Pnzip啟動子的序列及其克隆與應用的製作方法

2023-05-24 15:30:16

專利名稱：Pnzip啟動子的序列及其克隆與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及短日照植物裂葉牽牛PNZIP啟動子的序列和應用，屬於分子生物學和生物
背景技術：
組成型啟動子如CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子和Ubiquitin(泛素)啟動子，在轉基因植物的研究中得到了大量運用。由於組成型啟動子不能從時間和空間上有效地調控目的基因的表達，在作物的遺傳改良中存在一定的缺陷。如利用組成型啟動子表達病毒衣殼蛋白，就可能會引起病毒衣殼轉移，從而導致植物病毒新株系的產生。因此，尋找專一性啟動子，使外源基因特異地表達已成為植物基因工程的關鍵環節。
組織特異啟動子作為一類專一性啟動子，能指導外源基因在植物發育過程中某一特定時空表達，它不僅能使目的基因的表達產物在一定空間積累，增加區域表達量，而且也避免了植物營養的浪費。因此，組織特異啟動子如種子、果實等特異表達啟動子，已成為轉基因研究中最有發展前景的外源基因的啟動元件。
葉片是植物的光合器官，也是主要的營養器官，許多情況下，人們只希望某些重要功能基因在葉片中特異表達。PNZIP是我們從短日照植物裂葉牽牛中分離出來的一個基因，編碼一種含有亮氨酸拉鏈的蛋白質，原位雜交發現該基因在葉肉中效表達，而在非光合組織中不表達。處於生產實踐和理論研究的迫切需要，本發明人分離了PNZIP啟動子，研究發現PNZIP啟動子是一個光合組織特異高效表達啟動子，可作為一種高效特異啟動子用於我國植物基因工程的產業化開發和利用。

發明內容本發明人首次從裂葉牽牛基因組中分離出PNZIP啟動子，該啟動子的序列如下序列表(1)SEQ ID的信息(a)序列特徵*長度1558鹼基對
*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型基因組DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源裂葉牽牛(f)序列描述SEQ IN1 acatggggat gaggcagggt atgagtgctt tgcttttttt ttttggttaa aattttttcc61 tccaggttga gatcctctct cagattcgaa ttgagtaatt gctatgcatt atacctacac121 tcagcctttc gatgagttgt ctcgggggtt ttgcagtttg atacatggat tgatggagta181 ttaagatgtt tgtttatgga gataaaagtg ttgagcattc atatttgttg gatttggctc241 attagtaatg tgaaggagag gacacaactt tgttgaaaat acaacattgt tatatatggc301 accaaacaat ttctagtata gggataacct tagtcaagtt aattaggttg ttgatttaat361 aactataagg aatgatcaat tgacctttat ggtttgagcc gagaaatact cttgaagata421 caagatcaac tacagaaaat tacttgtgtc aggcaaaata actcttgaaa tattattcta481 ttattgtacc cccaattatt tcattataaa tcccattaat tctcattatt ttatcagtat541 tctaccatca aacttgactc tccattattt caccataaat agccattgtc caccctcaaa601 tagtcattaa tataatctac catgaatgtc ttgccatgaa tactatgtcc tctaccacta661 taaaaagact ctacaaccaa caagggagga gaccaagctc tatagctcta cttcaagcta721 ctcaagttcg agaatagtat ttctacaaat tctatacact ccacagactc tatgaattat781 tcctagcttg agtgcaacaa cgtacatgca tctccacact tcaaaacata gtgaaattca841 atttgattca tcttaaaaat gcatgtaatt tttgttttta cttcaatttt cacattaaac901 cccttgtttc ttgtcctata catatgactc tagaactaac atgcgcaata agagaattat961 gtgggaaata aattgtaatt ccgtgaggaa agaataaagg tgaatgttac aaatttaaga1021 ttgctgagct aaactgcatc agcattggtg