通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法及其裝置的製作方法

2023-05-24 21:43:01

專利名稱：通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法及其裝置的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物生物技術領域；具體涉及一種通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物等有效成分的方法及實現這一方法的裝置。
背景技術：
次生代謝產物是由次生代謝產生的一類細胞生命活動或植物生長發育正常運行的非必需的小分子有機化合物，其產生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發育時期的特異性。可分為苯丙素類、醌類、黃酮類、單寧類、萜類、留體及其甙、生物鹼七大類。藥用植物中次生代謝產物是其發揮藥用作用的關鍵成分。植物次生代謝產物是植物對環境的一種適應，是在長期進化過程中植物與生物和非生物因素相互作用的結果。在對環境脅迫的適應、植物與植物之間的相互競爭和協同進化、植物對昆蟲的危害、草食性動物的採食及病原微生物的侵襲等過程的防禦中起著重要作用。植物特別是藥用植物中含有豐富的次生代謝產物，有的代謝產物對人體疾病具有顯著的療效，因此植物的次生代謝產物受到了非常高的重視。一般情況下，植物次生代謝產物是從種植或自然分布的植物體中提取得到，而對於某種次生代謝產物的大量需求往往會導致某種植物的利用採摘過度，如紫杉醇的利用導致紅豆杉的瀕危就是一個很好的例子。因此，人們開始採用植物組織培養的方法來進行特定植物的培養來進行次生代謝產物的生產。但傳統植物組織培養的方法具有低通量和高人工消耗的缺點，反應器的應用是一個比較好的解決方案。傳統的反應器培養只是針對植物細胞的培養，而植物次生代謝途徑是高度分支的途徑，這些途徑在植物體內或細胞中並不全部開放，而是定位於某一器官、組織、細胞或細胞器中並受到獨立的調控。它們是細胞生命活動或植物生長發育正常運行的非必需的小分子化合物，其產生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發育時期的特異性，因此特定植物組織器官的培養對次生代謝產物的獲得是必須的。植物次生代謝產物積累到一定的濃度後往往會抑制其進一步的產生，因此及時的移去生長環境中產生的代謝產物，使其控制在一定的濃度範圍內對次生代謝產物的持續生成具有非常重要的作用。實際生產過程中需要一種大批量持續獲得培養植物器官和組織的途徑，進一步可以通過調控外在的環境等因子來使得植物產生並提高產量，並通過一定的方法控制次生代謝產物的濃度。本發明即提供了此種方法並公開了實現上述方法的裝置。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術存在的缺點和不足，提供一種通過植物組織培養方法大批量、持續的獲得次生代謝產物的方法。本發明的另一目的在於提供一種實現上述通過組織培養方法獲得次生代謝產物的方法的裝置。 本發明的目的是通過以下技術方案實現:通過植物組織培養方法對植物進行組織器官水平的培養獲得批量的植物材料，而後通過創造合適的培養條件、逆境脅迫環境或添加誘導因子使植物材料產生所需的大量次生代謝產物，而後通過對植物體及培養液來進行提取從而獲得所需要的次生代謝產物。本發明的通過植物組織培養方法獲得次生代謝產物的方法更具體的包括下述步驟:
(1)植物體批量獲得，也即植物體批量擴繁:將植物體處理後接種入本發明所述的裝置中進行培養參數設定後，進行規模化培養，根據需要進行下一步的操作；
(2)植物次生代謝產物的產生及誘導:將獲得的植物體在一定的培養條件下產生或進行誘導以獲得需要的次生代謝產物；
(3)植物次生代謝產物的收集和提取:根據次生代謝產物存在的部位，以及次生代謝產物的特性進行次生代謝產物的收集提取操作以獲得所需；
