尿激酶原改構體、製備方法、藥物組合物和用途以及編碼基因、含有基因的載體和轉化細胞的製作方法

2023-04-24 10:35:16 1

專利名稱：尿激酶原改構體、製備方法、藥物組合物和用途以及編碼基因、含有基因的載體和轉化細胞的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體地說，涉及尿激酶原(prourokinase，簡稱pro-UK)的改構體，該改構體的製備方法，含有該改構體的藥物組合物及用途，以及該改構體編碼基因，含有其基因的載體，含有該載體的轉化細胞。
背景技術：
1979年，Husain等首次從尿中純化出尿激酶原(US Patent No.4381346，1979)。尿激酶原又稱單鏈尿型纖溶酶原激活劑(single chain urine-type plasminogen activator，簡稱scu-PA)由411個胺基酸組成，是一種分子量為50～54Kda(其差異可能與生產的細胞與純化方法不同，從而導致糖基化水平差異所致)的單鏈蛋白質分子。天然pro-UK為鹼性糖蛋白，含有12對二硫鍵，其前體分子含有由20個胺基酸殘基組成的疏水信號肽。pro-UK等電點為8.9-9.05，比活性一般認為是1-1.3×105IU/mg，測定方法主要有溶解圈法(徐康森等，.尿激酶質量標準的研究.藥檢工作通訊，1979；9241；高麗華等，尿激酶原測定方法的改進及對CL-11G細胞表達尿激酶原水平穩定性的觀察.生物技術通訊，1997；894)和S2444底物比色法(Winkler M.E.Blaber M.(1986)Purification and characterization of recombinant single-chain urokinase producedin Escherichea coli.Biochemistry25(5)4041-14))。Pro-UK與尿激酶具有相同的抗原決定簇，可與尿激酶抗體反應。
成熟的proUK按其功能分為三個蛋白結構域表皮生長因子結構域(EGF domain，簡稱E區)，環柄結構域(Ktingle domain，簡稱K區)和蛋白水解酶結構域(protease domain，簡稱P區)。E區由第5-49位胺基酸殘基組成，其序列與人表皮生長因子高度同源，富含半胱氨酸，在胺基酸殘基11和19、13和31、33和42間各有一對二硫鍵，其中12-32位的胺基酸負責與細胞表面特異性受體結合，特別是Asn22，Asn27，His29，Trp30殘基具有不可替代的作用。K區由第50-136位胺基酸組成，因其三維結構摺疊成一個環柄狀結構而得名。有3對二硫鍵，其位置分別在50和130、71和113、102和126殘基間。纖溶酶原(plasminogen，簡稱plg)、組織型纖溶酶原激活劑(簡稱t-PA)、凝血酶原和脂蛋白α中也存在Kringle區。該區的功能主要與同纖維蛋白結合有關，通過分析凝血組分中K區域結構與功能，推測該區可能參與蛋白與蛋白之間的相互作用，但具體功能尚不清楚。P區由第159-411位胺基酸組成，位於pro-UK梭基端，該區內共有5對二硫鍵，構成一個絲氨酸蛋白酶催化中心。其中His204，Asp255，Ser356構成該酶的活性中心，Asn302為糖基化位點。突變實驗表明Ile159的存在不僅決定雙鏈UK衍生物的活性，而且也決定單鏈pro-UK的活性。Lys300對pro-UK的高催化活性具有重要作用。環柄結構域與蛋白水解酶結構域之間是包括激活位點Lys158-Ile159在內的連接肽段，當pro-UK在纖溶酶的作用下Lys158-Ile159鍵的肽鏈斷裂變為雙鏈UK後，靠Cys148-Cys279間的二硫鍵的連接形成穩定的二級結構。
Pro-UK基因全長為6387bp，位於第10號染色體上，含有10個內含子，11個外顯子，外顯子II主要編碼proUK信號肽序列，外顯子IV編碼表皮生長因子-類結構域，外顯子V和VI編碼kringle區，外顯子VII-XI編碼絲氨酸蛋白酶結構域。Pro-UK基因可轉錄成2.4kb的成熟mRNA，初始翻譯產物為前pro-UK，含有由20個胺基酸殘基組成的信號肽序列，細胞分泌時將信號肽除去即產生成熟pro-UK。
天然Pro-UK分子為糖蛋白，其糖基化位點在Asn302上。Pro-UK在體內主要受肝細胞膜上的特異性受體所介導，並在肝細胞溶酶體中被降解，血中半衰期大約8分鐘。研究表明，非糖基化的pro-UK被纖溶酶(plasmin)活化的能力比糖基化pro-UK強，其催化活性也比糖基化pro-UK強，但非糖基化在血漿中較之糖基化更不穩定，容易降解。目前認為，糖基化影響酶活性的原因可能是Asn302所處位置與pro-UK被活化的位點(Lys158-Ile159)和酶活性中心比較接近。