ttccttccat ttactccacg attatcttat1081 cagctttgga ttggtaaaga atctgcaact ccagattcta cccaagttaa agatactata1141 ctactactga atattgtcac tgtgcaatgc tataaagatt tttattatat tgtgaagaag1201 attaagtata gattgtgtac caataacatt gtgaaacgta ccatgaacaa catcagccac1261 aaaatacaca aaatgaccat gtaatcaagc tggcctgtca cagtatgcca cgtgtcagac1321 caatatttaa tcccatggat ttctttggat gagatgatac tccatcactt tcatccaatt1381 atatatcctc tccagcaccc atagcttcac agtacactct acccagaaaa aaaaatggca1441 gcagaaatgg cattggtaag gcccatatcg aagttcggcg ccaccgccaa atcgaattcc1501 cgcggccgcc actccgcggc tgagcggcag gcggaaactg gcacccttaa gcgtgaga將該啟動子的1～1420bp替換表達載體pBI121中的CaMV 35S啟動子，利用農桿菌侵染法轉化菸草和水稻。GUS(β-葡糖苷酸酶)活性定量檢測表明(1)PNZIP啟動子在葉片中的活性比CaMV 35S啟動子高9倍，而在菸草的根部則檢測不到GUS活性。(2)在轉基因水稻中，PNZIP啟動子在水稻葉片中的活性比35S啟動子高6倍，而在水稻的花和根部則檢測不到GUS活性。因此，PNZIP啟動子是一個高效特異表達啟動子，可以作為一種高效特異啟動子用於我國植物基因工程的產業化開發，具有非常重要的經濟效益和社會效益。


圖1是含有PNZIP啟動子轉基因菸草根、莖、葉和花的GUS活性測定結果柱狀圖。
橫坐標表示植株的部位，縱坐標表示GUS活性。
圖2是含有PNZIP啟動子轉基因菸草葉片的GUS活性與含有35S啟動子轉基因菸草葉片的GUS活性測定結果柱狀圖。
圖3是含有PNZIP啟動子轉基因水稻根、莖、葉和花的GUS活性測定結果柱狀圖。
圖4是含有PNZIP啟動子轉基因水稻葉片的GUS活性與含有35S啟動子轉基因菸草葉片的GUS活性測定結果柱狀圖。
橫坐標表示植株的部位，縱坐標表示GUS活性。
橫坐標表示植株的類群，縱坐標GUS活性。
(五)具體發明實施方式實施例1PNZIP啟動子的克隆方法1.基因組DNA的提取採用經典的CTAB法提取裂葉牽牛的基因組DNA。
2.裂葉牽牛的基因組DNA的充分酶解取5微升基因組DNA(1μg/μl)，加入10×H反應緩衝液4μl，ddH2O 28μl，SalI內切酶3μl(1000u/μl)，37℃過夜酶解。
3.酶解產物的純化將酶切產物加入560μl的TE，讓後加入600μl等體積的苯酚/氯仿，混勻，12000rpm離心10分鐘。將500μl上清轉移到另一個新的1.5毫升的離心管中，加入500μl的氯仿，混勻，12000rpm離心10分鐘。小心吸取400μl上清並將其轉移到新的1.5毫升的離心管中，加入40μl的3M的NaAc，800μl的無水乙醇，混勻，-20℃靜置1個小時。12000rpm離心10分鐘，棄上清，並用70％的酒精洗沉澱兩次，室溫乾燥沉澱，並將沉澱溶解與10μl ddH2O中。
4.酶解產物與相應接頭的連接在新的離心管中加入5.5微升的酶切純化的DNA溶液，2.5微升的Hind III接頭，1微升的10×的T4DNA連接酶buffer，1微升的T4DNA連接酶，混勻，16℃連接過夜。反應結束後，用無水乙醇沉澱回收DNA，將沉澱溶解於30微升的無菌ddH2O中。
5.利用接頭聚合酶鏈式反應(PCR)擴增PNZIP啟動子取2微升連接產物作為模板，以引物A1(5′-CTGCGACGTGGTGGCCCTCGACAT-3′)和AP1(5′-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGT-3′)為引物，進行常規聚合酶鏈式反應(PCR)。將得到的PCR產物稀釋30倍，分別取2μl作為模板，以引物A2(5′-GGTGGCGCTCGACATTCTCAC-3′)和AP2(5′-CGTTAGAACGCGTAATACGACTC-3′)為引物，進行第二次PCR擴增。具體的試劑和條件如下試劑與條件如下第一次PCR所需試劑和條件為10×反應緩衝液5μl25mM MgCl24μl10mM脫氧核苷酸混合物(dNTP)1μlA1(10μM) 2μlAP1(10μM)2μl模板 2μlTaq DNA聚合酶 0.5μl總體積50μlPCR反應條件為94℃5分鐘，然後進入下列循環94℃2分鐘，55℃1分鐘72℃2分鐘，共30個循環，最後72℃延伸5分鐘。
