2培養箱孵育4h後，棄上清，每孔加入DMSO 200 μ 1，放入酶 標儀，中速振蕩5分鐘後，於490nm波長處測定吸光度(0D值)，每個濃度平行測定3孔。以 PBS溶液為空白對照，按下列公式求出生長抑制率(IR)。
實驗組平均OD值
抑制率(IR，%) = (1- - ) X100%
空白對照平均OD值2. 3Annexin V-FITC染色觀察細胞凋亡(1)將LM3細胞於6孔板內生長，處於對數生長期內加入CPFP(2. 500mg/ml)誘導 細胞凋亡，並設立陰性對照組；(2)用PBS洗滌細胞兩次；(3)在 500 μ 1 的 Binding Buffer 中力口入 2 μ 1 Annexin V-FITC, 5 μ IPropidium Iodide，混勻；(4)將上述溶液滴加於蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；(5)避光、室溫反應5分鐘。將蓋玻片倒置於載玻片上，於螢光顯微鏡下、雙色濾光 片(FITC和羅丹明)觀察，Armexin V-FITC螢光信號呈綠色，PI螢光信號呈紅色。 2. 4流式細胞術定量檢測細胞凋亡率取對數生長期的腫瘤細胞，經各濃度CPFP作用後，收集細胞，用結合緩衝液調節 細胞密度為1 X106/ml，取100 μ 1懸液，加5μ 1 Annexin-v/FITC和10 μ 1碘化丙錠溶液， 常溫避光孵育15分鐘，加400 μ 1 PBS混勻，流式細胞儀分析。2. 5RT-PCR 檢測 Ρ53 基因 mRNA 的表達2. 6蛋白質印跡檢測P53相關蛋白表達2. 7統計學分析應用SPSS13. 0軟體進行統計學處理，計量資料均採用f ±S表示，兩組間計量資料 比較採用t檢驗，兩組率的比較採用X2檢驗，多組均數比較採用方差分析。3.實驗結果3. ICPFP對腫瘤細胞的抑制作用結果表明，CPFP不同劑量及5-FU的常用劑量對人體卵巢癌SK0V-3、胃癌7901、肝 癌HEPG-2、肝癌LM3細胞的增殖有不同的抑制作用。CPFP與5-FU比較，抑制能力較弱。相 同濃度下，CPFP對LM3細胞的抑制作用較其他株細胞明顯，但考慮到藥物濃度較大，總體來 說一定劑量仙人掌果多糖對腫瘤細胞的抑制作用不大。在比較對同一種腫瘤細胞抑制率相 近的條件下，CPFP對人正常肝細胞L02的抑制作用很小而陽性對照藥物5-FU對人正常肝 細胞L02抑制作用明顯。
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3. 2CPFP對細胞凋亡的影響CPFP (2. 500mg/ml)作用LM3細胞48小時後，Annexin V-FITC染色可以觀察螢光 顯微鏡下的凋亡細胞。流式細胞術檢測CPFP作用下LM3細胞凋亡率可知，NS組的凋亡率為 9. 76% ；CPFP(0. 625mg/ml)組凋亡率為 19. 77% ；CPFP(2. 500mg/ml)組凋亡率為 34. 12%, 由此推測CPFP可能具有誘導凋亡的作用。3. 3CPFP對P53表達的影響結果表明，隨CPFP劑量增加，LM3細胞中P53基因mRNA的表達有一定下調趨勢。 蛋白質檢測的結果也發現同樣的趨勢。4.結論(1)仙人掌果多糖對腫瘤細胞的抑制作用本實驗研究表明仙人掌果多糖不同劑 量對人正常肝細胞L02的抑制作用很小，但陽性對照抗腫瘤藥物5-FU的常用劑量對L02的 抑制作用明顯。仙人掌果多糖不同劑量和陽性對照抗腫瘤藥物5-FU的常用劑量對人體卵 巢癌SK0V-3、胃癌7901、肝癌HEPG-2、肝癌LM3細胞的增殖均有不同的抑制作用。