pro-UK屬於絲氨酸蛋白酶家族，是纖溶酶原激活劑的一種，其溶栓機理是將沒有活性的纖溶酶原轉變成有活性的纖溶酶，纖溶酶具有降解血塊中交聯纖維蛋白的能力，以溶解血栓。Pro-UK激活纖溶酶原的過程可概括為三步反應pro-UK內在酶活性催化少量纖溶酶原變為纖溶酶；產生的少量的纖溶酶催化pro-UK轉變為UK；3)UK催化纖溶酶原產生大量的纖溶酶。
Pro-UK具有特異的溶血栓作用，它只作用於已被纖維蛋白吸附的纖溶酶原而不作用於血液循環中游離的纖溶酶原。因此Pro-UK溶栓時不易造成全身纖溶酶原和纖維蛋白原降解和耗竭，避免系統性出血等副作用發生。Pro-UK本身對纖維蛋白的親和性很弱，對於其選擇性地溶解纖維蛋白的機制目前還沒有一致意見。
尿激酶原已經由基因重組技術製得[Homes et al，1985；Winkler et al，1986；Nolli etal，1989；Nelles et al，1987；李風知等，1991；Satoh et al，1993；Satoh et al，1996；徐楊等，1993；Weaver et al，1994]，在體內外表現出溶解纖維蛋白的作用。自從1986年Collen等(Collen D.，etal.Coronary thrombolysis in patients with acute myocardial infarction by intravenous infusion ofsynergic thrombolytic agents.Am Heart J.112(5)1083-4.)首次採用pro-UK溶栓治療6名心梗病人以來，已有大量臨床試驗證實其可以在臨床上用於血栓性疾病的治療。
t-PA也具有特異的溶血栓作用。t-PA由527個胺基酸組成，分子量70,000是一種糖蛋白，屬絲氨酸蛋白酶類。單鏈的t-PA可被纖溶酶在R275-I276處切開成為雙鏈t-PA。N-端一段稱為重鏈(或A鏈)，C端一段稱為輕鏈(或B鏈)。A鏈由四個結構域組成(1)指型區(F區)包括殘基1-43，與粘連蛋白的指型區同源；(2)表皮生長因子區(EGF區或E區)包括殘基50-84，與人類表皮生長因子同源；(3)環柄區(Kringle)1包括殘基92-172，與纖溶酶原中環柄區同源；(4)環柄區(Kringle)2包括殘基180-265。B鏈與絲氨酸蛋白酶同源，又稱蛋白水解酶區(P區)，其活性中心由H322，D371，S478組成。t-PA對纖維蛋白具有強親和性，在纖維蛋白不存在時，t-PA只是很弱的激活劑，但纖維蛋白能顯著增加t-PA對纖溶酶原的活化速率，增加t-PA和纖溶酶原複合物的穩定性，使纖溶酶只在纖維蛋白表面產生，從而特異溶解血栓中的纖維蛋白。
RGDS序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)和KGD(賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列，是存在於一類天然物質(去整合素)上的寡肽序列，通過該特異性位點可以特異性地和抑制血小板上GP IIb/IIIa受體結合，GP IIb/IIIa是活化的血小板膜上的糖蛋白，是介導血小板引起的血栓形成中的核心分子。因此，RGDS和KGDW寡肽可以抑制血小板功能，抑制血栓形成。實驗證明含有RGDS和KGDW序列的天然和人工合成寡肽能夠顯著抑制血小板的聚集反應。(Ruoslahiti E，et al.New perspective in cell adhesion，RGD and integrins.Science，1987，154367-382；Scarborough RM，et al.Barbouria GP IIb-IIIa-specific integrin antagonistfrom the venom of Sistrurus m.Barbouri.J.Biol.Chem.1991，266，15，9359-9362.)儘管尿激酶原和t-PA是具有纖維蛋白專一性的溶栓劑，溶栓效果較好而出血副作用較小，但在醫藥生產與臨床治療中，研製活性更高、安全性更大、靶向性更好、再梗率更低、體內半衰期更長的溶栓藥物，將是長期而持久的課題。

發明內容
所要解決的技術問題本發明旨在提供一種新的、高活性、高溶栓特異性且兼有血小板聚集抑制作用的尿激酶原的改構體。

發明內容
本發明提供了一種新的尿激酶原改構體，其分子結構為在N端順序引入tPA的K2區片段與尿激酶原的P區，該分子還包括KGD與RGDS短肽，KGD與RGDS短肽可以在N端，可以在C端，也可以在tPA的K2區片段與尿激酶原的P區之間，還可以在tPA的K2區或尿激酶原的P區中，KGD與RGDS短肽可以相連也可以不相連(部分結構示意圖見圖1)。在該分子的各個結構域，即KGD、RGDS、tPA的K2區和尿激酶原P區之間還可以包括連接區，該連接區長度最好在10個到20個胺基酸之間。本發明還包括上述尿激酶原改構體的衍生物，該衍生物是上述尿激酶原改構體的胺基酸序列中，經過替換、缺失或增加一個或幾個胺基酸衍生的蛋白質，且與上述尿激酶原改構體具有相同的功能。衍生物在多肽的-NH2端可以有一個附加的蛋氨酸殘基，或可帶有一個或幾個糖基側鏈。經純化的該尿激酶原改構體或者其衍生物，與原型的尿激酶原相比，溶解血栓的活性更高，特異性更強，同時兼具血小板聚集抑制作用。
