REVOLUTA基因在調控豆科植物小葉片數目和葉莖比中的應用的製作方法
2023-05-24 09:52:06
本發明涉及蒺藜苜蓿轉錄因子hd-zipiii基因家族的mtrevoluta基因在調控小葉片數目和葉莖比中的應用，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
豆科牧草苜蓿是世界上栽培最早，分布最廣，也是最為重要的一種多年生優質牧草。但是，國產苜蓿產量少、品質差、貨源不穩定，這已成為限制我國草食畜牧業和奶業發展的一個不可忽視的因素。目前我國苜蓿的商業生產正在迅速增長，但由於國內對高質量苜蓿日益增長的巨大需求，國產苜蓿的短缺情況並沒有得到緩解。因此苜蓿的產量和品質改良是我國草業、畜牧業和奶業發展的重大迫切需求。
苜蓿是以收穫葉、莖為主的牧草，葉對苜蓿產草量的貢獻率最多可達60％。葉片不僅是苜蓿生長發育、產量構成和品種特性的重要指標，更是栽培管理及病蟲害監測的主要研究對象。在苜蓿品質評價體系中，葉莖比(葉片與莖稈重量的比值)是其中一個重要的指標。苜蓿70％的蛋白質儲藏於葉片中，而且葉片纖維含量僅為莖稈的1/3。因此葉莖比值越大，苜蓿的營養價值就越高，適口性就越好，同時利用價值也就相對越高。苜蓿多葉性狀目前已被作為一種形態學標記，被認為具有高產和優質的潛力。選育葉量豐富、葉莖比高的苜蓿新品種一直是育種工作者追求的目標。
植物的葉發育模式分為單葉和複葉。單葉結構指得是在一個葉柄上只有一個小葉片，而複葉結構指得是在一個葉柄上有多個小葉片生成。蒺藜苜蓿的葉為複葉結構，包括三個小葉片。苜蓿的多葉性狀是由多基因控制的，其產生是一個複雜的過程而且同時受環境和基因兩方面的影響。到目前為止，只有少數多葉苜蓿品種被商業化。這些品種中大部分植株具有多葉性狀，但植株個體多葉頻率高低不均：有的植株僅數個複葉為多葉型，多數複葉仍為三出複葉；也有植株不同枝條上混雜出現多葉型複葉和三出複葉，而多葉頻率高的植株則非常少見。這些缺陷導致現有的多葉型苜蓿品種在生產性能方面並未表現出明顯優勢。
因此，基於以上原因，對苜蓿複葉發育分子機制進行研究，通過基因工程直接提高苜蓿小葉片數量可為苜蓿優質新品系的分子設計改良和育種提供理論基礎和技術手段，有助於高效、優質、高產的苜蓿新品種的培育。
同源域亮氨酸拉鏈第三類基因家族(classiiihomeodomain-leucinezipper，hd-zipiii)在葉片極性建立過程中起關鍵作用。目前尚未見到有關於蒺藜苜蓿hd-zipiii基因家族成員mtrevoluta基因在複葉物種中調控小葉片數目和葉莖比的報導。
技術實現要素：
針對上述現有技術，針對現有多葉苜蓿品種多葉頻率不高的問題，本發明發現了一種調控豆科植物小葉數目和葉莖比的基因，並提供了一種敲除該基因以獲得可提高小葉片數目和葉莖比的轉基因豆科植物的方法。
本發明是通過以下技術方案實現的：
本發明首次分離得到了蒺藜苜蓿hd-zipiii基因家族成員mtrevoluta基因的敲除突變體株系，並通過實驗證明，該基因參與了調控豆科植物的小葉片數目和葉莖比，並可通過敲除該基因的方式以得到小葉片數目和葉莖比高於野生型植株的轉基因豆科植物。
所述mtrevoluta基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
所述豆科植物，優選苜蓿、蒺藜苜蓿、三葉草。
本發明利用特異性引物(核苷酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示)，通過rt-pcr技術從蒺藜苜蓿中克隆mtrevoluta基因；利用構建的突變體群體，篩選出了mtrevoluta基因的敲除突變體株系，發現植株的小葉片數目由三個變為四個或五個(多達81.5％的葉片的小葉片數目得到了提高)，這一數據遠高於目前現有的多葉苜蓿品種(約40％)，同時葉莖比顯著提高(提高了約11％)，這證明，該基因參與了調控豆科植物的小葉片數目和葉莖比，敲除該基因，可以得到小葉片數目和葉莖比高於野生型植株的轉基因豆科植物，可顯著提高小葉片數目和葉莖比，預示本發明實施後將會創造新型豆科牧草植物，可用於後續的牧草品質，對我國草業生產具有重大意義。