仙人掌果 多糖的抑制作用與5-FU比較，抑制能力較弱，且用藥濃度較大。即仙人掌果多糖的細胞毒 性較小，直接殺傷細胞的能力較弱。推測仙人掌果多糖對腫瘤的抑制可能通過其他途徑發 揮作用。(2)仙人掌果多糖對細胞凋亡的作用本實驗研究表明仙人掌果多糖作用LM3細 胞48小時後，Annexin V-FITC染色可以觀察螢光顯微鏡下的生長活躍的腫瘤細胞和藥物 誘導下已凋亡的腫瘤細胞。可以觀察到正常LM3細胞，其輪廓清晰；其中的凋亡細胞皺縮、 顏色發白，形狀較周邊正常細胞均有所改變，呈綠色螢光。根據流式細胞術檢測LM3細胞調 亡率可知，NS組的凋亡率為9. 76% ；仙人掌果多糖(0. 625mg/ml)組凋亡率為19. 77% ；仙 人掌果多糖(2. 500mg/ml)組凋亡率為34. 12%，由此可以推測仙人掌果多糖可能具有一定 的促凋亡作用。(3)仙人掌果多糖作用下的P53的表達分析本實驗RT-PCR結果研究表明，不同 劑量仙人掌果多糖作用下LM3細胞P53基因mRNA的表達強度變化具有一定趨勢，隨仙人掌 果多糖劑量的增加，P53基因mRNA的表達下調。根據Western blot結果可以看出，不同劑 量仙人掌果多糖作用下LM3細胞P53基因蛋白的表達強度不同，其變化具有一定趨勢，隨仙 人掌果多糖劑量的增加，P53基因蛋白的表達有所減弱。由此推測仙人掌果多糖降低突變 型P53在分子及蛋白水平的表達可能是其抗腫瘤機制之一。( 二)體內抗腫瘤作用的研究1.實驗材料1. 1實驗動物昆明種小鼠，雌雄各半，18 20g，由廣西醫科大學實驗動物中心提 供(試驗動物生產許可證SCXKG桂2006-0003，試驗動物使用許可證SYKG桂2003-0005)。 S180荷瘤小鼠種源，由上海細胞所提供。2.實驗方法2.1動物急性毒性試驗因受仙人掌果多糖(CPFP)濃度和體積的影響，一次給藥無法測出其LD50，故依據 動物能耐受的最大濃度、最大體積的藥量，每隔12h給藥1次，共給藥2次，測定CPFP最大 給藥量。按急性毒性試驗常規方法分劑量分組灌胃。
2. 2S180荷瘤小鼠腋下移植瘤的抑制實驗2. 2. 1S180荷瘤小鼠瘤株保種、傳代及移植瘤模型製備(1)S180瘤株的保種取體重20g的昆明小鼠4 5隻，腹腔接種S180瘤株，定期7 9天傳一代，腹腔 保種。(2) S180腋下移植瘤模型的建立取腹腔傳代7天且生長良好的S180肉瘤小鼠，脫頸椎處死，75%乙醇消毒動物皮 膚，無菌條件下操作，小心剪開小鼠腹腔，吸取生長良好的動物腹水，注意觀察腹水顏色，腹 水為乳白色無絮狀沉澱物者為佳，血性腹水則不可用。臺盼藍染色證明活細胞數> 98%，腹 水用生理鹽水按1 2比例稀釋，吹打混勻，細胞計數板計數，調整細胞數為2X106個活細 胞/ml。取昆明種小鼠50隻，右側腋部皮膚常規酒精消毒，持Iml注射器予小鼠腋下皮下注 射0. 2ml瘤細胞懸液，製成局灶性腫瘤模型。操作過程中注意緊貼皮下進針，勿將瘤細胞懸 液漏出。在造模後第4天和第6天觀察S180腋下移植瘤模型的成瘤情況。2. 2. 2實驗動物分組及給藥接種24h後，小鼠按性別、體重隨機分成五組，每組10隻，連續給藥10天生理鹽 水組(NS)生理鹽水 0. 2ml · IOg-I · d_l，po ；CTX 組=CTX 0. 02g · kg-1 · d_l，ip ；CPFP 高 中低劑量組1. 97g · kg-1 · d-l、0. 99g · kg-1 · d-l、0. 49g · kg-1 · d_l，po。質評標準為具有下列一項實驗資料作廢(1)生理鹽水組小鼠腫瘤平均瘤重小於Ig或20%小鼠的瘤重小於0. 4g，表示腫瘤 生長不良。(2)給藥組小鼠死亡超過20%，或去瘤後平均體重下降超過15%，表示藥物的不 良反應。2. 2. 3計算抑瘤率第11天稱體重並處死動物，剪開小鼠右腋下皮下組織，剝離腫瘤、胸腺、脾臟，稱 重，按下列公式計算抑瘤率，胸腺指數，脾指數。
