從紅豆杉細胞培養液中製備高純度紫杉醇的方法
2023-05-24 15:56:31 2
從紅豆杉細胞培養液中製備高純度紫杉醇的方法
【專利摘要】本發明涉及紫杉醇的製備方法，尤其是涉及從紅豆杉細胞培養液中製備高純度紫杉醇的方法，其包括將細胞培養液過濾、經大孔樹脂吸附富集，得粗提物、經常壓鹼性氧化鋁柱層析、經過C18反相高效製備液相分離，分部收集組分、離心獲取沉澱、將沉澱冷凍乾燥後得高純度紫杉醇單體。本發明選用紫杉醇高產細胞系培養液作為原材料，與紅豆杉枝葉、樹皮等提取相比，所含色素、脂質等雜誌更少，相比於真菌和細菌發酵液，其所含紫杉醇更高，該材料方便提取；同時從紅豆杉細胞培養液中直接用大孔樹脂富集紫杉醇，省去大量有機溶劑使用，工藝簡單，節約環保，回收率高，獲得的紫杉醇純度高。
【專利說明】從紅豆杉細胞培養液中製備高純度紫杉醇的方法
【技術領域】[0001]本發明涉及紫杉醇的製備方法，尤其是涉及從紅豆杉細胞培養液中製備高純度紫杉醇的方法。
【背景技術】[0002]紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種複雜的次生代謝產物，也是目前所了解的惟一一種可以促進微管聚合和穩定已聚合微管的藥物。紫杉醇是全球最暢銷的抗腫瘤藥物，同時也是世界上公認的廣譜強活性抗癌藥物，隨著臨床用途的急劇擴大，國際醫藥市場對紫杉醇原料藥有巨大的需求。[0003]近年來，國內外對紫杉醇製備多從植物的樹皮、枝葉等組織提取，工藝複雜，溶劑能量消耗較多，成本較高。野生紅豆杉受到法律保護後，只能從人工栽培的紅豆杉獲取樹皮，但紅豆杉生長緩慢，限制了樹皮原料來源。目前，還有一些方法:如通過半合成方法製備紫杉醇，但其必需先從植物材料中獲取紫杉醇前提化合物，所以也會受到資源限制；還如紫杉醇全合成方法，但其製備步驟及其複雜，成本很高，至今無法工業化生產；再如從真菌和細菌發酵液提取紫杉醇，因其含量太低，目前沒有實現工業化生產。美國與義大利在利用細胞培養法直接生產紫杉醇原料藥發展較快，迄今為止，全球利用紅豆杉細胞培養法生產紫杉醇的總規模每年仍只有數千升，在目前全球紫杉醇原料總產量中，細胞培養法生產的紫杉醇所佔份額極小。但由於細胞培養法不會消耗寶貴的紫杉樹或紅豆杉樹資源，故這一方法屬於「綠色生產新工藝」並代表著紫杉醇原料藥產業的未來，具有有廣闊的發展前景和市場增長空間。[0004]目前，植物細胞大規模培養生產紫杉醇的一個顯著特點是培養液體積龐大，紫杉醇在培養液中的含量比較低，一般在20mg/L左右，它既有一部分分泌到培養液中，還有一大部分存留在細胞中。現有技術中，出現了從細胞內提取紫杉醇的方法，其是將收穫期的細胞與培養液分離，然後將細胞烘乾後提取，在這種方法中，那些因分泌或部分細胞破裂流失到培養液中的的紫杉醇將被丟棄，導致回收率較低；還出現了從紅豆杉細胞培養液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其是用大量有機溶劑對培養液進行液-液萃取。這種方法必然會導致大量有機溶劑耗費和環境憂患，還要投入大量資金用於購置大尺寸的液-液萃取設備；還出現了採用膜分離濃縮技術從從紅豆杉細胞懸浮培養液分離紫杉醇的方法，儘管該方法可省去溶劑萃取步驟，能除去一部分雜質，但該方法操作麻煩，回收率不高。
【發明內容】
[0005]針對上述技術問題，本發明的目的在於提供一種從紅豆杉細胞培養液中製備高純度紫杉醇的新方法，該方法不僅工藝簡單，而且回收率高。[0006]本發明解決上述技術問題採用的技術方案為:從紅豆杉細胞培養液中製備高純度紫杉醇的方法，其包括以下步驟:(1)將紅豆杉細胞培養液進行固液分離，得到原液和細胞；然後將細胞破壁後過濾，得到濾液和濾渣；再將所述原液與濾液混合；
(2)將上述混合液體通過非極性大孔樹脂吸附層析柱富集，然後用蒸餾水衝洗，再用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，並將洗脫液中的乙醇蒸乾；
(3)向上述蒸乾乙醇的洗脫液中加入萃取劑，進行兩次液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空乾燥，得到大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品；
(4)將上述粗品轉載於用鹼性氧化鋁做填料的層析柱，用洗脫溶液進行洗脫，分部收集洗脫部分，並真空乾燥，得到樣品；