所述(I)中植物體的處理方法為一般植物組織培養方法中將滅菌後或無菌狀態的外植體接種至固體培養瓶或培養反應器裝置中。根據不同的植物及培養目的接種不同的外植體類型。所述培養用反應器裝置是利用間歇浸沒原理設計的植物生物反應器變型。所述植物生物反應器裝置的培養因素主要有:
培養基:根據植物種類的不同進行不同培養基的確定及激素種類及濃度的選擇，包含現有的培養基類型及通過改良後的培養基類型；
培養基PH:用於培養擴繁的pH為植物適宜生長的範圍為5.(Γ7.0，優選5.5飛.5 ；浸沒頻率:根據植物種類不同調整不同的浸沒頻率，lmin/24tT24h/24h，優選3min/18h 30min/3h ；
接種密度:1個/LlOO個/L ，優選10個/LlOO個/L。可以利用可拆卸的多層培養網架來進行植物體的多層培養，來提高培養密度，並且可以提高空間利用效率。培養條件:光照強度100(T500001ux，優選1500 2000 lux，光照時間5 20 h/d，優選8 18 h/d，培養溫度25±1°C ；
培養時間:培養時間依據不同植物生長狀態來確定，一般生長時間為l(T90d,優選2(T40d。以植物體長滿培養容器為宜，期間營養液的消耗可以通過裝置中方便拆卸組裝的儲液罐結構來進行更新或補充。所述規模化培養是通過裝置可拆卸的多層培養支架來實現。所述步驟(2)中一定的培養條件包括創造合適的培養條件、逆境脅迫環境或添加誘導因子。所述合適培養條件是針對不同的植物種類設定不同的適合其生長的因素，通過培養後即可獲得大量植物體特定部位的組織，從而從植物體中或從其分泌物中獲得所需次生代謝產物；
所述逆境脅迫環境指高溫、低溫、強光照、弱光照、機械刺激和輻射等環境因子等，通過逆境脅迫環境誘導使植物體內產生新的次生代謝產物或提高原有次生代謝產物的含量，或誘導使次生代謝產物分泌到細胞外或提高分泌效率；環境因子如合適的培養條件及逆境脅迫環境等的改變可以通過裝置外置的環境控制裝備來實現，如控溫裝置可以提高培養環境溫度、外置光照裝置可以調節培養環境的光照強度等來誘導前述步驟(I)中大量的植物體產生所需的次生代謝產物；所述誘導因子指鹽分含量、化學物質、植物激素、前體物質等，通過誘導因子誘導使植物體內產生新的次生代謝產物或提高原有次生代謝產物的含量，或誘導使次生代謝產物分泌到細胞外或提高分泌效率；誘導因子的改變可以通過裝置中方便拆卸組裝的儲液罐結構，在更換培養液的同時將誘導因子如鹽、誘導前體物質或具有毒害作用的化學物質等添加到培養液中來實現，在添加後通過培養使前期得到的大量植物體在誘導因子的作用下產生所需的次生代謝產物。所述步驟(3)中次生代謝產物存在的部位包括:一是存在植物體內的次生代謝產物；二是植物體分泌到細胞外的次生代謝產物；三是存在植物體內同時亦可分泌到胞外的次生代謝產物；
所述次生代謝產物的收集根據其所存在的部位採取不同的操作:當次生代謝產物存在植物體內時，將誘導後的多層培養支架上的植物體根據需要收穫部分植物體收集用於後續的提取操作，剩餘的部分可以繼續培養以持續的獲得所需的植物體；
當次生代謝產物分泌到植物細胞外時，此時次生代謝產物被衝刷到培養液中，此時只需要將裝置下部儲液罐中的培養液收集來進行提取操作；通過上部的植物體的持續培養同時控制培養的數量，從培養液中就可以持續的提取所需的次生代謝產物；
當次生代謝產物同時存在於植物體內及分泌到細胞外時，可結合上述兩種方法來進行操作，既可從植物體內提取又可從培養液中收集所需的次生代謝產物；
所述次生代謝產物的提 取所採用的具體方法根據次生代謝產物的形式採用不同的方法，如沉澱、萃取、層析過濾、吸附層析等。本發明要解決的另一個技術問題是提供實現通過組織培養方法持續的獲得次生代謝產物的方法的培養用反應器裝置，該裝置包括空氣除菌器，第一連接管，反應器罐體蓋子，反應器培養罐體，第二連接管，儲液罐，儲液罐蓋子，多層培養網架，充氣泵，時控器，輔助裝置。所述空氣除菌器通過第一連接管安裝在反應器罐體蓋子；多層培養網架放置入反應器培養罐體內進行分層培養，所述多層培養網架，為可以拆卸組裝的分層培養網架；第二連接管與反應器培養罐體相連，其長度可接觸到儲液罐的底部，所述儲液罐上端還設有儲液罐蓋子；還包括有與反應器培養罐體相連的充氣泵和時控器；