抑瘤率XIOO o/0 狎熘羊^oj生理鹽水組瘤重 υυ /02. 3CPFP對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響2. 3. 1S180荷瘤小鼠胸腺指數、脾指數的測定胸腺指數=胸腺重量(mg) /體重(g)脾指數=脾臟重量(mg) /體重(g)2. 3. 2脾淋巴細胞轉化功能測定(1)實驗方法植物血凝素誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖實驗(MTT法)(2)原理當T細胞受植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白(Con Α)等致分裂原或特異性 抗原刺激後發生母細胞轉化，活細胞特別是增殖細胞通過線粒體水解酶將MTT (四甲基偶 氮唑鹽)分解為藍紫色formazan結晶而顯色，其光密度值能夠反映細胞的增殖情況。(3)脾淋巴細胞懸液的製備用藥結束後脫頸椎處死小鼠，於超淨臺中無菌取出 脾臟，用眼科剪反覆剪碎，PBS衝洗，經200目尼龍網過濾至離心管中，沿離心管側壁加入
21淋巴細胞分離液1ml，離心1500轉/分鐘，10分鐘，吸取中間層細胞，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培養基調整細胞濃度為5X 106/ml單個脾細胞懸液。(4)淋巴細胞轉化功能的測定將製備好的小鼠脾細胞懸液加入96孔培養板中， 100 μ 1細胞懸液/孔。每隻鼠設對照孔3復孔，每孔加100 μ 1 1640培養液；Con A刺激 孔3復孔，每孔加100 μ 1 Con A(10mg/L)溶液。於37°C、5% C02培養箱中孵育40h後，取 出每孔加入IOyl MTT(5mg/ml)溶液，繼續孵育4h。取出後，小心吸去上清，每孔加入DMSO 150 μ 1，振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解，在酶標儀上選擇570nm處的波長，測OD值，計算 刺激指數(Si)。SI =刺激孔(加Con A孔)OD值/對照孔OD2. 4CPFP對S180荷瘤小鼠血清自由基的作用S180荷瘤小鼠造模、分組，給藥10天後，第11天眼球取血處死小鼠。血漿2000r/ 分鐘離心10分鐘，收集上層無溶血的血清於EP管中，-20°c冰箱中備用，一周內測定超氧化 物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)。2. 5透射電鏡觀察CPFP對S180荷瘤小鼠瘤組織超微結構的影響2. 6CPFP對S180荷瘤小鼠瘤組織病理學形態及P53、Bax、VEGF蛋白表達水平的影 響S180荷瘤小鼠造模、分組，給藥10天後，第11天眼球取血，脫頸椎處死小鼠，剝離 瘤組織，10%中性福馬林固定，24h內製成蠟塊備用。2. 6. 1觀察瘤組織病理學形態結果判定低倍鏡下(X100)觀察壞死面積，按壞死面積大小分級判斷為灶狀壞 死(+)，小片狀壞死(++)，大片狀壞死(+++)。