(5)將上述樣品通過C18高效液相色譜柱純化，然後用含甲醇溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置於通風廚，揮發有機相，待出現結晶後轉至4°C冰箱放置24h，離心收集一部分晶體，然後將上清液繼續放置使結晶完全，離心收集另一部分晶體，再將收集的全部晶體冷凍乾燥，得到高純度紫杉醇單體。
[0007]作為優選，步驟(1)中將所述培養液離心，獲得細胞，然後將細胞用勻漿機勻漿，再將勻漿後的糊狀流體加入等體積的乙醇進行超聲提取，並離心過濾後得到所述濾液。
[0008] 作為另一種優選，步驟(1)中將所述培養液經砂芯漏鬥抽濾或經板框過濾，得到細胞，然後將細胞用勻漿機勻漿，再將勻漿後的糊狀流體加入等體積的乙醇進行超聲提取，並用砂芯漏鬥抽濾，得到所述濾液。
[0009]進一步地，步驟(2)中採用體積濃度為75~85%乙醇溶液進行洗脫。
[0010]進一步地，向蒸乾乙醇的洗脫液中加入等體積的萃取劑，萃取劑為1:1的二氯甲烷與水或為1:1的三氯甲烷與水。
[0011]進一步地，步驟(4)採用三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液 本發明與現有技術相比，具有以下優點:
(I)本發明選用紫杉醇高產細胞系培養液作為原材料，與紅豆杉枝葉、樹皮等提取相t匕，所含色素、脂質等雜質更少，相比於真菌和細菌發酵液，其所含紫杉醇更高，該材料方便提取，所含雜質更少。
[0012](2)從紅豆杉細胞培養液中直接用大孔樹脂富集紫杉醇，相對於溶劑提取，節約了大量有機溶劑使用；相對於膜分離技術，操作更簡便，回收率更高；且大量有機溶劑採用乙醇，環保安全；
(3)本發明的總回收率在90%以上，利用高效製備液相能很好控制產品純度，獲得的紫杉醇純度高，可大於99.5% ；
(4)高效製備液相分離紫杉醇的同時，可以分部收集其他紫杉烷類化合物；
(5)整個工藝流程簡便，易於放大產業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明的流程框圖。
【具體實施方式】
[0014]下面結合圖1對本發明的方法作進一步地詳細說明:
本方法是:(I)將紅豆杉細胞培養液進行固液分離，得到原液和細胞，固液分離可採用用離心、板框過濾、砂芯漏鬥抽濾等方式，大規模生產一般用板框過濾或者離心方式；然後將細胞破壁後過濾，得到濾液和濾渣；再將所述原液與濾液混合；細胞培養液中的紫杉醇幾乎完全溶解在最後混合液中，通過離心或過濾可以除去破碎的細胞成分，所得濾液所含雜質更少，便於後續的大孔吸附樹脂富集。
[0015](2)將上述混合液體通過非極性大孔樹脂吸附層析柱富集，非極性大孔吸附樹脂可為D-101，HP-30, D4020的一種；然後用蒸餾水衝洗,再用乙醇溶液洗脫,收集洗脫液,並將洗脫液中的乙醇蒸乾；這樣能夠從大量液體中富集紫杉醇，濃縮後紫杉醇含量可達I~
5% ο
[0016](3)向上述蒸乾乙醇的洗脫液中加入萃取劑，進行兩次液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空乾燥，得到大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品；萃取後可以除去一部分雜質，並且能除去水分，便於後續氧化鋁柱層析。
[0017](4)將上述粗品轉載於用鹼性氧化鋁做填料的層析柱，用洗脫溶液進行洗脫，分部收集洗脫部分，並真空乾燥，得到樣品；鹼性氧化鋁層析柱在分離紫杉醇同時可以催化7-表-紫杉醇等紫杉烷類化合物向紫杉醇轉化，除去較難分離的雜質同時提高回收率。
[0018](5)將上述樣品通過C18高效液相色譜柱純化，然後用含甲醇溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置於通風廚，揮發有機相，待出現結晶後轉至4°C冰箱放置24h，離心收集一部分晶體，然後將上清液繼續放置使結晶完全，離心收集另一部分晶體，再將收集的全部晶體冷凍乾燥，得到高純度紫杉醇單體。由於利用C18高效液相色譜柱，能高效分離紫杉醇，重複性好，便於控制。具體實施例如下:
實施例1
紅豆杉細胞懸浮培養液300mL，經H PLC檢測培養液中和細胞內共含紫杉醇27mg。
[0019](I)將培養液5000r/min離心5min，獲得82mL細胞固體，將細胞用勻漿機在10000r/min的轉速下勻漿2min，將勻漿後的糊狀流體加入等體積的95%乙醇超聲提取30min, 5000r/min離心過濾後得129mL,與之前液體混合共得347mL。