所述空氣除菌器用於過濾空氣，使培養反應器內進出的空氣處於無菌狀態；所述第一連接管，為可耐高溫高壓滅菌材料，用於連接反應器罐體蓋子、反應器培養罐體和空氣除菌器；所述反應器罐體蓋子，具有螺紋或其他方式與反應器罐體連接，且反應器罐體的上部可通過第一連接管與空氣除菌器連接，實現罐體中氣壓的排放。反應器罐體蓋子為可耐高溫高壓(121°C，30 min)滅菌材料，且材料為可透光材料，以利於培養時光的通過，從而使植物培養時光照的供給。所述反應器培養罐體，為培養植物組織的部分，罐體中部設置擋板，擋板中間位置具有向下突出的小口，用於連接第二連接管，且該突出的小口與擋板連接位置具有過濾網，防止培養的外植體掉入；反應器培養罐體的下部具有螺紋或者其他方式可與儲液罐密封連接；反應器培養罐體的外部，擋板下部和連接上部的中間位置具有橫向突出的進氣口，可通過第一連接管與空氣除菌器相連接，實現無菌空氣進入反應器的目的；反應器培養罐體的材質可耐高溫高壓(121 °C，30 min)滅菌材料，且材料為可透光材料，從而保證植物培養時光照的供給。所述第二連接管可連接到反應器培養罐體，長度為可接觸到儲液罐的底部位置，以便使培養液在氣壓的作用下，從第二連接管到達培養罐體進行植物的浸沒，並在氣壓消失時使培養液可通過其回到儲液罐體中。所述分層培養網架為可以拆卸組裝的分層培養網架，根據培養植物品種的不同，可放置入反應器培養罐體內進行分層培養，提高單位反應器的培養效率，所述多層培養網架為可耐高溫高壓(121°C，30 min)滅菌材料，網孔大小0.5mnT3cm左右以支撐植物體材料並使培養液順利通過為準，網架之間利用可組裝拆卸支柱支撐，可根據培養目的調整網架的層數，網架層數為2 10層，優選3 8層；網架間距為0.25 25.0cm，優選3.(TlOcm.所述儲液罐蓋子，具有與儲液罐相配合的螺紋或其他方式可與儲液罐密封結合，在反應器培養過程的換液步驟中用於單獨對培養液進行滅菌時應用。所述儲液罐，用於儲存培養液，上部具有螺紋或其他方式可與反應器培養罐體下部密封結合,儲液罐罐體材質可耐高溫高壓(121°C )滅菌材料。上述部件為裝置的主體部分，裝置主體直徑為5飛Ocm，優選l(T30cm。裝置主體高度l(T50cm，優選2(T40cm。所述充氣泵，用於提供工作時的氣壓動力，所述的空氣泵的氣壓壓力需配合儲液罐中液體的量，以使培養液在2min內泵到培養室中為宜。所述時控器，通過控制電流的通斷來控制充氣泵的工作，通過控制電流的通斷頻率來實現反應器的浸沒頻率。所述輔助裝置包括:加熱裝置，用以提供培養液的溫度控制；光照裝置，以提供植物培養時的光照；co2輸入裝置，可結合氣泵通氣時調整通入反應器的空氣組分，使植物生長更加健壯；傳感探針，可實時監測培養液中的PH及各種成分的變化以指導具體的操作。除此之外，輔助裝置還可以提供不同的逆境脅迫來達到不同的培養目的。本發明的原理是:
一般的用於植物培養來生產次生代謝產物是利用發酵罐等通過進行細胞水平的培養來獲得，但多數的次生代謝產物需要在組織器官水平才能夠生成。本發明上部採用的是可拆卸的分層培養進行植物組織器官的培養，可以方便的分階段進行培養物的採收來進行次生代謝產物的提取操作，並且多層培養網架的設計可以同時培養足夠數量的植物體，從而提供足夠的提高植物體分泌到培養液中的有用物質的濃度，便於次生代謝產物的富集及後續的提取濃縮收集。本發明下部採用分體式的設計，下部的儲液罐可以方便的拆卸，經過一段時間的培養後，一些胞外分泌的次生代謝產物會分泌到培養液中，通過培養液的收集可以獲得所需的物質，並且更換上新鮮培養基後經過一段時間的培養後可以持續的獲得培養液中的次生代謝產物。並且由於培養液更換方便，可以在培養液中添加某種前體物質以及脅迫因子等來通過代謝通路的調控進行所需代謝產物的富集操作。加熱、輔助光照及輔助CO2等裝置可以提供植物體生長的必要條件，可以提高植物體生長的狀態，並且可以通過調整提供此生代謝產物產生的必要逆境環境。本發明相對現有技術具有如下的優點及效果:
(1)節省成本。與傳統組織培養方式相比，採用本發明的裝置及方法進行大規模植物組織培養可以節省大量的不能重複利用的物料(如瓊脂等)的消耗，並且培養容器體積的增加以及接種過程的簡化和培養過程的自動化程度的提高使人力的消耗也大大減少。因此具有降低植物組織培養成本的作用。(2)可實現大規模快繁，提高單位產出量。本發明與傳統的組織培養室可以很好的配合進行大規模快繁。並且通過對組織培養微環境的調整可以大大提高擴繁效率，並且可以使植物處於最佳的生長發育代謝狀態，提高組培苗的質量和品質。並且本發明所述的裝置可根據生產規模進行放大。並且配備了分層培養網架，可根據需要對培養的植物組織進行分層培養。這樣就提高了單位產出量。(3)方便高效的次生代謝產物的生產。通過提高培養的密度可以產出更多的含有代謝產物的植物體，另外通過對培養一段時間後的培養液的收集可以從中提取分泌到細胞外的次生代謝產物，且可以通過調整營養液的構成來調控所需物質的生成。通過培養液的更換減少次生代謝產物濃度對其繼續產生的抑制，從而提高產物的產量。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
做進一步詳細說明:
圖1是通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法的操作流程 圖2是培養用反應器裝置分解圖。
具體實施例方式為了行文的簡便，以下涉及上下左右與附圖中的方位是一致的。實施例1
如圖1、2所示，一種通過植物組織培養獲得植物次生代謝產物的方法所涉及的裝置各部分進行裝置的組裝。反應器罐體蓋子3，具有螺紋，與反應器罐體4連接，儲液罐8上部具有螺紋與反應器培養罐體4的下部密封結合，儲液罐蓋子7具有與儲液罐8相配合的螺紋可與儲液罐8密封結合。裝置主體直徑為20cm，裝置主體高度30cm ;多層培養網架6為可耐高溫高壓(12rC,30min)滅菌材料，網孔大小0.5cm左右以支撐植物體材料並使培養液順利通過為準。多層培養網架6的各層網架利用可組裝拆卸支柱支撐，可根據培養目的調整網架的層數，圖2中的網架層數為3層；網架間距為5cm。利用裝置實現本發明的具體操作步驟如下:
(1)植物體批量獲得，也即植物體批量擴繁:
在儲液罐8中注入一定量的培養液後，按照圖2中所示的各個部件順次相連接後，將其在121°C下高溫高壓蒸汽滅菌20min。取出冷卻備用。將滅菌好的反應器主體部分於無菌條件下，將反應器培養罐體蓋子3打開後，接種入需要規模擴繁的外植體，後密封即完成接種；將時控器10根據需要設定不同的通斷頻率後連接充氣泵9，然後再與反應器主體部分反應器培養罐體4連接即可。將連接好的培養用反應器裝置接通電源後置於普通組織培養室中進行光照培養。培養過程如圖1所示。當充氣泵9處於工作狀態時，氣體由與反應器培養罐體4中部橫向突出的進氣小嘴連接的空氣除菌器2進行除菌處理，然後通過第一連接管I進入儲液罐8 ;儲液罐8中的培養液在氣壓的作用下通過第二連接管5進入反應器培養罐體4內，使反應器培養罐體4中的的植物組織器官浸沒在培養液中。反應器培養罐體4中的氣體則通過反應器培養罐體蓋子3中間出口位置連接的第一連接管2和空氣除菌器I被排出。當充氣泵9停止工作時，反應器培養罐體4內的培養液在自身重力的作用下，通過反應器培養罐體4中部擋板向下突出的小嘴和第二連接管5回流至儲液罐8中；由於反應器培養罐體4中部的擋板中心向下突出的小嘴位置設置了過濾網，因此，反應器培養罐4內的植物組織器官不會隨著培養液回流至儲液罐8中。此時，整個反應器培養罐體4內形成負壓，外界的氣體經過與反應器培養罐體蓋子3向上突出的小嘴連接的空氣除菌器I的過濾除菌處理後沿著第一連接管2進入反應器培養罐體4內。這樣，反應器培養罐體4內的植物組織器官就完成了一個被間歇浸沒的循環。可通過調節時控器10來調節上述循環的時間。當培養一段時間後，培養液中成分會有一定的消耗，根據培養需要可對培養液進行更換來保證植物的生長。更換培養液的步驟為:首先將新鮮的培養液注入備用的儲液罐8中，利用儲液罐蓋子7密封后，121°C下高溫高壓滅菌20min，冷卻備用。然後將其與正在培養植物的反應器主體部分紫外滅菌後，於無菌條件下將裝有新鮮培養液的儲液罐8替換裝有營養耗盡的培養液的儲液罐8，如圖2所示，右邊的儲液罐8就是用於替換左邊的儲液罐8。完成更換培養液過程。具體的培養因素按照不同的植物進行不同的設定。進行規模化培養，根據需要進行下一步的操作；