2. 6. 2免疫組化法檢測P53、Bax、VEGF蛋白表達結果判定P53陽性染色定位於腫瘤細胞核。細胞核出現棕黃色或棕褐色顆粒為 陽性表達細胞。Bax陽性染色定位於腫瘤細胞質。細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性 表達細胞。VEGF陽性染色定位於腫瘤細胞質。細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達 細胞。每張切片高倍鏡下隨機觀察5個視野，計數陽性細胞百分率或陽性組織相對灰度值。2. 7數據處理應用SPSS13. 0軟體進行統計學處理，計量資料均採用表示，兩組間計量資料 比較採用t檢驗，兩組率的比較採用X2檢驗，多組均數比較採用方差分析。3.實驗結果3. 1動物急性毒性試驗在試驗中觀察到，小鼠灌服藥物2星期內，CPFP各劑量組和生理鹽水對照組動物 無異常差別，藥後14d，處死小鼠，解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、小腸，均無異常發現。 試驗結果表明小鼠24h內共灌胃給予CPFP4. 746g · kg_l，最大耐受量達4. 746g · kg_l。3. 2CPFP對S180荷瘤小鼠腋下移植瘤的抑制實驗3. 2. 1腫瘤造模情況觀察及各實驗組瘤塊比較小鼠接種2天內，外觀無明顯變化，活動、飲食正常；接種瘤細胞後第3 4天， 部分小鼠可觸及皮下米粒大小腫塊；接種後第4 6天腫塊逐漸明顯，各組成瘤率均約為 80%。仙人掌果多糖高、中、低劑量組及CTX組腫瘤生長較生理鹽水組緩慢。但CTX組小鼠
22飲食減少，體重減輕明顯，皮毛無光澤，豎毛現象明顯，活動明顯減少，常擁擠在一起；而仙 人掌果多糖高、中、低劑量組小鼠明顯比CTX組和生理鹽水組小鼠活潑，體重減輕不明顯， 皮毛有光澤，豎毛現象不明顯。給藥結束後處死各組小鼠，取瘤塊分析比較.生理鹽水組與 仙人掌果多糖中、低劑量組瘤塊大小均約為(0. 8-1. lcm) X (0. 8-1. Ocm)，仙人掌果多糖 高劑量組瘤塊大小約為0. 4cmX0. 6cm, CTX組瘤塊大小約0. 3cm_0. 45cm。3. 2. 2CPFP對S180小鼠腋下移植瘤抑瘤作用仙人掌果多糖高、中劑量、CTX組的瘤重明顯低於生理鹽水組，而仙人掌果多糖低 劑量組其瘤重則與生理鹽水組相近。表明仙人掌果多糖的高、中劑量組及CTX組對腫瘤均 有明顯的抑制率，其中以高劑量組和CTX組的效果最好。3. 3CPFP對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響3. 3. ICPFP對胸腺指數及脾指數的影響與生理鹽水組比較，CPFP各劑量組胸腺指數較生理鹽水組有所增高，其中高、中劑 量具有顯著差異(P 0. 05)；環磷醯胺組胸腺指數明 顯降低，與生理鹽水組相比有顯著差異(P 0.05)。提 示CPFP能促使胸腺發育，改善荷瘤小鼠所引起的胸腺抑制作用，對脾臟的發育無明顯促進 作用；CTX可顯著抑制荷瘤小鼠的胸腺，對脾臟無明顯抑制作用。3. 3. 2CPFP對脾淋巴細胞轉化功能的影響與生理鹽水組比較，CPFP高、中劑量組均有顯著差異(P < 0. 01)，CTX組脾淋巴細 胞轉化能力明顯低於生理鹽水組(P < 0. 01)，提示CPFP能明顯提高荷瘤小鼠的脾淋巴細胞 轉化功能，環磷醯胺組荷瘤小鼠的脾淋巴細胞轉化功能明顯低於生理鹽水組。3. 