血清澱粉酶試劑盒及其製備方法

2023-04-24 10:29:46

專利名稱：血清澱粉酶試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明屬於測量體內血液特性的製劑及方法特別是涉及血清澱粉酶試劑盒及製備方法背景技術早在1929年，Elman就確立了血清澱粉酶(Amy)在急性胰腺炎診斷上的價值。測定總活性的方法分四類，第一類測定底物澱粉的消耗量由粘度法、濁度法、碘-澱粉法，此類方法準確度差，敏感度低；第二類為生糖法，測定產物葡萄糖；第三類為色原底物分解法，染料與不溶性澱粉結合成色原底物(俗稱染色澱粉)，在Amy催化下隨著澱粉的降解游離出染料，測染料的含量，此類方法需特殊儀器，應用不廣。第四類為酶偶聯法用組成確定的澱粉酶底物及輔助酶與指示酶系統檢測澱粉酶，可改進反應的化學計量關係，有利於實現連續檢測及應用國際單位。α-Amy水解小分子寡糖所得產物比水解澱粉更為確定。國內倪星忠等報導了採用NaN3為激活劑的直接測定法。發表在1996年臨床檢驗雜誌第六期上，此方法以氯硝基苯麥芽糖為底物，因其交叉汙染等原因，使假陽性增多。1998年國際臨床化學學會(IFCC)批准了以4-硝基酚-α-D-麥芽三糖為底物檢測α-Amy方法，該法具有良好的準確度、精密度。IFCC參考方法中A底物為4-硝基酚-α-D-砒喃葡萄糖苷酶，wako公司試劑盒，溫度T為30℃，PH為7.1。BBoehringer Manheim公司產品α-Amy試劑盒、底物為亞乙基-[4-硝基酚(G1]-α-D-麥芽七糖苷，輔酶，α-葡萄糖苷酶，溫度T為30℃，PH為7.1。
另外Klaus Lorentz建立的應用保護的亞乙基-4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽七糖苷(EPS_-G7)檢測α-Amy的方法中溫度T為30℃，PH為7.0，酶工作液含酶6.2mmol/L。
因4-硝基酚(4-NP)的解離隨溫度升高而升高，但現在測試溫度為30℃，較低，故而影響α-Amy的催化降解反應，延滯時間長，線形範圍窄，不適應常規分析。