第二次PCR所需試劑和條件為10×反應緩衝液5μl25mM MgCl24μl10mM脫氧核苷酸混合物(dNTP)1μlA2(10μM) 2μlAP2(10μM)2μl模板 1μlTaq DNA聚合酶 0.5μl總體積50μlPCR反應條件為94℃5分鐘，然後進入下列循環94℃2分鐘，58℃1分鐘72℃2分鐘，共30個循環，最後72℃延伸5分鐘。
6.片段的克隆取2μl二次PCR產物與pGEM-T easy載體進行連接，操作步驟按Promega公司產品pGEM-T easy Vector system說明書進行。然後連接產物轉化大腸桿菌DH5α菌株，在表面塗有5-溴-4-氯-3-吲哚-(-D-半乳糖苷)和X-gal的含氨苄青黴素(100微克/毫升)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
7.質粒DNA的提取鹼法提取質粒DNA。
8.序列測定本工作在上海生工生物工程技術服務有限公司進行。
實施例2PNZIP啟動子的序列，序列如下(1)SEQ ID NO的信息(a)序列特徵*長度1558鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型基因組DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源裂葉牽牛(f)序列描述SEQ IN NO1 acatggggat gaggcagggt atgagtgctt tgcttttttt ttttggttaa aattttttcc61 tccaggttga gatcctctct cagattcgaa ttgagtaatt gctatgcatt atacctacac121 tcagcctttc gatgagttgt ctcgggggtt ttgcagtttg atacatggat tgatggagta181 ttaagatgtt tgtttatgga gataaaagtg ttgagcattc atatttgttg gatttggctc241 attagtaatg tgaaggagag gacacaactt tgttgaaaat acaacattgt tatatatggc301 accaaacaat ttctagtata gggataacct tagtcaagtt aattaggttg ttgatttaat361 aactataagg aatgatcaat tgacctttat ggtttgagcc gagaaatact cttgaagata421 caagatcaac tacagaaaat tacttgtgtc aggcaaaata actcttgaaa tattattcta481 ttattgtacc cccaattatt tcattataaa tcccattaat tctcattatt ttatcagtat541 tctaccatca aacttgactc tccattattt caccataaat agccattgtc caccctcaaa601 tagtcattaa tataatctac catgaatgtc ttgccatgaa tactatgtcc tctaccacta661 taaaaagact ctacaaccaa caagggagga gaccaagctc tatagctcta cttcaagcta721 ctcaagttcg agaatagtat ttctacaaat tctatacact ccacagactc tatgaattat781 tcctagcttg agtgcaacaa cgtacatgca tctccacact tcaaaacata gtgaaattca841 atttgattca tcttaaaaat gcatgtaatt tttgttttta cttcaatttt cacattaaac901 cccttgtttc ttgtcctata catatgactc tagaactaac atgcgcaata agagaattat961 gtgggaaata aattgtaatt ccgtgaggaa agaataaagg tgaatgttac aaatttaaga1021 ttgctgagct aaactgcatc agcattggtg ttccttccat ttactccacg attatcttat1081 cagctttgga ttggtaaaga atctgcaact ccagattcta cccaagttaa agatactata1141 ctactactga atattgtcac tgtgcaatgc tataaagatt tttattatat tgtgaagaag1201 attaagtata gattgtgtac caataacatt gtgaaacgta ccatgaacaa catcagccac