4仙人掌果多糖對S180荷瘤小鼠S0D、MDA、NO的影響與生理鹽水組比較，仙人掌果多糖高、中劑量組均能提高SOD含量(P < 0. 05或P <0.01),仙人掌果多糖高、中、低劑量組均能降低MDA、NO含量(P < 0. 05或P < 0. 01)。3. 5仙人掌果多糖對瘤組織超微結構的影響生理鹽水組瘤細胞形態不規則，細胞間有連接，絨毛豐富。細胞器結構較清 晰核形態不規則，核漿比例大，核異形性強，核內異染色質多，核仁明顯。仙人掌果多糖 1. 97g Ag.1組可見凋亡細胞，細胞間間隙增大，細胞核內染色質邊集，核仁濃縮或碎裂，並 可見類圓形凋亡小體，胞質內線粒體空泡變性，線粒體嵴融合，呈早期凋亡跡象。CTX組可 見有核異型，細胞漿出現大片空泡區，粗面內質網擴張，核糖體脫落，核膜消失，核碎裂，呈 晚期凋亡跡象。3. BS180荷瘤小鼠瘤組織病理學形態及Bax等蛋白表達水平觀察3. 6. ICPFP對於S18tl瘤組織病理學形態改變的影響低倍鏡下觀察，生理鹽水組和CPFP低劑量組可見腫瘤細胞生長活躍，有部分壞死 灶，CPFP高劑量、中劑量組和CTX陽性對照組對腫瘤的破壞力大於生理鹽水組和CPFP低劑 量，觀察可見瘤內有大片狀壞死，壞死面積較大及程度較為嚴重，經秩和檢驗，各組壞死無 明顯差異。3. 6. 2CPFP對於瘤組織Bax蛋白表達的影響與生理鹽水組比較，CPFP組瘤組織中Bax蛋白表達數值均有所提高，與生理鹽水 組相比，高、中劑量組P < 0. 05。
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3. 6. 3CPFP對瘤組織P53蛋白表達的影響與生理鹽水組比較，CPFP組瘤組織中P53蛋白表達明顯降低，高劑量組P < 0. 01， CTX、中、低劑量組P < 0. 05。3. 6. 4CPFP對於瘤組織VEGF蛋白表達的影響與生理鹽水組比較，CPFP組瘤組織中VEGF蛋白表達均降低，高劑量組P < 0. 01， 中劑量組P < 0. 05，低劑量無顯著意義。4.結論(1)仙人掌果多糖對S18tl荷瘤小鼠的抑瘤作用實驗結果表明，與生理鹽水組比較，仙人掌果多糖高、中組抑制腫瘤有顯著性差異 (P < 0. 01或P < 0. 05)，CTX組抑瘤率抑制腫瘤有顯著性差異(P < 0. 01)。CTX為臨床上 廣泛應用的抗腫瘤藥物，系氮芥與磷醯胺基結合而成的化合物，可直接破壞DNA並阻止其 複製。CTX在體經肝細胞色素P45tl氧化，裂環生成中間產物醛磷酸醯胺，並在腫瘤細胞內分 解出強有效的磷醯胺氯芥，可與DNA發生烷化，形成交叉聯結，抑制腫瘤細胞的生長繁殖， 從而發揮抗癌作用，為周期非特異性藥物，療效確切。本實驗中，CTX組抑瘤率達60%以上， 對S18tl肉瘤有良好的抑制作用。仙人掌果多糖高劑量、中劑量組抑瘤率高於30 %，實驗復重 三次，結果基本一致。一般認為中藥的抑瘤率超過30%，實驗重複三次，連續數次療效穩定， 且有統計學意義，可評定藥物有一定療效。本實驗結果表明仙人掌果多糖對S18tl小鼠腋下 移植瘤有明顯的抑制作用。(2)仙人掌果多糖對S18tl荷瘤小鼠抗腫瘤免疫作用本研究結果顯示，仙人掌果多糖能提高胸腺指數，對脾臟指數無明顯影響，說明其 主要促進胸腺細胞增殖分化，促進細胞免疫功能，從一定程度上改善荷瘤小鼠免疫器官狀 況，對因荷瘤而損傷的免疫系統功能有一定的保護和促進恢復作用。在本實驗研究中，仙人 掌果多糖組對S18tl荷瘤小鼠T淋巴細胞增殖活性有較大程度提高，提示仙人掌果多糖可增 強T淋巴細胞的增殖活性和提高免疫應答能力，是其發揮抗腫瘤作用的機制之一。