非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物及其衍生物在抗B肝病毒中的應用的製作方法

2023-05-24 11:56:01

專利名稱：非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物及其衍生物在抗B肝病毒中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬化學合成藥物領域，涉及非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物(KM-1)及其衍生物在製藥中的新用途。具體涉及KM-1在抗B肝病毒複製中的新用途。
背景材料B型肝炎病毒(HBV)是引起人類慢性B型肝炎，肝硬化甚至肝癌的重要病因。B肝病毒的複製與上述疾病的發生與發展有重要相關性。病毒基因組所編碼的病毒DNA聚合酶是決定病毒複製性高低的關鍵組分。B肝病毒DNA聚合酶由末端蛋白，連接臂，逆轉錄酶(RT)和RNaseH酶四部分組成。其中逆轉錄酶的作用是以病毒前基因組RNA為模板，逆轉錄成病毒DNA，然後經過DNA複製子代DNA[1]。HBV的逆轉錄酶(RT)的作用與愛滋病毒(HIV)中逆轉錄酶(RT)的作用相似。因此，目前很多作用於RT的藥物可用於HIV及HBV所致感染的治療。
目前，根據HBV的RT結構與功能，已設計了數種抗B肝病毒的藥物，如拉米呋啶(3TC)，恩替卡韋等。已知的抗病毒RT藥物一大類為核苷類似物，通過摻入病毒DNA阻止核苷酸鏈繼續延長而阻斷病毒複製。另一類為非核苷類藥物，大部分為不同的疏水性化合物，通過作用於RT中的疏水性「口袋」(pockets)而阻礙RT的正常功能[2，3]。由於HIV和HBV均可對上述藥物產生耐藥性，需要研發新的抗病毒藥物。Dolan H Eargle Jr(University of California，San Francisco)及George LKenyon(University of Michigan，Ann Arbor)經過研究，合成了KM-1(稱為第5化合物，具有圖1A的分子結構式)，於2000年獲得美國專利(專利號#6140.368)[4，5，6]，其中公開了合成KM-1和幾種衍生物的方法，以及應用KM-1抑制HIV RT和整合酶的作用。目前尚無有關KM-1及其衍生物用於抑制HBV RT及其複製的報導。
復旦大學分子病毒學實驗室長期以來進行HBV RT的研究，在HBV RT拇指亞區發現有一段胺基酸保守的序列，並證明該區突變後有影響HBV複製的作用[7]，中國專利申請號200510112431.8。鑑於KM-1可能作用於HBV RT拇指亞區，因此KM-1在抗HBV複製中的應用，引起有關研究者的關注。
有關參考文獻及材料1.Radziwill，G.et al.1990.J Virol 64613-20.
2.Karayiannis 2003.J Antimicrob Chemotherapy 51761-785.
3.Spence RA et al.1995，Science 267988-993.
4.Wang et al.2004.Journal Biological Chemistry 27938424-32.
5.Skillman AG et al.2002.Bioorganic Chemistry 30443-458.
6.US Patent#6,140,368.2000.
7.Lin，X.et al.2001.J Virol 7511827-33.