(2)植物次生代謝產物的產生及誘導:利用環境因子或誘導因子進行植物體的誘導，從而進行次生代謝產物的誘導。環境因子如合適的培養條件及逆境脅迫環境等的改變可以通過裝置外置的環境控制裝備來實現，如控溫裝 置可以提高培養環境溫度、外置光照裝置可以調節培養環境的光照強度等來誘導前述步驟(I)中大量的植物體產生所需的次生代謝產物；
誘導因子的改變可以通過裝置中方便拆卸組裝的儲液罐結構，在更換培養液的同時將誘導因子如鹽、誘導前體物質或化學物質等添加到培養液中來實現，在添加後通過培養使前期得到的大量植物體在誘導因子的作用下產生所需的次生代謝產物。(3)植物次生代謝產物的收集和提取:根據次生代謝產物存在的部位，以及次生代謝產物的特性進行次生代謝產物的收集提取操作以獲得所需；當次生代謝產物存在植物體內時，將誘導後的多層培養網架上的植物體根據需要收穫部分植物體收集用於後續的提取操作，剩餘的部分可以繼續培養以持續的獲得所需的植物體；
當次生代謝產物分泌到植物細胞外時，此時次生代謝產物被衝刷到培養液中，此時只需要將裝置下部儲液罐中的培養液收集來進行提取操作；通過上部的植物體的持續培養同時控制培養的數量，從培養液中就可以持續的提取所需的次生代謝產物；
當次生代謝產物同時存在於植物體內及分泌到細胞外時，可結合上述兩種方法來進行操作，既可從植物體內提取又可從培養液中收集所需的次生代謝產物。實施例2
依據圖2所示一種通過植物組織培養獲得植物次生代謝產物的方法所涉及的裝置各部分進行裝置的組裝，反應器罐體蓋子3，具有卡槽方式與反應器罐體4連接，儲液罐8上部具有卡槽方式可與反應器培養罐體4下部密封結合，儲液罐蓋子7具有卡槽方式可與儲液罐8密封結合；
裝置主體直徑為30 cm。裝置主體高度40cm ；
所述多層培養網架為可耐高溫高壓(121°C，30 min)滅菌材料，網孔大小Imm左右以支撐植物體材料並使培養液順利通過為準，網架之間利用可組裝拆卸支柱支撐，網架層數為5層；網架間距為4cm ；
其餘具體操作步驟與實施例1一致。實施例3
依據圖2所示一種通過植物組織培養獲得植物次生代謝產物的方法所涉及的裝置各部分進行裝置的組裝，同實施例1中所述，所不同的是網架層數為2層；網架間距為10cm。實施例4
依據圖2所示一種通過植物組織培養獲得植物次生代謝產物的方法所涉及的裝置各部分進行裝置的組裝，同實施例1中所述，所不同的是網架層數為10層；網架間距為2cm。實施例5
根據實施例1中所述的裝置，通過植物組織培養進行半夏中麻黃鹼的獲得的方法，具體操作步驟如下:
(I)半夏種苗的批量獲得:` 所述培養參數主要有:將半夏叢生芽接種入實施例1中所述的裝置中，接種密度:60個/L，分開接種3層，每層20個，調整好培養基後進行培養。其中:培養基配方為:Ms+1.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30 g/L蔗糖；培養基pH:5.8 ;浸沒頻率:5min/12h。培養條件:光照強度2000 lux，光照時間12 h/d，培養溫度25±1°C，培養時間:40d後植物體長滿培養容器。(2)植物次生代謝產物的誘導:在培養液不必更換的條件下，將獲得的足量的植物體及裝置通過外加輔助設備控制環境溫度達到35 °C，處理時間15 d後待半夏倒苗後即可得到所要提取次生代謝產物的半夏塊莖。利用可拆卸的多層培養網架的特點，取出部分半夏塊莖進行次生代謝產物的提取，剩餘部分通過更換新鮮的培養基後繼續培養以獲得更多的提取材料，所述繼續培養的參數同步驟(I)中所述。(3)植物次生代謝產物的收集和提取:將半夏塊莖取出後，通過研磨，超聲提取、真空乾燥等步驟得到麻黃鹼提取物，通過HPLC方法進行檢測，得到所獲得的半夏塊莖中麻黃鹼的含量可達到160.30ug/g。實施例6
根據實施例3中所述的裝置，通過植物組織培養進行半夏中麻黃鹼的獲得的方法，具體操作步驟同實施例5所述，最後得到的半夏塊莖中麻黃鹼的含量達190.70 ug/g。實施例7
根據實施例4中所述的裝置，通過植物組織培養進行半夏中麻黃鹼的獲得的方法，具體操作步驟同實施例5所述，最後得到的半夏塊莖中麻黃鹼的含量達120.50ug/g。實施例8