(3)仙人掌果多糖對S18tl荷瘤小鼠體內自由基的作用清除自由基是一條有效的抗癌、抑癌手段。SOD的活力反映了機體清除氧自由基的 能力。本實驗主要測定了 S18tl荷瘤小鼠血漿MDA和SOD含量，顯示仙人掌果多糖能降低S18tl 荷瘤小鼠血漿MDA，升高SOD含量。仙人掌果多糖高劑量、中劑量與生理鹽水組比較有顯著 性差異(P < 0. 05或P < 0. 01)。提示仙人掌果多糖抗腫瘤機制可能與清除自由基有一定 關係。(4)仙人掌果多糖對S18tl荷瘤小鼠瘤組織病理學形態的影響低倍鏡下觀察各實驗組瘤內壞死面積，生理鹽水組和仙人掌果多糖低劑量組可見 腫瘤細胞生長活躍，有部分壞死灶，可能是由於腫瘤組織生長過快，局部缺血形成的小壞死 灶，仙人掌果多糖高劑量、中劑量組瘤體普遍小於生理鹽水組，可見瘤內有大片狀壞死，壞 死面積較大及程度較為嚴重。經秩和檢驗各組間無明顯差異，可能與各組腫瘤均有壞死有 關。(5)免疫組織化學法及仙人掌果多糖對S18tl荷瘤小鼠Bax、P53蛋白表達的影響Bax和P53是兩種常見的癌基因或抑癌基因，其蛋白表達在各種惡性腫瘤治療的 研究中，可作為一種預後標誌。實驗結果中與生理鹽水組比較，仙人掌果多糖組瘤組織中
24Bax蛋白表達數值均有所提高，高、中劑量組P < 0. 05，低劑量組無顯著意義。與生理鹽水 組比較，仙人掌果多糖組瘤組織中P53蛋白表達明顯降低，高劑量組P <0.01，CTX、中、低 劑量組P < 0. 05。表明仙人掌果多糖能提高Bax基因蛋白表達；降低P53基因的突變，這 可能是其抗腫瘤的重要機理之一。(6)仙人掌果多糖對S18tl荷瘤小鼠VEGF蛋白表達及NO含量的影響本研究表明，仙人掌果多糖組瘤組織中VEGF蛋白表達及NO含量降低，提示抑制腫 瘤血管生長有可能也是仙人掌果多糖抗腫瘤的機制之一。因此，仙人掌果多糖對腫瘤細胞有一定的抑制作用，對正常細胞的抑制作用不明 顯；具有一定抑制腫瘤生長的作用；能提高胸腺指數、脾指數，提高淋巴細胞增殖功能，增 強機體細胞免疫。本發明通過實驗研究得知仙人掌果中所含的仙人掌果多糖可通過調節內皮功 能、抑制腎素血管緊張素系統及逆轉平滑肌細胞增殖三方面起到控制高血壓的發生發展； 有明顯的降血脂、抗氧化、改善血液流變學及肝臟脂肪變性作用，對防治高脂血症和肝脂肪 變性的發生發展有積極意義；能改善糖代謝和脂代謝，增加胰島β細胞、胰島素受體InsR 和Glu4，提高機體的抗氧化能力、修復受損心肌細胞，對防治糖尿病及其併發症有良好的潛 在應用價值；並具有一定的抗腫瘤作用。因此本發明為開發天然無毒的防治高血壓、高血 脂、糖尿病及抗腫瘤的藥物或保健品奠定了基礎，有效促進了仙人掌果資源的充分利用。由於天然藥物在高血壓病的治療過程中，對心、腦、腎等多個臟器及系統具有調節 和保護作用，同時可以較好地改善患者的生活質量；治療高血糖時能從整體調節出發，扶正 固本，改善調節胰島β細胞及受體的功能，減少抗體的拮抗，作用溫和持久；在降壓和降糖 的同時能達到降脂；天然藥物及其活性成分抗腫瘤具有多靶點、多途徑、多環節的特點；且 中草藥具有價格相對低廉，副作用相對較少，辨證論治，靈活加減，非常適宜於慢性疾病的 治療；因此仙人掌果及仙人掌果多糖在製備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或 保健品方面將具有良好的應用前景。