發明內容
本發明為解決現有技術中存在的技術問題而提供一種血清澱粉酶試劑盒及其製備方法。
本發明為解決現有技術中存在的技術問題所採取的技術方案是一種血清澱粉酶試劑盒，其包括緩衝液、底物液及酶貯存液，其緩衝液中NaCl含量為70mmol/L，Cacl2含量為1.0mmol/L，N-2羥乙基哌嗪-N』-乙基磺酸(HEPES)含量為50mmol/L，底物液中底物為亞乙基-4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽七糖苷(EPS-G7)含量為3.5mmol/L、酶貯存液中α-葡萄糖苷酶含量為60U/ml，人血清白蛋白含量為20g/L。
所述的血清澱粉酶試劑盒，其試劑盒測試時溫度為37℃，緩衝液PH為7.15，酶工作液中酶含量為7.1U/ml。
所述血清澱粉酶試劑盒中試劑的製備方法a.緩衝液的製備方法將1.02gNaCl、2.98gN-2羥乙基呱嗪-N-乙基磺酸(HEPES)溶於約220ml蒸餾水中，加入0.07ml 258mmol/L CaCl2，37℃下用約24ml 0.2mmol/L NaOH調節PH值到7.15，準確加水至250ml；b.底物液的製備方法將157mgEPS-G7溶於1液中，準確加至100ml；c.酶貯存液的製備方法將含量25U/mg，37℃的α-葡萄糖苷酶10mg和80mg人血清白蛋白用50mmol/L PH 7.15 HEPES緩衝液溶解至4.2ml；d.酶工作液的製備方法取酶貯存液2.4ml加到17.6ml PH7.15 HEPES緩衝液中。
為了更好地理解本發明的實質，下面通過實驗及結果來進行說明。
實驗原理EPS-G7和α-葡萄糖苷酶均勻地分解所有的反應，生成4-硝基酚和葡萄糖。
實驗儀器SPS-100全自動生化分析儀(荷蘭Vital公司，6～1795)；pH-3B型數字式酸度計(江蘇電分析儀器廠，B-42)；分析天平(萬分之一，上海長江科學儀器廠，TG328A)。
試劑EPS-G7(德國CENTRONIC)批號為U0150；α-葡萄糖苷酶來自酵母菌，比活性為25U/mg，批號為B-174207(Boehringer)；N-2羥乙基哌嗪-N』-乙基磺酸(HEPES)，胰腺澱粉酶標準品，批號為P 9903，(由美國國家生物化學標準和質控委員會認證的參考物476)，以及高於參考值上限15倍的人血清澱粉酶，批號P 196561(Roch)，膽紅素(分析純SIGMAGRADE)批號57F 0111；Boehringer公司α-Amy試劑盒，批號為B 1125。4-硝基酚(4-NP)經過三次結晶以滿足Bower等規定的純淨標準，其它化學試劑均為分析純試劑。
實驗參數波長405nm，溫度37℃，酶工作液500μL，標本量血20μL或尿10μL，底物液100μL，延遲時間120s，測量時間120s。
計算公式U/L＝ΔA/min×VT/ε/L/VS尿U/L＝ΔA/min×1200.5血U/L＝ΔA/min×1120實驗結果1.4-NP摩爾吸光係數的確定 按照Lorentz方法，在1.0cm光徑，波長405nm處，pH分別為7.00，7.05，7.10，7.15，7.20時測定100μmol/L4-NP的吸光度，並計算出ε分別為1051.6，1101.9，1151.8，1200.5，1245.3mol/L，本法選用pH7.15時ε1200.5mol/L。
2.緩衝液的選擇 在PH、底物濃度恆定時，選取HEPES、磷酸鹽和羥乙基甲烷(BTP)三種緩衝液分別檢測濃度為49.3U/L的胰澱粉酶標準品，n＝20，結果見表1。由表中看出，酶在BTP緩衝液中活性減少14％，在磷酸鹽緩衝液中活性下降6％，而HEPES緩衝液並無影響。因此選用HEPES緩衝液作為本實驗的緩衝體系。
3.選擇最適底物濃度 在其它實驗條件恆定時，在405nm處，檢測不同濃度的底物對反應速率的影響，繪製底物濃度與酶反應速率曲線。見圖1。繪製Linewear-Burk圖，見圖2。根據數據得回歸方程為y＝24.39+4.37x，得出以ESP-G7為底物的α-AMY的Km＝0.179mmol/L據此本法選用底物濃度為3.5mmol/L。
4.最適PH的選擇 用PH分別為6.9，7.0，7.1，7.15，7.2，7.3的HEPES緩衝液配製3.5mmol/L的ESP-G7底物液，405nm處測定α-Amy活性，結果見圖3，從圖3得知澱粉酶最適宜的PH為6.9-7.0，在PH7.15時AMY活性保持最大活性的98％，由於在活性PH高於最適宜時，4-NP的吸光率增加，補償了AMY活性的損失，因此選擇了7.15，以使檢測更完善。
5.線性反應時間和線性範圍的確定 取胰澱粉酶標準品活性為49.3U/L在SPS-100上，將反應時間設定在12min，得反應時間曲線。見圖4。將高活力的人血澱粉酶稀釋成200、400、800、1200、1400、1600U/L，分別測酶活力，得酶的線性範圍。見圖5。從圖中得知檢測的範圍擴大了，從1000-1500U/L都可以一次檢測出來，並保證精密度，超過1500U/L標本用生理鹽水稀釋後再測。
6.精密度實驗 取高、中、低值分別為398、118、49.3U/L的標準品，連續測20次，求出批內精密度。每份血清測一次，連續測20d，得批間精密度。結果見表2。其批內CV為1.4-2.6％，批間CV為1.9-2.8％7.回收實驗 在活性為49.3U/L的酶原液中，分別加入活力為5.1，3.1，2.5U/L的標準液後檢測酶活力，結果見表3。
8.最佳反應溫度的選擇 在其它條件恆定時，在反應溫度分別為25℃、30℃、35℃、37℃、40℃時測定酶反應速度ΔA/min，結果見圖6，由於色原的電離隨溫度的升高而增加，4-NP的摩爾吸光係數在37℃時比在30℃時高8％左右，故而選37℃反應體系。
9.幹擾實驗 分別將濃度不同的血紅蛋白、膽紅素、葡萄糖、蛋白質加入到活性為49.3U/L的胰澱粉酶標準品中，結果見表4、表5、表6、表7。安照100±3％的回收試驗標準，我們發現29.5g/L血紅蛋白、610mmol/L，100mmol/L葡萄糖、70mmol/L蛋白質對反應無幹擾。
10.相關性實驗 用本法和IFCC批准Boehringer公司試劑盒(底物為4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽三糖苷)分別測定胰澱粉酶標準品。測得相關方程為y＝10.9+1.445x，γ＝0.994，n＝20。由於相關係數＜0.975，因此本方法與IFCC推薦的方法具有良好的相關性。
11.試劑穩定性觀察 工作試劑配製後，立即測定405nm時A＝0.187；5℃4周後A＝0.206；5周後A＝0.396；實驗證明A＞0.40時，測定結果偏低。所以5℃不含添加劑的底物限定貯存期為3周，酶溶液限定貯存期為5周。
初步臨床應用情況研究對象在我院健康查體成人80名，男女各40名，平均年齡41.4歲，符合下列條件，B超檢查肝、膽、胰、脾、腎均正常。血液檢查總蛋白為62～75g/L，空腹GLU＜6.1mmol/L，Cr＜96mmol/L，γ-GT＜20U/L，ALT＜40U/L，將他們分為五組，每8名男性、8名女性為一組，在20～69歲之間，每10歲為一個年齡組，均在清晨空腹留尿、採血。急性胰腺炎42例，慢性胰腺炎4例，腮腺炎1例。
測定結果正常人對於男性和女性無明顯差別，在不同年齡組，在所有對比實驗中，P≥0.9也無明顯差別，因此，通過對80例健康成人的檢測，結果符合正態分布，建立0.95可信區間的參考範圍血33.9～96.2U/L，尿65.4～187.6U/L；42例急性胰腺炎檢測血296-1252U/L，尿506.3～1954.7U/L；慢性胰腺炎較急性偏低血138-504U/L，尿238.5～429.6U/L；腮腺炎血269U/L，尿197.6U/L。
本發明具有的優點和積極效果是所有的連續檢測α-Amy檢測方法，應用亞乙基封閉的4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽七糖苷為底物和新的酵母菌的α-葡萄糖苷酶，均勻地分解所有的反應，生成4-硝基酚和葡萄糖，不需要複雜的預處理及特殊儀器，試劑具有足夠的穩定性以及易於操作等優點，使常規測試程序所需樣品體積減少，縮短了延遲時間，減少了基質某些狀況的幹擾，同樣改變了IFCC推薦方法的反應條件，將測試溫度由30℃改為37℃，PH由6.9-7.0改為7.15。酶濃度由6.2mmol/L改為7.1mmol/L，以使還原100％解離，增加了釋放性，延長了相關線性範圍，通過對這些結果的評價分析，此檢測方法是一種更趨完善的檢測α-Amy的方法。