[0020](2)取國產D-101大孔吸附樹脂，溼法裝成1.5X30cm的層析柱，將混合液加載到大孔樹脂色譜柱頂(上樣量約為3mg紫杉醇/mL樹脂)，用蒸餾水衝洗，除去水溶性雜質和色素，用體積百分比含乙醇75%的水溶液洗脫，收集30mL洗脫液，將洗脫液中的乙醇蒸乾，加入等體積的三氯甲烷:水(1:1)進行液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空乾燥得到1.150g大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品，經HPLC分析含紫杉醇2.3% (25.9mg)，紫杉醇收率為95.9%。
[0021](3)將上述1.150g大孔樹脂柱分離粗品，轉載於用鹼性氧化鋁做填料的層析柱，三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液做流動相，分部收集洗脫部分，低溫真空乾燥得樣品0.116g ;經HPLC分析含紫杉醇21.7% (25.2mg)，紫杉醇回收率為97.3%.[0022](4)樣品通過C18高效液相色譜柱純化，用含甲醇55%的甲醇水溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置於通風廚，揮發有機相，待出現結晶後轉至4°C冰箱放置24h，離心獲取晶體，上清液繼續放置使結晶儘量完全，將收集的晶體冷凍乾燥後，得高純度紫杉醇單體。獲得純度為99.6%的精分離紫杉醇24.8mg，回收率為98.4%，總回收率為91.5%。
[0023]實施例2
紅豆杉細胞懸浮培養液IL J^HPLC檢測培養液中和細胞內共含紫杉醇92mg。[0024](1)將培養液經砂芯漏鬥抽濾後得260mL細胞固體，將細胞用勻漿機在1000Or/min的轉速下勻眾2min,將勻眾後的糊狀流體加入等體積的95%乙醇超聲提取30min,砂芯漏鬥抽濾後得405mL,與之前液體混合後共得1145mL。
[0025](2)取進口 HP-30大孔吸附樹脂，溼法裝成2 X 30cm的層析柱，將混合液加載到大孔樹脂色譜柱頂(上樣量約為3mg紫杉醇/mL樹脂)，用蒸餾水衝洗，除去水溶性雜質和色素，用體積百分比含乙醇80%的水溶液洗脫，收集IOOmL的洗脫液，將洗脫液中的乙醇蒸乾，加入等體積的二氯甲烷:水(1:1)進行液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空乾燥得到3.351g大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品，經HPLC分析含紫杉醇2.6% (88.5mg)，紫杉醇回收率為96.2%。
[0026](3)將上述3.351g大孔樹脂柱分離粗品，轉載於用鹼性氧化鋁做填料的層析柱，三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液做流動相，分部收集洗脫部分，50°C真空乾燥，得樣品0.349g ;經HPLC分析含紫杉醇24.8% (86.7mg)，紫杉醇回收率為98.0%。
[0027](4)樣品通過C18高效液相色譜柱純化，用含甲醇55%的甲醇水溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置於通風廚，揮發有機相，待出現結晶後轉至4°C冰箱放置24h，離心獲取晶體，上清液繼續放置使結晶儘量完全，將收集的晶體冷凍乾燥後，得高純度紫杉醇單體85.63mg，純度為99.5%，回收率為98.3 %，總回收率為92.6%。
[0028]實施例3
紅豆杉細胞懸浮培養液3L，經HPLC檢測培養液中和細胞內共含紫杉醇265mg。
[0029](I)將培養液經砂芯漏鬥抽濾後得775mL細胞固體，將細胞用勻漿機在1000Or/min的轉速下勻眾2min,將勻眾後的糊狀流體加入等體積的95%乙醇超聲提取30min,過濾後得1210mL，與之前液體混合共得3435mL。