具體實施例方式本發明的實施例1 仙人掌果多糖的製備取仙人掌果，加10倍重量的水超聲提取1. 5小時，提取液濃縮，加入95%的乙醇， 調節濃縮液的乙醇濃度至70 %進行沉澱，然後在5000rpm轉速下離心lOmin，離心沉澱物加 水溶解，用體積比為1 2的無水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取2次，水層用Sevage+木瓜蛋 白酶法去除蛋白，濃縮，乾燥，即得仙人掌果多糖。其中Sevage+木瓜蛋白酶法的具體過程為用Sevage溶液(體積比氯仿正丁 醇=4 1)萃取水溶液2次後，取水層液，調pH至5 7，向水溶液中加入2u/100ml的木 瓜蛋白酶，65°C保溫26h，IOOOOrpm離心5min，去除底層沉澱，得仙人掌果多糖脫蛋白液。經測定，所提取的仙人掌果多糖中多糖含量達71. 1%。本發明的實施例2 取仙人掌果打漿(成糊狀)，過濾(去渣、去籽)，加1 20倍 重量的水至500 1000ml，再加入O 20%重量的市售涼粉或海洋膠、O 20%重量的蜜糖 或木糖醇，攪拌均勻，放入鍋內煮沸後加入允許範圍內的防腐劑，經過濾，裝罐，封口，滅菌， 放置冷卻凝結；或者攪拌均勻後注模，烘乾(保留10 50%水份)，出模，得半成品，包裝，即得仙人掌果膏。該膏劑口服，每次250克，每日1-2次；可用於防治腫瘤。本發明的實施例3 以新鮮仙人掌果或仙人掌果汁為原料，經全部或部分發酵或 勾兌釀製成酒精度(V/V)的溶液，過濾，裝罐，封口，即得仙人掌果酒。該酒劑口服，每 次10ml，每日1-2次；可用於防治腫瘤。本發明的實施例4:取仙人掌果打漿(成糊狀)，過濾(去渣、去籽)，加糖，攪勻， 注模，烘乾(保留10 60%水份)，出模，得半成品，包裝，即得仙人掌果果丹皮。該製劑口 服，每次1-5克，每日1-2次；可用於防治腫瘤。本發明的實施例5 仙人掌果加水煎煮0. 5 2小時後，加入1 30%體積量的牛 奶和1 30%體積量的茶水，再加入甜味調料，攪勻，裝罐，封口，滅菌，即得仙人掌果奶茶， 該茶劑口服，每次10-25ml，每日1-2次；可用於防治腫瘤。本發明的實施例6 取實施例1製備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加入矯味劑，控 制合適的相對密度，分裝、滅菌，製得仙人掌果多糖口服液或仙人掌果汁。每Iml 口服液中 含仙人掌果多糖0. 1克或仙人掌果1克，每次服用10ml，每日2-3次，用於高血壓的治療。本發明的實施例7 取實施例1製備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加入溶劑、混勻， 靜置、濾過，再濃縮至相對密度為1. 30 1. 35(50 60°C )，加入賦型劑制粒或以濃縮液噴 霧乾燥制粒，分裝、滅菌，製得仙人掌果多糖顆粒或仙人掌果顆粒劑。每袋1-5克，每次服用 1袋，每日2-3次，用於高血脂的治療。本發明的實施例8 取實施例1製備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加入適宜的賦型 劑，用滾轉制粒法製得仙人掌果多糖片或仙人掌果片。每片含0.1-0. 5克仙人掌果多糖或 1-5克仙人掌果，每次服用1-5片，每日2-3次，用於高血糖的治療。本發明的實施例9 取實施例1製備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加入適宜的賦 型劑，直接用全自動膠囊分裝機分裝，製得仙人掌果多糖膠囊或仙人掌果膠囊。每粒含 0. 1-0. 5克仙人掌果多糖或1-5克仙人掌果，每次服用1-5粒，每日2-3次，用於高血糖的治 療。本發明的實施例10 取實施例1製備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加入適宜的賦 型劑，製成滴丸。每丸含0. 1-0. 5克仙人掌果多糖或1-5克仙人掌果，每次服用1-5丸，每 日2-3次，用於高血壓的治療。
