ATP1A1靶向多肽及應用的製作方法

2023-05-24 04:18:01 3

本發明涉及一種靶向多肽，特別涉及一種atp1a1靶向多肽及其應用。
背景技術：
：腫瘤靶向製劑一般是多肽，一般通過與腫瘤血管或者腫瘤細胞表面分子特異性結合，在腫瘤血管或者腫瘤細胞中富集。腫瘤靶向多肽在腫瘤分子診斷和靶向治療中具有重要的應用價值。腫瘤靶向多肽一方面可以通過與分子成像試劑偶聯，應用於腫瘤分子成像；另一方面可以通過與抗腫瘤藥物偶聯，應用於腫瘤靶向治療。例如美國科學院院士ruoslahtierrki教授發現一類含rgd基序的腫瘤靶向多肽，這類腫瘤靶向多肽結合靶點是腫瘤新生血管中的整合素av。根據ruoslahtierrki教授的研究成果，目前許多含rgd基序的腫瘤靶向多肽，已經進入各期臨床實驗中，其中部分已經取得了良好的效果。腫瘤靶向多肽通過與各類分子成像試劑偶聯，可應用於光學成像、pet、spect和mri。腫瘤分子成像對腫瘤細胞在分子水平上進行定位，對腫瘤早期確診，殘留灶和轉移灶追蹤意義重大。現已有針對her2，epha2，mmp-9等多種腫瘤標誌的靶向多肽用於腫瘤模型成像。影像學檢查是一種有效的腫瘤診斷方法，然而，現有的影像學檢查只能在組織解析度上區分正常組織和腫瘤組織，難以在分子水平上精確辨別惡性腫瘤組織和良性增生。atp1a1在食管癌，乳腺癌，黑色素瘤，肝癌中均有高表達。目前以atp1a1為靶點的多肽腫瘤分子成像，目前尚無報導。atp1a1靶向多肽不僅可以用於檢測腫瘤病人atp1a1表達情況，提示腫瘤的分期，評估atp1a1靶向治療藥物的治療效果；而且可以用於腫瘤微小轉移灶的追蹤。開發出atp1a1靶向肽具有非常實際的意義。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種atp1a1靶向多肽及其應用。本發明所採取的技術方案是：atp1a1靶向多肽，其基序為sisslth，基序的c端和/或n端可選連接有1～3個胺基酸。作為上述atp1a1靶向多肽的進一步改進，多肽通過其末端胺基酸成環。作為上述atp1a1靶向多肽的進一步改進，多肽的基序兩端分別連接有一個cys。進一步的，多肽通過基序兩端cys形成環肽。一種腫瘤靶向治療製劑，包括對腫瘤具有治療作用的活性分子，活性分子上偶聯有上述的atp1a1靶向多肽。作為上述腫瘤靶向治療製劑的進一步改進，活性分子為腫瘤化療藥物。一種腫瘤診斷試劑，包括顯像基團，顯像基團上偶聯有上述的atp1a1靶向多肽。作為上述腫瘤診斷試劑的進一步改進，顯像基團為放射性核素、螢光基團。特別的，顯像基團選自99mte、18f、螢光基團cy5。本發明的有益效果是：本發明的多肽具有很好的靶向性，與atp1a1的結合力高。將本發明的多肽與分子標記偶聯，可以很好地結合在腫瘤細胞上，可以很好地應用於腫瘤的篩查、診斷。將本發明的多肽與藥物分子偶聯，可以起到靶向治療的效果。附圖說明圖1是腫瘤靶向性實驗結果；圖2是荷瘤老鼠紅外螢光分子成像；圖3是荷瘤老鼠spect分子成像。具體實施方式一種腫瘤靶向製劑，偶聯有上述的任一種atp1a1靶向多肽。在該製劑中，多肽起到靶向作用，與其偶聯的起效分子可以是診斷試劑，也可以是用於治療的藥物，如腫瘤殺傷肽、化療用小分子藥物等。為了使起效分子可以很好地偶聯在多肽上，可以使用本領域常用的偶聯基團。為了保證靶向效果，偶聯的位點選擇在基序外或基序上的非結合位點。上述atp1a1靶向多肽可以由左旋或右旋胺基酸組成。