本發明還進一步包括含有上述該尿激酶原改構體或改構體衍生物的藥用組合物，該藥用組合物由上述該尿激酶原改構體或改構體衍生物與適於藥用的載體相混合而成。這一藥用組合物可以用於溶解人和動物的血栓，在臨床上用於血栓性疾病的治療，如心肌梗死、腦梗死、視網膜血管栓塞、下肢靜脈栓塞、肺栓塞等。
本發明另外又包括一種DNA分子，例如，一種重組DNA分子，該分子編碼上述的尿激酶原改構體或改構體衍生物，或者針對不同表達體系的偏愛密碼子，根據該尿激酶原改構體或改構體衍生物的胺基酸序列而設計的重組DNA分子。本發明還包括含有上述DNA分子的重組載體，以及用上述的載體轉化的細胞。該載體和宿主細胞可以是任何通用的和已經商品化的表達載體和宿主細胞，既可以是原核表達系統，如大腸桿菌表達系統、枯草桿菌表達系統等的表達載體和宿主細胞，也可以是真核表達系統，如酵母表達系統、昆蟲杆狀病毒表達系統和哺乳動物細胞表達系統等的表達載體和宿主細胞(薩姆布魯斯(Sambrool，J.)等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第3版)，北京，科學出版社，2002，81605)。
本發明還包括一種製備本文中描述的尿激酶原改構體或改構體衍生物的方法，該方法包括將編碼一種改構型尿激酶原的DNA分子轉化一種細胞，培養該細胞，以及表達該改構體，並分離該改構體(蛋白)。
有益效果這些新分子形成的化合物，以前從未在自然界中發現過，這是本發明的目的所在。這些尿激酶原改構體具有特異的血栓溶解作用，可有效地替代尿激酶原。試驗表明它們和尿激酶原相比，具有更高的纖溶活性，更好的溶栓特異性，另外，還兼有抗血小板聚集的作用。因此，在臨床使用時，可以減少用藥量，減少出血和再梗塞等副作用發生。


尿激酶原改構體M2的結構示意圖具體實施方式
以下結合實施例具體對本發明進行具體說明。
實施例1尿激酶原改構體M2基因的構建(核苷酸和胺基酸序列分別見序列表SEQ ID NO.1和SEQID NO.2)1.t-PA K2區構建根據文獻(Pennica，D.，et al.Cloning and expression of human tissue-type plasminogenactivator cDNA in E.coli.Nature 301(5897)，214-221(1983).)，K2區全序列為GTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCT分三段合成K2模板第一段AAGTGGATATCATGTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTGCCG TGGAATTCCATGAT上遊引物為5』-GGATATCATGTGCTACTTTGGGAA-3』酶切位點為EcoRV下遊引物為5』-AAGAATTCCACGGGAGGCAGGA-3』酶切位點為EcoRI第二段TGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCATGCATCCAC上遊引物為5』-GGAATTCAATGATCCTGATAG-3』酶切位點為EcoRI
下遊引物為5』-TCCGGCAGTAGTTGTGTTTG-3』酶切位點為HpaII第三段TGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACACAACTACTGCCGGAAT上遊引物為5』-TGCCGGAATCCTGATGGGGAT-3』酶切位點為HpaII下遊引物為5』-AATGCATGAGGGCACATCACAGT-3』酶切位點為NsiI分別PCR擴增上述三段序列，擴增產物經回收純化後，用相應酶進行酶切，酶切產物回收純化後連接。連接產物經滅活後，以之為模板用第一條上遊引物和第三條下遊引物為引物進行PCR擴增，擴增產物即為t-PA K2區。回收純化後與pGEM-Teasy載體連接，轉化E.coliDH5α。