[0030](2)取國產D-101大孔吸附樹脂，溼法裝成3X30cm的層析柱，將混合液加載到大孔樹脂色譜柱頂(上樣量約為3mg紫杉醇/mL樹脂)，用蒸餾水衝洗，除去水溶性雜質和色素，用體積百分比含乙醇85%的水溶液洗脫，收集300mL的洗脫液，將洗脫液中的乙醇蒸乾，加入等體積的三氯甲烷:水(1:1)進行液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空乾燥得到12.130g大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品，經HPLC分析含紫杉醇2.1% (251mg)，紫杉醇收率為94.7%。
[0031](3)將上述12.130g大孔樹脂柱分離粗品，裝載於用鹼性氧化鋁做填料的層析柱，三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液做流動相，分部收集洗脫部分，低溫真空乾燥，得樣品1.098g,經HPLC分析含紫杉醇22.3% (245mg)，紫杉醇回收率為97.6%。
[0032](4)樣品通過C18高效液相色譜柱純化，用含甲醇50%的甲醇水溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置於通風廚，揮發有機相，待出現結晶後轉至4°C冰箱放置24h，離心獲取晶體，上清液繼續放置使結晶儘量完全，將收集的晶體冷凍乾燥後，得高純度紫杉醇單體。獲得純度為99.5%的精分離紫杉醇242mg，回收率為98.5%，總回收率為90.9%
上述實施方式僅供說明本發明之用，而並非是對本發明的限制，有關【技術領域】的普通技術人員，在不脫離本發明精神和範圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所有等同的技術方案也應屬於本發明的範疇。
【權利要求】
1.從紅豆杉細胞培養液中製備高純度紫杉醇的方法，其包括以下步驟: (1)將紅豆杉細胞培養液進行固液分離，得到原液和細胞；然後將細胞破壁後過濾，得到濾液和濾渣；再將所述原液與濾液混合； (2)將上述混合液體通過非極性大孔樹脂吸附層析柱富集，然後用蒸餾水衝洗，再用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，並將洗脫液中的乙醇蒸乾； (3)向上述蒸乾乙醇的洗脫液中加入萃取劑，進行兩次液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空乾燥，得到大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品； (4)將上述粗品轉載於用鹼性氧化鋁做填料的層析柱，用洗脫溶液進行洗脫，分部收集洗脫部分，並真空乾燥，得到樣品； (5)將上述樣品通過C18高效液相色譜柱純化，然後用含甲醇溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置於通風廚，揮發有機相，待出現結晶後轉至4°C冰箱放置24h，離心收集一部分晶體，然後將上清液繼續放置使結晶完全，離心收集另一部分晶體，再將收集的全部晶體冷凍乾燥，得到高純度紫杉醇單體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟(1)中將所述培養液離心，獲得細胞，然後將細胞用勻漿機勻漿，再將勻漿後的糊狀流體加入等體積的乙醇進行超聲提取，並離心過濾後得到所述濾液。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟(1)中將所述培養液經砂芯漏鬥抽濾或經板框過濾，得到細胞，然後將細胞用勻漿機勻漿，再將勻漿後的糊狀流體加入等體積的乙醇進行超聲提取，並用砂芯漏鬥抽濾，得到所述濾液。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於:步驟(2)中採用體積濃度為75~85%乙醇溶液進行洗脫。
5.根據權利要求4所述的方`法，其特徵在於:在步驟(3)中，向蒸乾乙醇的洗脫液中加入等體積的萃取劑，萃取劑為1:1的二氯甲烷與水或為1:1的三氯甲烷與水。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於:步驟(4)採用三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液。
【文檔編號】C07D305/14GK103570647SQ201310546214
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】熊興耀, 楊星星, 蘇小軍, 王仁才 申請人:湖南農業大學