下述實驗中所使用的肽如下肽名稱序列(斜體的兩個c環化)seqidno：s3csisslthc1concgggggggc2biotin-s3biotin-csisslthcbiotin-cbiotin-cgggggggccy5-s3cy5-csisslthccy5-ccy5-cgggggggcfitc-s3csisslthc-gggs-fitc3fitc-ccgggggggc-gggs-fitc4hynic-s3hynic-csisslthchynic-chynic-cgggggggc數據分析：計數結果應用統計軟體spss16.0進行分析，採用levene法對各組計數結果進行方差齊性檢驗。如果各組方差齊性(p>0.05時，方差齊性)，然後採用獨立樣本t檢驗，分析組間是否有顯著差異(p<0.05時，有顯著差異)。腫瘤靶向性實驗應用酶聯免疫吸附實驗，檢測s3phage與乳腺癌細胞mda-mb-231的結合情況，然後檢測s3肽是否可以阻斷s3肽與乳腺癌細胞mda-mb-231的結合。具體操作如下：1)計數噬菌體滴度，待用；2)胰酶消化細胞，計數，均勻鋪細胞在96孔板中，1×104/孔；3)阻斷實驗時加入5,10,20ug/ul的s3多肽，37℃孵育1個小時；4)靶向實驗加入有濃度梯度的噬菌體1.0×109，2.0×109，4.0×109，8.0×109，1.6×109,3.2×109pfu/孔，37℃孵育結合2小時；阻斷實驗加入20ug/ul的biotin-s3多肽；5)將細胞上孵育液棄掉；6)4%多聚甲醛固定10分鐘；7)0.1%pbst洗5次，270ul/孔；8)0.1%triton破膜5分鐘，270ul/孔pbst洗一次；9)5%bsa封閉30分鐘；10)1:1000稀釋anti-m13conjuctedhrp50ul/孔，室溫孵育1個小時；11)0.1%pbst洗5次；12)tmb試劑盒顯色；13)酶標儀od450nm下讀數。應用流式細胞分析術，檢測fitc-s3螢光肽與乳腺癌細胞mda-mb-231的結合情況。發明人首先合成35肽和con肽與螢光染料fitc偶聯的螢光肽，然後將fitc-s3螢光肽與細胞孵育，最後通過流式細胞分析來檢測其結合情況。具體實驗步驟如下：1)胰酶消化細胞，計數，調整濃度為1.0×106個/管，100μl無血清1640重懸細胞；2)加入pbs溶解的fitc-c或者fitc-35，濃度10μm，細胞在冰上孵育結合20分鐘；3)0.1%pbst衝洗3次，1ml/次，400g，離心5分鐘；4)500ulpbs重懸細胞；5)流式細胞儀檢測。應用雷射共聚焦顯微鏡，檢測biotin-c，biotin-s3多肽與人乳腺癌細胞mda-mb-231結合情況，同時發明人比較了上述多肽與人正常乳腺細胞mcf-10a。具體實驗步驟如下：1)胰酶消化細胞，將細胞鋪在放有玻片的24孔板上，1×105/孔；2)biotin-c，biotin-s3多肽加入到細胞中，200ug/孔，37℃孵育2個小時；3)細胞上孵育液棄掉；4)4%多聚甲醛固定10分鐘；5)0.1%pbst洗5次，500ul/孔，將未結合的多肽洗掉；6)0.1%triton破膜5分鐘，500ul/孔pbst洗一次；7)5%bsa封閉30分鐘；8)anti-biotinstreptavidin1:1000加入到孔板中，4℃孵育12個小時；9)0.1%pbst洗3次，5分鐘/次；10)anti-streptavidinconjuctedfitc1:1000加入到孔板中，室溫孵育45分鐘；11)0.1%pbst洗3次，5分鐘/次；12)wga1:1000染細胞膜，室溫孵育10分鐘；13)0.1%pbst洗3次，5分鐘/次；14)dapi1:3000染細胞核，室溫孵育5分鐘；15)0.1%pbst洗3次，5分鐘/次；16)anti-fade封片。