2.ProUK-P區構建根據文獻報導(Jacobs，P.，et al.Molecular cloning，sequencing，and expression in Escherichiacoli of human preprourokinase cDNA.DNA 4(2)，139-146(1985).)，ProUK-P區序列(上下遊各含部分非P區編碼序列)為GCATGACTGCGCAGATGGAAAAAAGCCCTCCTCTCCTCCAGAAGAATTAAAATTTCAGTGTGGCCAAAAGACTCTGAGGCCCCGCTTTAAGATTATTGGGGGAGAATTCACCACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTATGTGCTGCTGACCCCCAATGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCTGAGGGTCCCCAGGGAGGAAACGGGCACCACCCGCTTTCTTGCTGGTTGTCATTTTTGCAGTAGAGTCATCTCCATCAGCTGTAAGAAGAGACTGGGAAGATAGGC
TCTGCACAGATGGATTTGCCTGTGGCACCACCAGGGTGAACGACAATAGC化學合成ProUK-P區編碼序列，並在其5』端加上酶切位點為NsiI，3』端加上酶切位點為XbaI。NsiI/XbaI雙酶切，酶切產物回收純化後與pGEM-Teasy載體連接，轉化E.coli DH5α。
3.KGD+RGDS導肽的構建基因合成含KGD+RGDS序列的雙鏈DNA片斷，作為導肽模板GAAGCTTCGCGGCGACAGCAAGGGTGACTGGGATATCC上遊、下遊酶切位點分別HindIII和EcoRV。
4.M2的構建用HimdIII和EcoRV雙酶切Teasy-KGD+RGDS獲得KGD+RGDS區，用EcoRV和NsiI雙酶切Teasy-K2獲得K2區，用NsiI和XbaI雙酶切Teasy-P獲得P區，用HindIII和XbaI雙酶切表達載體pcDNA3.1(+)，回收純化，酶切產物連接過夜，連接產物轉化E.coli DH5α，改構體M2構建完成。
實施例2含尿激酶原改構體M2在中國倉鼠卵巢細胞中的表達1.t-PA K2區構建按實施例1的方法進行。
2.ProUK-P區構建按實施例1的方法進行。
3.Signal+KGD+RGDS導肽區的構建合成含Signal+KGD+RGDS序列的單鏈DNA片斷，作為導肽模板GAAGCTTATGAGAGCCCTGCTGGCGCGCCTGCTTCTCTGCGTCCTGGTCCTGAGCGACTCCAAAGGCCGCGGCGACAGCAAGGGTGACTGGGATATCC上遊引物為5』-GAAGCTTATGAGAGCCCTGCTG-3』酶切位點為HindIII下遊引物為5』-AGATATCCCAGTCACCCTTGCT-3』酶切位點為EcoRVPCR擴增產物即為Signal+KGD+RGDS導肽。擴增產物回收純化後與pGEM-Teasy載體連接，轉化E.coli DH5α。
4.pcDNA-M2質粒的構建用HindIII和EcoRV雙酶切Teasy-Signal+KGD+RGDS獲得Signal+KGD+RGDS區，用EcoRV和NsiI雙酶切Teasy-K2獲得K2區，用NsiI和XbaI雙酶切Teasy-P獲得P區，用HindIII和XbaI雙酶切表達載體pcDNA3.1(+)，回收純化，酶切產物連接過夜，連接產物轉化E.coliDH5α，獲得pcDNA-M2質粒。
5.pTSL-M2的構建人工合成dhfr基因全序列根據GeneBank序列號NM_010049，查得dhfr基因全序列為ATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAACGGAGACCTACCCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAA人工合成該序列，並在序列的5』端加入EcoRV酶切位點，3』端加入PstI酶切位點。
以pGL3-enhancer為模板，設計引物，分別合成啟動子與polyA序列引物設計如下啟動子引物5』-GGAGCTCTGTCAGTTAGGGTGTGGAAA-3』酶切位點為SacI5』-GGATATCGCCTCCTCACTACTTCTGGA-3』酶切位點為EcoRVpolyA序列引物5』-GCTGCAGCGTGTAATTCTAGAGTCGG-3』酶切位點為PstI5』-GAGATCTTACCACATTTGTAGAGGTTTT-3』酶切位點為BglII以pEGFP-1為模板，設計引物，合成SV40增強子增強子引物為5』-GAGATCTGCTGTGGAATGTGTGTCAG-3』酶切位點為BglIl5』-GGAGCTCTACAAATGTGGTAAAATCGA-3』酶切位點為SacI分別PCR擴增合成增強子、啟動子與polyA序列，純化PCR產物，將這三段DNA與dhfr基因序列分別以相應的酶雙酶切，酶切產物回收純化後，克隆入Teasy載體，經DNA序列測定與預期相符。將此重組的Teasy載體以BglII酶切，酶切產物回收後與BglII線性化的pcDNA-M2質粒共同連接，連接產物轉化E.coli DH5α，至此，改構體M2的表達載體--pTSL-M2構建完成。