1261 aaaatacaca aaatgaccat gtaatcaagc tggcctgtca cagtatgcca cgtgtcagac1321 caatatttaa tcccatggat ttctttggat gagatgatac tccatcactt tcatccaatt1381 atatatcctc tccagcaccc atagcttcac agtacactct acccagaaaa aaaaatggca1441 gcagaaatgg cattggtaag gcccatatcg aagttcggcg ccaccgccaa atcgaattcc1501 cgcggccgcc actccgcggc tgagcggcag gcggaaactg gcacccttaa gcgtgaga實施例3表達載體的構建1.根據上述序列，設計構建植物表達載體的引物正向引物5′-AAGCTTACATGGGGATGAGGCAGGGT-3′(帶有Hind III酶切位點)反向引物5′-GGATCCGGGTAGAGTGTACTGT-3′(帶有BamHI酶切位點)以含有PNZIP啟動子的質粒DNA為模板，進行聚合酶鏈式反應。
2.取2μl PCR與pGEM-Teasy載體進行連接，操作步驟按Promega公司產品pGEM-Teasy載體說明書進行。然後轉化大腸桿菌DH5α菌株，在表面塗5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青黴素(100微克/毫升)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。鹼法提取質粒DNA，進行序列測定。
3.用Hind III和BamHI兩個限制性內切酶將啟動子從pGEM-Teasy載體上切下，與相同酶酶切的pBI121連接。連接產物轉化DH5α細胞，然後在含卡那青黴素的LB固體平板上培養，對菌落進行PCR鑑定和質粒DNA的酶切分析，將陽性克隆命名為PBI-PNZIP。
4.將構建好的表達載體PBI-PNZIP轉化農桿菌EHA105。
實施例4含有PNZIP啟動子轉基因菸草的再生1.種植組培苗無菌菸草。
2.挑取鑑定好的農桿菌單菌落於含50毫克/升卡那黴素的LB液體培養基中，28℃振蕩培養。
3.3000rpm離心5分鐘，農桿菌沉澱用MS液體培養基懸浮。
4.將菸草葉片切成小塊，放入上述懸浮液浸泡10分鐘。
5.侵染後的葉片切塊置於分化培養基(1×MS鹽，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉膠，)上共培養2天，6.然後轉入選擇培養基(1×MS鹽，，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉膠，卡那黴素100毫克/升，卡那黴素100mg/L，頭孢青黴素250毫克/升)篩選，得到抗性芽。
7.切去抗性芽，然後將芽轉移到生根培養基(1×MS鹽，，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉膠，卡那黴素50毫克/升，卡那黴素100mg/L，頭孢青黴素250毫克/升)，直至長出小植株。
實施例5含有PNZIP啟動子轉基因水稻的再生1.去殼的成熟種子用10％的次氯酸鈉消毒十分鐘，然後用無菌水衝洗5次。
2.將水稻種子置於N6D2的培養基中誘導愈傷組織，20天後將成熟盾片處長出的愈傷組織繼代於N6D2的培養基中。
3.在農桿菌侵染前將愈傷組織轉移到新鮮的N6D2的培養基中培養4天。
4.挑取鑑定好的農桿菌單菌落於含50毫克/升卡那黴素的LB液體培養基中，28℃振蕩培養。
5.3000rpm離心5分鐘，農桿菌沉澱用N6D2的液體培養基懸浮。
6.將預培養的愈傷組織用農桿菌侵染20分鐘。
7.用無菌濾紙洗去多餘的農桿菌液，讓後置於N6D2培養基中，26℃，黑暗，共培養3天。
8.將共培養後的愈傷用含有250mg/L的頭孢黴素的N6D2液體培養基中，洗滌8次，再用無菌水洗幹。
9.將愈傷組織轉移到N6D2CH固體篩選培養基中，26℃，暗培養，每2周換一次培養基。
10.將反覆篩選獲得的抗性組織轉移到N6D2CH+S高滲培養基中，26℃，暗培養2周。
11.將抗性組織轉移到MSR分化培養基中，26℃，暗培養1周，再轉為26℃，光16小時/暗8小時培養。
12.將再生的芽轉到新鮮的MS培養基中，直至長出小植株。
實施例6PNZIP啟動子的活性檢測1.分別稱取各類轉基因植株葉片、根、莖和花各100mg，加入500μL提取緩衝液(50mmol/L磷酸鈉pH7.0，10mmol EDTA，0.1％Triton X-100，10mmol/L的β-巰基乙醇)在研缽中研成勻漿。
2.4000×g離心10分鐘，收集上清液。
3.在1ml預熱的反應緩衝液中(提取液中加入1mmol/L MUG)加入20μL上清，混勻，於37℃下反應15分鐘後取出100μL加入到900μL反應終止液中終止反應。
4.用日立-850型螢光分光光度計測定各樣品Ex365/Em455值。
5.取上清20μL，用水定容至4ml，加入1ml考馬斯亮藍溶液，測定595nm光吸收值。
6.用4-甲基傘形酮(4-MU)的皮摩爾數與蛋白質含量及時間的比值(4-MU pmolMU/mg蛋白/min)表示GUS活性。
序列表110山東農業大學120PNZIP啟動子的序列及其克隆與應用140