發明內容
本發明的目的是提供非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物(KM-1)及其衍生物在製備抗B肝病毒藥物中的新用途。
本發明利用已有的內源性聚合酶活性抑制試驗技術，以及用B肝病毒基因組轉染細胞研究病毒複製技術建立測定萘磺酸類化合物KM-1抗B肝病毒複製的平臺，分別用不同濃度的KM-1進行抑制HBV複製的實驗，結果證實KM-1具有抗B肝病毒複製的新用途。
本發明涉及的非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物及其衍生物屬偶氮化合物((2-萘磺酸，(4-羥基-7-[[[[5-羥基-6-[(4-肉桂酸苯基)偶氮]-7-磺酸-2-萘基]氨基]羰基]氨基]-3-[(4-肉桂酸苯基)]偶氮，2-naphthalenesulfonic acid，(4-hydroxy-7-[[[[5-hydroxy-6-[(4-cinnamylphenyl)azo]-7-sulfo-2-naphthalenyl]amino]carbonyl]amino]-3-[(4-cinnamylphenyl)]azo)，簡稱KM-1，美國專利號#6140.368[4，5，6])。
本發明在KM-1基礎上修飾其結構獲得衍生物，用以提高療效及降低對細胞的毒性，採用KM-1單獨或與其他藥物或製品聯合應用於對不同B肝病毒基因型及耐藥毒株的實驗研究及臨床研究。
HBV與HIV兩種病毒生物學特性的根本區別在於，HIV有成熟的培養病毒並檢測其複製的細胞工具，但迄今HBV尚無簡單可行的體外細胞培養技術。因此必須建立可代表HBV複製的體外及細胞內兩種技術平臺，並應用KM-1與之作用KM檢驗KM-1是否有抗HBV的作用。
本發明所採用的體外HBV聚合酶檢測活性技術為將整合有4個拷貝的HBVDNA並可持續分泌HBV病毒顆粒的HepG2.2.15細胞(購自武漢大學中國典型培養物保藏中心)，裂解後，用包被有HBV核心抗體的蛋白A-Sepharose CL-4B珠子，將HBV的核衣殼顆粒吸附並離心沉澱，在上述沉澱中加入[α-32P]dCTP及dATP，dGTP和dTTP在37℃孵育，作內源性聚合酶摻入試驗。為測定KM-1抑制HBV DNA多聚酶的活性，在上述摻入試驗中加入不同濃度的KM-1共同孵育。次日，用蛋白酶K消化去除蛋白，提取DNA，在瓊脂糖凝膠中電泳，Southern印跡轉移至膜上，用磷屏曝光，進行灰度掃描定量。用統計軟體SPSS 11.5版本分析求得KM-1對HBV聚合酶活性50％抑制的濃度。
本發明所述的KM-1對細胞內HBV複製抑制的測定技術，應用了已知的全基因組HBV轉染Huh-7細胞(美國ATCC購買)及複製效率測定方法。通過已知的磷酸鈣共沉澱法將B肝病毒基因組轉染入Huh-7細胞，次日換液後，在培養上清中同時加入不同濃度的KM-1，並連續培養4-5天，用文獻[7]報導的方法提取細胞內的HBV核心顆粒中的病毒DNA。用Southern印跡法，與標記的HBV探針作分子雜交及放射自顯影術，檢驗在不同濃度的KM-1存在條件下對細胞內HBV複製的影響。通過分析雜交信號的強弱作細胞內HBV DNA含量測定，對比研究KM-1處理組和未處理組HBV複製特性的變化，驗證KM-1抗B肝病毒新的用途。
本發明通過體外及細胞內抗B肝病毒複製的實驗，證實了KM-1具有抗B肝病毒複製的用途。已知B肝病毒能引起相關疾病的發病，如急性、慢性B型肝炎、重症肝炎、肝硬化、肝癌，及肝移植後的抗病毒感染，本發明KM-1及其衍生物可進一步用於製備治療急性、慢性B型肝炎、重症肝炎、肝硬化、肝癌，及肝移植後的抗病毒感染藥物以及應用於相關實驗及臨床研究。


圖1是KM-1對HepG2.2.15細胞來源的HBV內源性聚合酶活性的抑制作用。
其中，A為KM-1的分子結構式；B為KM-1劑量依賴性抑制HepG2.2.15細胞來源的HBV內源性聚合酶活性。