6.CHO-dhfr-細胞表達改構體M2利用endo-free質粒大提試劑盒，大量提取高純度無內毒素的pTSL-M2質粒，以磷酸鈣沉澱轉染法穩定轉染CHO-dhfr-細胞，用含2×10-8M的氨甲喋呤(MTX)的選擇培養基進行dhfr和MTX雙重篩選，獲得穩定細胞克隆，根據目的蛋白的活性檢測，從細胞克隆中篩選得到高效表達的CHO細胞。經SDS-PAGE電泳鑑定，該細胞表達的尿激酶原改構體M2的分子量為48kd左右，其表達水平可達到25pg/cell/d。將該CHO細胞株進行轉瓶培養，收穫的發酵液經離子交換色譜、凝膠色譜與親和色譜法純化後，低溫凍幹成蛋白粉，4℃保存。此即為尿激酶原改構體M2的純品。
endo-free質粒大提試劑盒購自德國QIAGEN公司，質粒提取方法按照該試劑盒使用說明進行。磷酸鈣沉澱轉染方法參照《動物細胞培養---基本技術指南》的方法進行(R.I.弗雷謝尼著，章靜波徐存拴等譯，動物細胞培養---基本技術指南(第4版)，北京，科學出版社，2004，9)。
實施例3利用昆蟲杆狀病毒表達系統表達改構體M2將改構體M2基因克隆入昆蟲杆狀病毒表達載體pFast-BacHTa中，經脂質體Superfect介導轉染Sf9昆蟲細胞，收穫培養基上清，通過偶聯抗尿激酶原抗體的親和層析柱親和層析後，脫鹽濃縮，凍幹獲得純化的尿激酶原改構體M2蛋白粉。經SDS-PAGE電泳鑑定，Sf9昆蟲細胞表達的尿激酶原改構體M2的分子量與預期相符。
偶聯抗尿激酶原抗體的親和層析柱由上海生工生物工程技術服務有限公司提供，轉染方法參照《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯斯(Sambrool，J.)等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第3版)，北京，科學出版社，2002，8)。
實施例4尿激酶原改構體M2的表達載體的構建、宿主菌株的獲得、表達、純化和鑑定(原核)將M2基因序列克隆入原核表達載體pKK233-2質粒中，用氯化鈣法分別轉化至大腸桿菌JA221後，以IPTG誘導，小規模表達尿激酶原改構體，收集細胞提取物經SDS-PAGE電泳初步測定表達量，從中篩選表達量高的菌株作為工程菌。經SDS-PAGE電泳鑑定，該工程菌表達的尿激酶原改構體M2蛋白的分子量大約為46kd。由於目的蛋白在菌體內以無活性的包含體形式存在，參照文獻(Winkler ME Blaber M，Purification and characterization ofrecombinant single-chain urokinase produced in Escherichia coli.1986，Biochemistry15；25(14)4041-4045.)提供的方法予以體外變復性，從1升培養基中可獲得300000單位的活性尿激酶原改構體M2。
表達載體的構建、宿主菌株的獲得與蛋白表達等方法參照《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯斯(Sambrool，J.)等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第3版)，北京，科學出版社，2002，8)。
實施例5尿激酶原改構體M2的溶栓活性和尿激酶原的溶栓活性的對比例纖維蛋白平板法
參照2005版中國藥典尿激酶活性測定方法，先用0.1mol/LPBS(pH7.4)配製1.4％瓊脂糖，水浴煮溶，取11ml與11ml37℃預熱的牛纖維蛋白原(2mg/ml)與0.45ml(10u/ml)，37℃預熱的牛凝血酶混合，倒入24孔板蓋上，凝後打孔，孔徑3mm，分別加入10μl/孔徑尿激酶標準品(5U，10U，20U，40U共四孔)與待測樣品，37℃6-18h。根據繪製的標準曲線，計算待測樣品的活性。
氣泡法測定參照2005版中國藥典尿激酶活性測定方法。
根據纖維平板法與氣泡法測得尿激酶原改構體M2蛋白的體外纖溶活性為2000IU/106細胞，而同時處理的尿激酶原的體外纖溶活性為1000IU/106細胞。
實施例6尿激酶原改構體M2血小板聚集抑制實驗具體試驗操作根據文獻(Jia LG，et al.，Function of disintegrin-like/cysteine-rich domains ofatrolysin A.Inhibition of platelet aggregation by recombinant protein and peptide antagonists.JBiol Chem.1997，16；272(20)13094-102)進行，誘導劑ADP的濃度為5mmol/L，樣品對血小板聚集的抑制率＝(溶劑對照最大聚集率-樣品最大聚集率)/溶劑最大聚集率×100％。抗血小板聚集試驗表明，尿激酶原改構體M2蛋白抑制50％血小板聚集的半抑制常數IC50為11.2μmol/L，而天然尿激酶原幾乎沒有血小板聚集抑制性。可見尿激酶原改構體M2蛋白與天然尿激酶原相比，具有明顯的血小板聚集抑制性。