141
1601170patent In 3.121012112485212genomic DNA213Ipomoea nil2211-155840011 acatggggat gaggcagggt atgagtgctt tgcttttttt ttttggttaa aattttttcc61 tccaggttga gatcctctct cagattcgaa ttgagtaatt gctatgcatt atacctacac121 tcagcctttc gatgagttgt ctcgggggtt ttgcagtttg atacatggat tgatggagta181 ttaagatgtt tgtttatgga gataaaagtg ttgagcattc atatttgttg gatttggctc241 attagtaatg tgaaggagag gacacaactt tgttgaaaat acaacattgt tatatatggc301 accaaacaat ttctagtata gggataacct tagtcaagtt aattaggttg ttgatttaat361 aactataagg aatgatcaat tgacctttat ggtttgagcc gagaaatact cttgaagata421 caagatcaac tacagaaaat tacttgtgtc aggcaaaata actcttgaaa tattattcta481 ttattgtacc cccaattatt tcattataaa tcccattaat tctcattatt ttatcagtat541 tctaccatca aacttgactc tccattattt caccataaat agccattgtc caccctcaaa601 tagtcattaa tataatctac catgaatgtc ttgccatgaa tactatgtcc tctaccacta661 taaaaagact ctacaaccaa caagggagga gaccaagctc tatagctcta cttcaagcta721 ctcaagttcg agaatagtat ttctacaaat tctatacact ccacagactc tatgaattat781 tcctagcttg agtgcaacaa cgtacatgca tctccacact tcaaaacata gtgaaattca841 atttgattca tcttaaaaat gcatgtaatt tttgttttta cttcaatttt cacattaaac901 cccttgtttc ttgtcctata catatgactc tagaactaac atgcgcaata agagaattat961 gtgggaaata aattgtaatt ccgtgaggaa agaataaagg tgaatgttac aaatttaaga1021 ttgctgagct aaactgcatc agcattggtg ttccttccat ttactccacg attatcttat1081 cagctttgga ttggtaaaga atctgcaact ccagattcta cccaagttaa agatactata1141 ctactactga atattgtcac tgtgcaatgc tataaagatt tttattatat tgtgaagaag1201 attaagtata gattgtgtac caataacatt gtgaaacgta ccatgaacaa catcagccac1261 aaaatacaca aaatgaccat gtaatcaagc tggcctgtca cagtatgcca cgtgtcagac1321 caatatttaa tcccatggat ttctttggat gagatgatac tccatcactt tcatccaatt1381 atatatcctc tccagcaccc atagcttcac agtacactct acccagaaaa aaaaatggca1441 gcagaaatgg cattggtaag gcccatatcg aagttcggcg ccaccgccaa atcgaattcc1501 cgcggccgcc actccgcggc tgagcggcag gcggaaactg gcacccttaa gcgtgaga
權利要求