根據實施例1中所述的裝置，通過植物組織培養進行半夏中麻黃鹼的獲得的方法，具體操作步驟如下:
(I)半夏種苗的批量獲得:所述培養參數同實施例3中(I)中所述，所不同的是培養時間為30d。( 2)植物次生代謝產物的誘導:
通過裝置中可分體式的設計，方便的對培養液進行更換，代謝產物誘導培養液的配方為:Ms+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2, 4-D+30 g/L蔗糖，更換後繼續對半夏進行培養，所述繼續培養的參數同步驟(I)中所述。在培養一定時間後，更換新鮮的代謝產物誘導培養液繼續進行培養。所述繼續培養的參數同步驟(I)中所述。利用可拆卸的多層培養網架的特點，根據培養物的生長情況，取出部分半夏塊莖進行次生代謝產物的提取，剩餘部分在更換新鮮的培養基後繼續培養以獲得更多的提取材料。(3)植物次生代謝產物的收集和提取:
將更換下來的培養液通過離心，沉澱直接進行超聲提取真空乾燥，上清液經過濃縮後進行提取後真空乾燥，後合併提取得到的麻黃鹼產物，通過HPLC檢測得到，在更換下來的培養液中麻黃鹼的含量可以達到12.56ug/L。將取出的部分半夏愈傷半夏通過研磨，超聲提取、真空乾燥等步驟得到麻黃鹼提取物，通過HPLC方法進行檢測，得到所獲得的半夏塊莖中麻黃鹼的含量可達92.50 ug/g。實施例9
根據實施例2中所述的裝置，通過植物組織培養進行紫草中紫草素的獲得的方法，具體操作步驟如下:
(I)紫草愈傷的批量獲得:
所述培養參數主要有:將紫草愈傷組織接種入實施例2中所述的裝置中，接種密度:120個/L，分開接種6層，每層20個，調整好培養基後進行培養。其中:培養基配方為:B5+1.0 mg/L 6-BA+0.lmg/L NAA+30 g/L 蔗糖；培養基 pH:6.0 ;浸沒頻率:lmin/6h。培養條件:光照強度1000 lux，光照時間18 h/d，培養溫度25±1°C，培養時間:60d。(2)植物次生代謝產物的誘導:通過裝置中可分體式的設計，方便的對培養液進行更換，代謝產物誘導培養液的配方為:B5+1.0 mg/L 6-BA+0.lmg/L NAA+30 g/L蔗糖，並同時在培養液中添加CuSO4.5Η20，使培養液中的CuSO4濃度為0.075mg/L。更換後繼續對紫草愈傷組織進行培養，所述繼續培養的參數同步驟(I)中所述，所不同的是培養時間為20 d。在培養20 d後，再次更換新鮮的代謝產物誘導培養液繼續進行培養。在更換新鮮培養液的同時進行舊的培養液的收集來提取所需紫草素，如此往復。同時通過多層培養網架的結構調整紫草愈傷的數量使其保持相當的活力。(3)植物次生代謝產物的收集和提取:
將更換下來的培養液經過濃縮後進行丙酮提取紫草素，利用分光光度計通過在520nm下檢測來計算紫草蘇的產量，得到在更換下來的培養液中紫草素的含量可以達到2.3mg/L。實施例10
根據實施例3中所述的裝置，通過植物組織培養進行紫草中紫草素的獲得的方法，具體操作步驟同實施例9中所述，最終得到在更換下來的培養液中紫草素的含量可以達到
1.6mg/L。實施例11根據實施例4中所述的裝置，通過植物組織培養進行紫草中紫草素的獲得的方法，具體操作步驟同實施例9中所述，最終得到在更換下來的培養液中紫草素的含量可以達到4.2mg/L。實施例12
根據實施例1中所述的裝置，通過組織培養進行人參毛狀根中人參皂甙的獲得方法，具體操作步驟如下:
(I)人參毛狀根的批量獲得:
所述培養參數主要有:將人參毛狀根接種入實施例1中所述的裝置中，接種密度:120個/L，分開接種3層，每層40個，調整好培養基後進行培養。其中:培養基配方為:Ms+0.1mg/L IBA +30 g/L蔗糖；培養基pH:5.8 ;浸沒頻率:3min/4h。培養條件:光照強度2000lux，光照時間8 h/d，培養溫度25±1°C，培養時間:10do(2)植物次生代謝產物的誘導:利用可拆卸的設計方便更換培養液為:Ms+30 g/L蔗糖;培養基pH:5.8 ;浸沒頻率:10min/2h。培養條件:光照強度1000 lux，光照時間5 h/d，培養溫度25±1°C，培養時間:90d。(3)植物次生代謝產物的收集和提取:將人參毛狀根取出後按照中國人民藥典2010年版測定人參總皂甙以及人參皂甙Re+Rg的含量，經檢測所獲得的人參毛狀根中人參總皂甙含量可達到6.182%，人參皂甙Re+Rg的含量可達到0.3752%。實施例13