圖2是KM-1對不同HBV株基因組來源的HBV內源性聚合酶活性的抑制作用。
其中，A為KM-1劑量依賴性抑制#97毒株及其變異體轉染細胞來源的HBV內源性聚合酶活性；B為KM-1劑量依賴性抑制3TC耐藥毒株轉染細胞來源的HBV內源性聚合酶活性。
圖3是KM-1對Huh-7細胞的毒性試驗。
圖4是KM-1對Huh-7細胞內HBV複製的作用。
其中，A為KM-1對野生型毒株(#97)細胞內複製的抑制作用；B為KM-1對3TC耐藥毒株在細胞內複製的抑制作用。
具體實施例方式
實施例1 HepG2.2.15細胞來源的HBV內源性聚合酶活性抑制試驗將HepG2.2.15細胞接種於75cm2細胞培養瓶中，每兩天換液一次直至細胞匯片後再培養兩至三天。用胰蛋白酶-EDTA消化後離心收集細胞，PBS懸浮細胞後離心棄盡上清，重複一次以去除殘留胰酶。用細胞裂解液(10mM Tris-HCl[pH7.9]，1mM EDTA，100mM NaCl，1％NP-40)懸浮細胞並於37℃孵育10min裂解細胞，離心後收集上清。將600μl上清加入30μl預先包被有多克隆衣殼抗體(Dako公司，上海基因有限公司代理)protein A Sepharose CL-4B珠子(Amersham公司)中，室溫振蕩孵育4小時，短暫離心沉澱珠子，並用PBS溶液洗滌沉澱珠子2次，吸盡上清獲得吸附的B肝病毒核衣殼顆粒。在病毒核衣殼中加入50μl反應液(50mM Tris-Cl(pH7.5)-75mM NH4Cl-1mM EDTA-20mM MgCl2-0.1％(vol/vol)β-mercaptoethanol-0.5％(vol/vol)Nonidet P-40-0.4mM dATP-0.4mM dGTP-0.4mMdTTP-10mCi[a-32P]dCTP(3,000Ci/mmol))，將不同濃度的KM-1也加於該反應液中，37℃孵育過夜。次日用蛋白酶K溶液37℃消化2小時後，依次用酚，酚/氯仿抽提一次，乙醇沉澱標記的病毒核酸，將DNA溶於20μl TE溶液中，並在1％瓊脂糖-TAE凝膠上5V/cm分離2小時後轉印到尼龍膜上，用磷屏曝光並進行灰度掃描定量。通過SPSS version 11.5軟體Probit程序求得KM-1對於B肝病毒聚合酶50％抑制濃度(IC50)。結果顯示KM-1以劑量依賴的方式抑制B肝病毒核衣殼內的聚合酶活性(圖1B)。KM-1對於B肝病毒聚合酶的IC50為2.97μM。
實施例2不同HBV株基因組來源的HBV內源性聚合酶活性抑制試驗為測定化合物KM-1對不同HBV毒株來源的聚合酶活性抑制試驗，首先將克隆有任何HBV全基因組可以在細胞內複製子的質粒DNA(實驗用#97毒株，GenBank登入號AF411411)及其不同變異株質粒DNA，通過磷鈣沉澱法轉染Huh-7細胞(ATCC，美國)次日換液，連續培養4天後，同上法獲得核衣殼顆粒。在病毒核衣殼中加入50μl反應液(50mM Tris-Cl(pH7.5)-75mM NH4Cl-1mMEDTA-20mM MgCl2-0.1％(vol/vol)β-mercaptoethanol-0.5％(vol/vol)NonidetP-40-0.4mM dATP-0.4mM dGTP-0.4mM dTTP-10mCi[a-32P]dCTP(3,000Ci/mmol))，將不同濃度的KM-1也加於該反應液中，37℃孵育過夜。次日用蛋白酶K溶液37℃消化2小時後，依次用酚，酚/氯仿抽提一次，乙醇沉澱標記的病毒核酸，將DNA溶於20μl TE溶液中，並在1％瓊脂糖-TAE凝膠上5V/cm分離2小時後轉印到尼龍膜上，用磷屏曝光並進行灰度掃描定量。結果顯示KM-1對不同HBV毒株來源的聚合酶活性有抑制作用(圖2)，包括對拉米呋啶(3TC)耐藥的毒株來源的聚合酶活性也具有抑制作用(圖2B)。