實施例7含尿激酶原改構體M2的藥物組合物及其治療血栓性疾病的用途將實施例2中獲得的CHO細胞株表達的尿激酶原改構體M2經離子交換色譜、凝膠色譜與親和色譜法純化，將純化產物加入保護劑、賦形劑後凍幹成蛋白粉，製成粉針劑，4℃低溫保存。
1.重組人尿激酶原改構體M2對小型豬冠脈內血栓的溶解作用將中國試驗小型豬直接用電刺激冠狀動脈造成動脈內膜損傷，逐漸形成冠脈內血栓。用不同劑量重組人尿激酶原改構體M2進行溶栓治療，用冠狀動脈病理切片分析溶栓效果，測定心外膜電圖、血清生化學肌酸激酶、出血和凝血時間、纖溶酶原等指標觀察溶栓作用。結果發現，重組人尿激酶原改構體M240000IU/kg、80000IU/kg、160000IU/kg三個劑量組與對照組相比均能明顯縮小冠脈血栓橫切面積，減輕心肌缺血程度和範圍，縮小梗塞區。同時與重組人組織型纖溶酶原激活劑和重組人尿激酶原進行了比較，結果顯示相同劑量(80000IU/kg)的三種藥物對冠脈血栓的溶解作用、對心肌缺血和心肌梗塞及相關生化指標的改善效果相似，但重組人尿激酶原改構體M2的出血副作用明顯低於重組人組織型纖溶酶原激活劑，且起效更快，同時重組人尿激酶原改構體M2的作用隨劑量增加而增強。
2.重組人尿激酶原改構體M2對金黃地鼠肺栓塞和靜脈血栓的溶解作用在金黃地鼠肺栓塞動物模型中，將受試動物分成7組，每組10隻。於栓子注入體內形成肺栓塞後10min開始給藥，採用先靜脈推注總劑量的10％(體積0.1ml，推注時間1min)，剩餘90％靜脈恆速輸注(體積0.9ml，輸注時間為1h)。對照組給予生理鹽水，受試藥3個劑量組給予注射用重組人尿激酶原改構體M2，劑量分別為1、3、8×104IU/kg，3個陽性藥對照組分別給予注射用尿激酶(UK)、注射用重組人尿激酶原、重組組織型纖溶酶原激活劑，相應的劑量分別為8×104、8×104IU/kg和1mg/kg。上述各組每隻動物給藥總體積均為1ml。120min處死動物。試驗結束後取心、肺測量殘餘血凝塊放射性，按下式計算溶栓百分數 並同時取甲狀腺、肝、腎、尿液、血液、肌肉等組織測定其放射性，計算回收率。以溶解率超過50％作為溶栓治療有效之標準來判斷各劑量組有效率。
在金黃地鼠靜脈血栓模型中，將動物按體重隨即分為7組，每組10隻。鬆開結紮線30min(即血栓形成60min)，經對側頸外靜脈開始給藥，採用先靜脈推注總劑量的10％(體積0.1ml，推注時間1min)，剩餘90％靜脈恆速輸注(體積0.9ml，輸注時間為2h)。對照組給予生理鹽水，受試藥3個劑量組給予重組人尿激酶原改構體M2，劑量分別為1、3、8×104IU/kg，3個陽性藥對照組分別給予注射用尿激酶(UK)、注射用重組人尿激酶原、重組組織型纖溶酶原激活劑，相應的劑量分別為8×104、8×104IU/kg和1mg/kg。上述各組每隻動物給藥總體積均為1ml。180min處死動物。溶栓百分數的計算方法同肺栓塞模型。
結果發現重組人尿激酶原改構體的溶栓作用與尿激酶原、tPA相當，但溶栓速度較尿激酶原與tPA快。
3.重組人尿激酶原改構體M2對栓塞性腦卒中的治療作用採用頸內動脈注射自體全血凝塊形成家兔和大鼠栓塞性腦卒中模型，應用放射性同位素(99mTc)體外動態示蹤技術和核磁共振影象方法，發現在家兔栓塞性腦卒中模型上，靜脈給予注射用重組人尿激酶原改構體M22.0、4.0、8.0×104IU/kg，能產生漸進性顯著的溶栓作用，其ED50為3.2×104IU/kg。重組人尿激酶原改構體M2(8×104IU/kg)溶栓速度較尿激酶、重組組織型纖溶酶原激活劑(1mg/kg)快，溶栓效力亦更強，與重組人尿激酶原作用相當。重組人尿激酶原改構體M2溶栓治療過程中，腦出血程度和範圍較尿激酶、重組組織型纖溶酶原激活劑、重組人尿激酶原輕。
在大鼠栓塞性腦卒中模型上，靜脈給予注射用重組人尿激酶原改構體M24、8、16×104IU/kg，動物行為障礙明顯改善，核磁共振檢測顯示腦病變體積和範圍明顯縮小，TTC染色表明腦梗死體積和範圍也明顯縮小，常規組織病理學檢查發現腦組織損傷嚴重程度有所改善，未見明顯腦出血。重組人尿激酶原改構體M2(8×104IU/kg)溶栓治療後對腦組織的保護作用效力與等劑量的尿激酶、重組人尿激酶原和重組組織型纖溶酶原激活劑(2mg/kg)相當，但腦出血副反應較尿激酶和重組組織型纖溶酶原激活劑少。
4.重組人尿激酶原改構體M2對大鼠視網膜中央動脈血栓的溶解作用採用光化學法引起視網膜中央動脈形成血栓，應用都卜勒微循環血流儀測定視網膜相對流量，發現靜脈推注總劑量的10％與隨後1小時靜脈輸注餘量90％，重組人尿激酶原改構體(2.0、4.0、8.0×104IU/kg)能明顯溶解血栓，使栓塞的視網膜中央動脈出現再通，再通率分別為60％、75％、90％，溶栓速度較尿激酶原(8.0×104IU/kg)、尿激酶(8.0×104IU/kg)與重組組織型纖溶酶原激活劑(2mg/kg)快。