根據實施例2中所述的裝置，通過組織培養進行人參毛狀根中人參皂甙的獲得方法。具體操作步驟同實 施例12中所述，最終得到人參毛狀根中人參總皂甙含量可達到
4.8912%,人參皂甙Re+Rg的含量可達到0.2527%。實施例14
根據實施例3中所述的裝置，通過組織培養進行人參毛狀根中人參皂甙的獲得方法，具體操作步驟同實施例12中所述，最終得到人參毛狀根中人參總皂甙含量可達到6.532%，人參皂甙Re+Rg的含量可達到0.3852%。實施例15
根據實施例4中所述的裝置，通過組織培養進行人參毛狀根中人參皂甙的獲得方法，具體操作步驟同實施例12中所述，最終得到人參毛狀根中人參總皂甙含量可達到
4.6752%，人參皂甙Re+Rg的含量可達到0.2319%。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法，包括以下步驟: (1)植物體批量獲得:將植物體處理後接種入培養用反應器裝置中，進行培養參數設定後，進行規模化培養，根據需要進行下一步的操作，所述植物體是指無菌培養下獲得的植物細胞、植物組織、植物器官和叢生芽等狀態； (2)植物次生代謝產物產生及誘導:將獲得的植物體在一定的培養條件下生成或進行誘導以獲得需要的次生代謝產物； (3)植物次生代謝產物的收集和提取:根據次生代謝產物存在的部位，以及次生代謝產物的特性進行次生代謝產物的收集提取操作以獲得所需。
2.根據權利要求1所述的通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法，其特徵在於，所述步驟(I)中植物體處理的方法為:將滅菌後或無菌狀態的外植體接種至固體培養瓶或植物生物反應器培養裝置中，根據不同的植物及培養目的接種不同的外植體類型，所述培養用反應器裝置是利用間歇浸沒原理設計的植物生物反應器變型； 所述植物生物反應器裝置的培養因素主要有: 培養基:根據植物種類的不同進行不同培養基的確定及激素種類及濃度的選擇，包含現有的培養基類型及通過改良後的培養基類型； 培養基PH:用於培養擴繁的pH為植物適宜生長的範圍為5.(Γ7.0 ； 浸沒頻率:根據植物種類不同調整不同的浸沒頻率，lmin/24tT24h/24h ； 接種密度:3飛OO個/L ;或f200個/層，可以利用可拆卸的多層培養網架來進行植物體的多層培養，來提高培養密度和空間利用效率； 培養條件:光照強度100(T500001ux，光照時間5 20 h/d，培養溫度25±1°C ; 培養時間:培養時間依據不同植物生長狀態來確定，生長時間為l(T90d。
3.根據權利要求2所述的通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法，其特徵在於，所述培養基pH 5.5 6.5 ;所述浸沒頻率3min/18tr30min/3h ;所述光照強度150(T20001ux ;所述光照時間8 18 h/d，所述接種密度60 150個/L或20 50個/層，所述生長時間為2(T40d。
4.根據權利要求f3任一項所述的通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法，其特徵在於，所述規模化培養是通過培養用反應器裝置中的可拆卸的多層培養網架來實現的，所述多層培養網架是用耐高溫、耐腐蝕材料製作的拆卸網架，多層培養網架可以分別接種或同批次接種植物體。