附圖說明
圖1：蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的克隆和表達分析，其中，a.mtrevoluta的基因結構，方框代表外顯子，實線代表內含子；tnt1插入在第六個外顯子區域。b-i.蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的表達分析；通過對啟動子：gus轉基因植株的染色，表明mtrevoluta基因在頂芽、葉片、葉柄、莖、花、果莢、根尖和種皮中都有表達。
圖2：蒺藜苜蓿mtrevoluta基因突變體的鑑定，其中，a.基因組pcr擴增野生型和突變體的mtrevoluta序列，表明突變體基因中插入了一個5.3kb的tnt1序列。b.qrt-pcr檢測mtrevoluta的表達水平，表明在突變體中mtrevoluta的表達水平顯著下降。
圖3：蒺藜苜蓿mtrevoluta基因突變體的小葉數量和葉莖比統計，其中，a.野生型的複葉結構，包括三個小葉片。b-c.mtrevoluta突變體的的複葉結構，包括四個或五個小葉片。d.野生型和mtrevoluta突變體不同數目小葉片的百分比統計。e.野生型和mtrevoluta突變體的葉莖比統計。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。
實施例1克隆蒺藜苜蓿基因mtrevoluta
1.蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的克隆
通過生物信息學網站ncbi獲得擬南芥revoluta的序列，然後利用blast進行序列比對搜索，獲得mtrevoluta的基因組序列。根據序列設計seqidno.2和seqidno.3所示的引物。利用trizol試劑盒提取蒺藜苜蓿rna，rt-pcr方法擴增mtrevoluta基因的全長cds序列。利用gateway技術將基因序列連入pearleygate201載體，然後進行序列測定，驗證克隆序列的正確性。
2.蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的序列信息與特性分析
mtrev1基因的編碼區cds為2520bp，包含18個外顯子和17個內含子，編碼839個胺基酸，包含有保守的hd-zip，mekhla和start脂結合區域(圖1a)。
蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的表達分析
mtrevoluta啟動子驅動gus表達：為了定位mtrevoluta基因表達的精細部位，將mtrevoluta啟動子區域2.1kb的片段構建到phgwfs7。通過農桿菌eha105轉化蒺藜苜蓿，最後篩選獲得mtrevoluta啟動子：gus的轉基因植株。gus染色分析發現，mtrevoluta在葉芽、成年葉、葉柄、莖、花、莢果以及正在萌發的種子的根尖中均有較強表達(圖1b-i)。
實施例2蒺藜苜蓿mtrevoluta突變體的獲得和鑑定
利用thermalasymmetricinterlaced-pcr(tail-pcr)技術，篩選了蒺藜苜蓿tnt1標記的突變體庫，在22000個突變體株系中篩選出tnt1插入到mtrevoluta基因中的突變體株系(圖2a)。分子生物學鑑定結果表明，tnt1插入到mtrevoluta基因的第六個外顯子，導致該基因表達水平顯著下降(圖2b)。
實施例3蒺藜苜蓿mtrevoluta突變體的小葉數量統計
對突變體的表型進行分析，結果表明，敲除mtrevoluta突變體的小葉片數目顯著增多。野生型的複葉中包括三個小葉片，而突變體中約81.5％(n＝300)的複葉中包含有4個或5個小葉片(圖3a-d)。進一步分析表明，突變體的葉莖比與野生型相比，提高了約11％(n＝10)(圖3e)。
序列表
山東大學
revoluta基因在調控豆科植物小葉片數目和葉莖比中的應用
2017-08-08
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