上述模板和引物採用DNA合成儀按說明書進行，序列測定採用自動核酸序列測定儀按說明書進行。pGEM-Teasy載體、pGL3-enhancer質粒、pKK233-2質粒、菌株E.coli DH5α和JA221購自Promega公司，所用酶和試劑購自Promega公司，pEGFP-1質粒購自Clonetech公司，脂質體Superfect購自invitrogen公司。酶切和連接反應條件按說明書進行。PCR產物回收純化採用購自QIAGEN公司的QIAEX II Gel Extraction Kit試劑盒。PCR反應、電泳、感受態細胞製備、轉化等分子生物學方法採用《分子克隆實驗指南》的方法進行(薩姆布魯斯(Sambrool，J.)等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第3版)，北京，科學出版社，2002，8)。質粒提取，採用上海生工試劑盒K192，按照使用說明進行。
核苷酸和胺基酸序列表SEQ ID NO.1cgcggcgaca gcaagggtga ctgggatatc atgtgctact ttgggaatgg gtcagcctac60cgtggcacgc acagcctcac cgagtcgggt gcctcctgcc tcccgtggaa ttcaatgatc120ctgataggca aggtttacac agcacagaac cccagtgccc aggcactggg cctgggcaaa180cacaactact gccggaatcc tgatggggat gccaagccct ggtgccacgt gctgaagaac240cgcaggctga cgtgggagta ctgtgatgtg ccctcatgca tgcatgactg cgcagatgga300aaaaagccct cctctcctcc agaagaatta aaatttcagt gtggccaaaa gactctgagg360ccccgcttta agattattgg gggagaattc accaccatcg agaaccagcc ctggtttgcg420gccatctaca ggaggcaccg ggggggctct gtcacctacg tgtgtggagg cagcctcatc480agcccttgct gggtgatcag cgccacacac tgcttcattg attacccaaa gaaggaggac540tacatcgtct acctgggtcg ctcaaggctt aactccaaca cgcaagggga gatgaagttt600gaggtggaaa acctcatcct acacaaggac tacagcgctg acacgcttgc tcaccacaac660gacattgcct tgctgaagat ccgttccaag gagggcaggt gtgcgcagcc atcccggact720atacagacca tctgcctgcc ctcgatgtat aacgatcccc agtttggcac aagctgtgag780atcactggct ttgg aaaga gaattctacc gactatctct atccggagca gctgaaaatg840actgttgtga agctgatttc ccaccgggag tgtcagcagc cccactacta cggctctgaa900gtcaccacca aaatgctgtg tgctgctgac ccacagtgga aaacagattc ctgccaggga960gactcagggg gacccctcgt ctgttccctc caaggccgca tgactttgac tggaattgtg1020agctggggcc gtggatgtgc cctgaaggac aagccaggcg tctacacgag agtctcacac1080ttcttaccct ggatccgcag tcacaccaag gaagagaatg gcctggccct ctga 1134SEQ ID NO.2Arg Gly Asp Ser Lys Gly Asp Trp Asp Ile Met Cys Tyr Phe Gly Asn1 5 10 15Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser20 25 30
Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala35 40 45Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys50 55 60Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn6570 75 80Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Met His Asp85 9095Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu Lys Phe100 105 110Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly115 120 125Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg130 135 140Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile145 150 155160Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro165 170 175Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser180 185 190Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His195 200 205Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu210 215 220Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr225 230 235 240
Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly245 250 255Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr260 265 270Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His275280 285Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys290 295 300Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly305 310 315 320Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu325330335Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro340 345 350Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His355 360 365Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu370 37權利要求
1.一種尿激酶原改構體，其分子結構為(i)在N端順序引入tPA的K2區片段與尿激酶原的P區，該分子還包括KGD與RGDS短肽；(ii)在(i)的胺基酸序列中，經過替換、缺失或增加一個或幾個胺基酸衍生的蛋白質，且與上述尿激酶原改構體具有相同的功能，或者衍生物在N端有一個附加的蛋氨酸殘基，或帶有一個或幾個糖甙側鏈。
2.如權利要求1尿激酶原改構體，在該分子的各個結構域之間還包括連接區，該連接區長度在10個到20個胺基酸之間。
3.一種用於溶栓的藥用組合物，由權利要求1或2所述的尿激酶原改構體和適合藥用的載體組成。
4.權利要求3的組合物在製備治療血栓性疾病的藥物中的應用。
5.編碼權利要求1的尿激酶原改構體的核酸分子，其序列為(i)編碼權利要求1所述的胺基酸序列的核酸分子；(ii)針對不同表達體系的偏愛密碼子，根據該尿激酶原改構體的胺基酸序列而設計的重組DNA分子。
6.含有權利要求5的核酸分子的表達載體。
7.如權利要求6的表達載體，其中所述載體為真核表達載體。
8.權利要求7的載體轉染宿主細胞形成的細胞株。
9.如權利要求8所述的細胞株，其中所述的宿主細胞是CHO細胞。
10.一種製備權利要求1的尿激酶原改構體的製備方法，該方法包括將權利要求5的DNA分子裝入適當的載體，轉染一種適當的宿主細胞，培養該細胞，表達並分離純化該改構體。
全文摘要
本發明屬於基因工程領域，提供了一種新的尿激酶原改構體，其分子結構為在N端順序引入tPA的K2區片段與尿激酶原的P區，該分子還包括KGD與RGDS短肽。經純化的該尿激酶原改構體，與原型的尿激酶原相比，溶解血栓的活能更高，特異性更強，同時兼具血小板聚集抑制作用。
文檔編號C12P21/02GK1924013SQ20051001496
公開日2007年3月7日 申請日期2005年9月1日 優先權日2005年9月1日
發明者沈偉, 王子清, 高峰, 姜燕 申請人:天津天士力製藥股份有限公司, 上海天士力藥業有限公司