5.根據權利要求f3任一項所述的通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法，其特徵在於，所述一定的培養條件包括創造合適的培養條件、逆境脅迫環境或添加誘導因子; 所述合適培養條件是針對不同的植物種類設定不同的適合其生長的因素，通過培養後即可獲得大量植物體特定部位的組織，從而從植物體中或從其分泌物中獲得所需次生代謝產物； 所述逆境脅迫環境指高溫、低溫、強光照、弱光照、機械刺激和輻射等環境因子等，通過逆境脅迫環境誘導使植物體內產生新的次生代謝產物或提高原有次生代謝產物的含量，或誘導使次生代謝產物分泌到細胞外或提高分泌效率；環境因子如合適的培養條件及逆境脅迫環境等的改變可以通過裝置外置的環境控制裝備來實現，如控溫裝置可以提高培養環境溫度、外置光照裝置可以調節培養環境的光照強度等來誘導前述步驟(I)中大量的植物體產生所需的次生代謝產物； 所述誘導因子指鹽分含量、化學物質、植物激素、前體物質等，通過誘導因子誘導使植物體內產生新的次生代謝產物或提高原有次生代謝產物的含量，或誘導使次生代謝產物分泌到細胞外或提高分泌效率；誘導因子的改變可以通過裝置中方便拆卸組裝的儲液罐結構，在更換培養液的同時將誘導因子如鹽、誘導前體物質或具有毒害作用的化學物質等添加到培養液中來實現，在添加後通過培養使前期得到的大量植物體在誘導因子的作用下產生所需的次生代謝產物。
6.根據權利要求f3任一項所述的通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中次生代謝產物存在的部位包括:一是存在植物體內的次生代謝產物；二是植物體分泌到細胞外的次生代謝產物；三是存在植物體內同時亦可分泌到胞外的次生代謝產物； 所述次生代謝產物的收集根據其所存在的部位採取不同的操作:當次生代謝產物存在植物體內時,將誘導後的多層培養網架上的植物體根據需要收穫部分植物體收集用於後續的提取操作，剩餘的部分可以繼續培養以持續的獲得所需的植物體； 當次生代謝產物分泌到植物細胞外時，此時次生代謝產物被衝刷到培養液中，此時只需要將裝置下部儲液罐中的培養液收集來進行提取操作；通過上部的植物體的持續培養同時控制培養的數量，從培養液中就可以持續的提取所需的次生代謝產物； 當次生代謝產物同時存在於植物體內及分泌到細胞外時，可結合上述兩種方法來進行操作，既可從植物體內提取又可從培養液中收集所需的次生代謝產物。
7.一種實現權利要求f 6的任一項所述的通過組織培養方法持續的獲得次生代謝產物的方法的培養用反應器裝置，其特徵在於，包括空氣除菌器(1)，所述空氣除菌器(I)通過第一連接管(2)安裝在反應器罐體蓋子(3);還包括有反應器培養罐體(4)，多層培養網架(6)放置入反應器培養罐體(4)內進行分層培養，所述多層培養網架(6)，為可以拆卸組裝的分層培養網架；第二連接管(5)與反應器培養罐體(4)相連，其長度可接觸到儲液罐(8)的底部，所述儲液罐(8)上端還設有儲液罐蓋子(7);還包括有與反應器培養罐體(4)相連的充氣泵(9)和時控器(10)； 所述多層培養網架(6)各網架之間利用可組裝拆卸支柱支撐，可根據培養目的調整網架的層數，網架層數為2 10層；網架間距為0.25^25.0cm ； 所述儲液罐(8)的上部具有螺紋或其他方式可與反應器培養罐體(4)下部密封結合； 該裝置主體直徑為5 50cm ;裝置主體高度l(T50cm。
8.根據權利要求6所述的培養用反應器裝置，其特徵在於，網架層數為3飛層；網架間距為，3.(TlOcm ;裝置主體直徑為l(T30cm ;裝置主體高度2(T40cm。
9.根據權利要求7或8所述的培養用反應器裝置，其特徵在於，該裝置還設有輔助裝置。
全文摘要
本發明公開了一種通過組織培養持續獲得植物次生代謝產物的方法，該方法的步驟包括(1)植物體批量獲得；(2)植物次生代謝產物的產生及誘導和(3)植物次生代謝產物的收集和提取。本發明還涉及一種培養用反應器裝置，該裝置上部採用植物組織器官的分層培養設計，可以方便地通過多層培養網架的設計分階段進行培養物的採收操作；裝置下部採用分體式設計，其儲液罐可以方便拆卸，通過收集培養液以獲得所需產物，並且可通過培養液的更換減少次生代謝產物濃度對其繼續產生的抑制，從而保證持續獲得次生代謝產物。本發明具有通量大、操作方便、成本低的優點。
文檔編號A01H4/00GK103120124SQ20131004311
公開日2013年5月29日 申請日期2013年2月4日 優先權日2013年2月4日
發明者陳集雙, 賈明良, 張本厚, 歐陽平凱, 金磊磊 申請人:南京工業大學