實驗結果如圖1所示，噬菌體結合實驗表明，在37℃條件下，s3噬菌體與乳腺癌細胞mda-mb-231的結合能力，均比對照噬菌體的結合能力強，隨著噬菌體滴度的增加而增強（圖1a）；多肽阻斷實驗表明，s3多肽可以阻斷biotin-s3多肽與乳腺癌細胞mda-mb-21的結合，阻斷效應具有濃度依賴性（圖1b）；流式細胞分析術結果表明，fitc-s3螢光肽與乳腺癌細胞mda-mb-231的結合能力比fitc-control螢光肽強（圖1c）。免疫螢光顯示，biotin-s3多肽可結合到細胞膜表面（圖1d）。綜上說明與正常乳腺細胞mcf-10a相比，s3肽具有明顯的乳腺癌細胞靶向性。腫瘤紅外螢光分子成像應用荷瘤小鼠腫瘤紅外螢光分子成像實驗方法，檢測cy5-s3螢光肽在荷瘤小鼠各個臟器和腫瘤中分布情況。小動物活體成像實驗操作方法如下：1)取9隻4周齡雄性nodscid老鼠；2)胰酶消化乳腺癌mda-mb-231細胞，計數，調整濃度為5.0×107個/ml，20%matrigeldmem重懸，200μl/只鼠，注射；3)1-2周觀察腫瘤形成情況，測量腫瘤大小，根據腫瘤大小將其隨機化分3組，分別為pbs組，對照肽cy5-c組以及cy5-s3組，每組3隻小鼠；4)200µlpbs溶解300µg螢光肽，尾靜脈注射螢光肽，小動物活體動物成像儀動態檢測螢光肽在裸鼠各個臟器和腫瘤中的分布情況；5)取各個臟器和腫瘤，勻漿，測各個臟器和腫瘤的螢光強度，統計分析。為了檢測cy5-s3螢光肽是否可以在其它腫瘤的紅外螢光分子成像，按照上述方法，將其應用食管癌kyse30荷瘤和鼻咽癌cne2老鼠動物模型中。實驗結果如圖2顯示：尾靜脈注射48小時後，對老鼠進行紅外成像，在腫瘤中cy5-s3螢光肽明顯富集，在其他臟器幾乎無螢光肽富集（圖2a）；解剖老鼠取組織分析，cy5-s3螢光肽在腫瘤明顯富集，其他臟器無富集（圖2b）；尾靜脈注射48小時後，cy5-s3螢光肽在腫瘤中的單位重量肽含量明顯大於其他臟器（圖2c）。此外，尾靜脈注射48小時後，cy5-s3螢光肽也可以用於食管癌（圖2d、e）和鼻咽癌(圖2f)紅外螢光分子成像。該結果證明s3肽也可以應用於多種腫瘤模型（乳腺癌、食管癌、鼻咽癌）的活體分子成像中。腫瘤spect分子成像實驗將hynic修飾後35肽標記99mtc，應用於荷瘤小鼠spect成像中。實驗方法如下：1)100µledda/tricine溶液(20mg/mltricine，10mg/mledda，ph7)溶解100µghynic-35多肽；2)加入20µltin(ii)溶液(10mgsncl2•2h2o溶解於10ml0.1nhcl)；3)加入1ml99mtco4(800mbq)溶液；4)100℃加熱10分鐘，冷卻至室溫；5)100µl/只尾靜脈注射於荷瘤裸鼠中；6)分別在注射後0.5小時，1小時，2小時spect檢測hynic-s3肽分布情況。spect實驗結果顯示，注射後1小時以後，hynic-s3肽主要分布於腫瘤和腎臟中（圖3a和c），小鼠腫瘤部位已用小動物ct成像（圖3b）。該結果證明hynic-s3肽可以應用腫瘤spect成像。顯然的，本發明的arp1a1靶向多肽可以很好地用於腫瘤的診斷和靶向治療，特別是腫瘤的分子成像。sequencelisting中山大學腫瘤防治中心atp1a1靶向多肽及應用4patentinversion3.519prt人工多肽1cysserileserserleuthrhiscys1529prt人工多肽2cysglyglyglyglyglyglyglycys15313prt人工多肽3cysserileserserleuthrhiscysglyglyglyser1510413prt人工多肽4cysglyglyglyglyglyglyglycysglyglyglyser1510當前第1頁12