1.一個克隆的裂葉牽牛PNZIP啟動子基因，其特徵在於具有下述所示的核甘酸序列1 acatggggat gaggcagggt atgagtgctt tgcttttttt ttttggttaa aattttttcc61 tccaggttga gatcctctct cagattcgaa ttgagtaatt gctatgcatt atacctacac121 tcagcctttc gatgagttgt ctcgggggtt ttgcagtttg atacatggat tgatggagta181 ttaagatgtt tgtttatgga gataaaagtg ttgagcattc atatttgttg gatttggctc241 attagtaatg tgaaggagag gacacaactt tgttgaaaat acaacattgt tatatatggc301 accaaacaat ttctagtata gggataacct tagtcaagtt aattaggttg ttgatttaat361 aactataagg aatgatcaat tgacctttat ggtttgagcc gagaaatact cttgaagata421 caagatcaac tacagaaaat tacttgtgtc aggcaaaata actcttgaaa tattattcta481 ttattgtacc cccaattatt tcattataaa tcccattaat tctcattatt ttatcagtat541 tctaccatca aacttgactc tccattattt caccataaat agccattgtc caccctcaaa601 tagtcattaa tataatctac catgaatgtc ttgccatgaa tactatgtcc tctaccacta661 taaaaagact ctacaaccaa caagggagga gaccaagctc tatagctcta cttcaagcta721 ctcaagttcg agaatagtat ttctacaaat tctatacact ccacagactc tatgaattat781 tcctagcttg agtgcaacaa cgtacatgca tctccacact tcaaaacata gtgaaattca841 atttgattca tcttaaaaat gcatgtaatt tttgttttta cttcaatttt cacattaaac901 cccttgtttc ttgtcctata catatgactc tagaactaac atgcgcaata agagaattat961 gtgggaaata aattgtaatt ccgtgaggaa agaataaagg tgaatgttac aaatttaaga1021 ttgctgagct aaactgcatc agcattggtg ttccttccat ttactccacg attatcttat1081 cagctttgga ttggtaaaga atctgcaact ccagattcta cccaagttaa agatactata1141 ctactactga atattgtcac tgtgcaatgc tataaagatt tttattatat tgtgaagaag1201 attaagtata gattgtgtac caataacatt gtgaaacgta ccatgaacaa catcagccac1261 aaaatacaca aaatgaccat gtaatcaagc tggcctgtca cagtatgcca cgtgtcagac1321 caatatttaa tcccatggat ttctttggat gagatgatac tccatcactt tcatccaatt1381 atatatcctc tccagcaccc atagcttcac agtacactct acccagaaaa aaaaatggca1441 gcagaaatgg cattggtaag gcccatatcg aagttcggcg ccaccgccaa atcgaattcc1501 cgcggccgcc actccgcggc tgagcggcag gcggaaactg gcacccttaa gcgtgaga 。
2.根據權利要求1所述的一個克隆的裂葉牽牛PNZIP啟動子基因，其特徵在於作為一個高效特異啟動子轉入菸草和水稻，表現出顯著的轉基因效果，可以用於我國植物基因工程的產業化開發。
全文摘要
本發明涉及裂葉牽牛PNZIP啟動子的序列和應用，屬於分子生物學和生物技術領域。從短日照植物裂葉牽牛的葉片中提取基因組DNA，利用接頭聚合酶鏈式反應技術得到1558bp的DNA序列。將該序列的1～1420bp定向替換表達載體pBI121中的35S啟動子，得到的表達載體PBI－PNZIP，將PBI－PNZIP和pBI121分別轉化菸草和水稻。轉基因菸草的GUS活性分析表明PNZIP啟動子在葉片中的活性比35S啟動子高9倍，而在菸草的花和根部則檢測不到GUS活性。在轉基因水稻中，PNZIP啟動子在水稻葉片中的活性比35S啟動子高6倍，而在水稻的花和根部則檢測不到GUS活性。因此，該啟動子是一個重要的光合組織特異表達啟動子，可以作為一種高效特異啟動子用於植物基因工程的產業化開發，具有重要的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12N15/67GK1789422SQ20051010430
公開日2006年6月21日 申請日期2005年10月14日 優先權日2005年10月14日
發明者鄭成超, 楊予濤, 楊國棟, 吳長艾 申請人:山東農業大學