實施例3細胞毒性試驗採用Promega公司CellTiter 96Aqueous試劑盒進行。將Huh-7細胞以104/孔細胞密度接種於96孔細胞培養板中，每種KM-1濃度設5個復孔。次日，更換含有化合物的細胞培養液(100μl/孔)，連續培養4天後，更換無化合物細胞培養液(100μl/孔)，每孔加入20μl PMS/MTS溶液，在細胞培養箱中37℃，5％CO2環境下培養3h，將100μl上清轉移入一新的96孔板中，在ELISA酶標儀上測定490nm的吸光度值。KM-1對於Huh-7細胞的50％細胞毒濃度(CC50)通過SPSS version 11.5軟體Probit程序求得。CC50為3,820μM(圖3)。
實施例4細胞水平觀察KM-1對B肝病毒複製的抑制作用轉染前一天將Huh-7細胞以每皿1×106個細胞接種於60mm細胞培養皿中，16-18小時後換5ml新鮮DMEM培養液(含10％胎牛血清，100U/ml青黴素G，100μg/ml鏈黴素，0.2mM L-穀氨醯胺)，2～4小時後用20μgDNA(10μg含1.3拷貝HBV基因組質粒DNA，4μg pSEAP2-Control和6μg pCDNA3.1)按磷酸鈣共沉澱法分別轉染Huh-7細胞。次日換新鮮培養液，並在培養液中加入一定量的KM-1，連續培養4天後，取200μl培養上清測定外源性表達的SEAP(secreted alkalinephosphatase)含量以校正轉染效率，然後按文獻[7]所述方法抽提細胞內病毒顆粒DNA。最後採用HBV特異性Southern印跡法測定KM-1處理後的細胞內病毒顆粒DNA含量，結果與未處理組比較，KM-1具有抑制HBV複製的作用，而且對於拉米呋啶耐藥的毒株也具有抑制作用(圖4)。
權利要求
1.非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物及其衍生物在製備抗B肝病毒藥物中的應用。
2.按權利要求1所述的應用，其中所述的應用是抗B肝病毒複製中的應用。
3.按權利要求1所述的應用，其中所述的抗B肝病毒藥物中的應用是治療B肝病毒引起的相關疾病藥物中的應用或相關實驗及臨床研究中的應用。
4.按權利要求3所述的應用，其中所述的B肝病毒引起的相關疾病是急性、慢性B型肝炎、重症肝炎、肝硬化或肝癌或肝移植後的病毒感染。
5.按權利要求3所述的應用，其中所述的實驗及臨床研究是在非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物基礎上修飾其結構獲得衍生物，用以提高療效及降低對細胞的毒性；或用非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物單獨或與其他藥物或製品聯合應用的實驗及臨床研究。
6.按權利要求3所述的應用，其中所述的實驗研究是採用非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物及其衍生物對不同B肝病毒基因型及耐藥毒株的研究。
全文摘要
本發明屬化學合成藥物領域，涉及非核苷類抑制病毒逆轉錄酶化合物(KM－1)及其衍生物在製藥中的新用途。具體涉及KM－1在抗B肝病毒複製中的新用途。本發明利用內源性聚合酶活性抑制試驗技術，以及B肝病毒基因組轉染細胞研究病毒複製技術建立測定萘磺酸類化合物KM－1抗B肝病毒複製的平臺，分別用不同濃度的KM－1進行抑制HBV複製的實驗，結果證實KM－1具有抗B肝病毒複製的新用途。本發明KM－1及其衍生物可進一步用於製備治療急性、慢性B型肝炎、重症肝炎、肝硬化、肝癌，及肝移植後的抗病毒感染藥物以及應用於相關實驗及臨床研究。
文檔編號A61P31/12GK1927399SQ20061011651
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月26日 優先權日2006年9月26日
發明者聞玉梅, 王勇翔, 杜蘭·H·厄格爾, Jr, 喬治·L·肯揚 申請人:復旦大學