2權利要求
仙人掌果多糖在製備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應用。
2.根據權利要求1所述仙人掌果多糖的應用，其特徵在於仙人掌果多糖是從仙人掌 果中提取出來的多糖類成分，其總糖含量為60% 80%。
3.根據權利要求2所述仙人掌果多糖的應用，其特徵在於仙人掌果多糖的製備方法 為取仙人掌果，加4 10倍重量的水超聲提取0. 5 2. 5小時，提取液濃縮，加入40 95%的乙醇，調節濃縮液的乙醇濃度至40 90%進行沉澱，然後在1000 IOOOOrpm轉速 下離心2 lOmin，離心沉澱物加水溶解，用體積比為1 5 2 10的無水乙醇和乙酸乙 酯混合液萃取1 4次，水層用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，濃縮，乾燥，即得。
4.根據權利要求3所述仙人掌果多糖的應用，其特徵在於=Sevage+木瓜蛋白酶法去 除蛋白的過程為用體積比為氯仿正丁醇=4 10 1 5的Sevage溶液萃取水溶液 1 3次後，取水層液，調pH至5 7，向水溶液中加入1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65°C保溫20 28h，1000 IOOOOrpm離心2 lOmin，去除底層沉澱，得仙人掌果多糖脫蛋 白液。
5.根據權利要求1或2所述仙人掌果多糖的應用，其特徵在於取仙人掌果多糖，加入 或不加藥用輔料，按照常規方法製備成藥物製劑。
6.根據權利要求1或2所述仙人掌果多糖的應用，其特徵在於將仙人掌果多糖與其 它藥用成分組合，並加入或不加藥用輔料，按照常規方法製備成藥物製劑。
7.根據權利要求1或2所述仙人掌果多糖的應用，其特徵在於取仙人掌果多糖，加入 或不加輔料，按照常規方法製備成保健品。
8.根據權利要求1或2所述仙人掌果多糖的應用，其特徵在於將仙人掌果多糖與其 它物質組合，加入或不加輔料，按照常規方法製備成保健品。全文摘要
本發明公開了從仙人掌果中提取的仙人掌果多糖在製備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應用。由於仙人掌果多糖可控制高血壓的發生發展，對防治高脂血症和肝脂肪變性的發生發展有積極意義，對防治糖尿病及其併發症有良好的潛在應用價值，並具有一定的抗腫瘤作用，因此本發明為開發防治高血壓、高血脂、糖尿病及抗腫瘤的藥物或保健品奠定了基礎，有效促進了仙人掌果資源的充分利用。而且仙人掌果屬於天然植物資源，其藥用和保健效果好，對人體多個臟器及系統具有調節和保護作用，價格相對低廉，副作用相對較少，因此仙人掌果多糖在製備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品方面將具有良好的應用前景。
文檔編號A23L1/30GK101947232SQ201010504990
公開日2011年1月19日 申請日期2008年9月9日 優先權日2008年9月9日
發明者劉華鋼 申請人:劉華鋼