圖1是底物濃度與酶反應速率曲線圖；
圖2是Linewear-Burk圖；圖3是PH對酶活性的影響圖；圖4是酶促反應時間曲線圖；圖5是酶的線形範圍圖；圖6是溫度對反應速度的影響圖。
具體實施例方式
1.緩衝液將1.02gNaCl、2.98gHEPES溶於約220ml蒸餾水中，加入0.07ml258mmol/L CaCl2，37℃下用約24ml 0.2mmol/L NaOH調節PH至7.15，準確加水至250ml。
2.底物液將157mgEPS-G7溶於1液中，準確加至100ml。
3.酶貯存液將含量25U/mg，37℃的α-葡萄糖苷酶10mg和80mg人血清白蛋白用50mmol/L PH 7.15 HEPES緩衝液溶解至4.2ml。
4.酶工作液取酶貯存液2.4ml加到17.6ml PH7.15 HEPES緩衝液中，讓其含酶7.1U/ml。
5.4-硝基酚(4-NP)用分析天平稱取1.38mg 4-NP至容量瓶中，準確定容100ml。
表1.緩衝液的選擇

表2.精密度實驗結果n＝20

表3.回收實驗結果

表4.加入血紅蛋白後α-Amy活性比較

表5.加入膽紅素後α-Amy活性比較

表6.加入葡萄糖後α-Amy活性比較

表7.加入蛋白質後α-Amy活性比較

權利要求
1.一種血清澱粉酶試劑盒，其包括緩衝液、底物液及酶貯存液，其特徵是緩衝液中NaCl含量為70mmol/L，Cacl2含量為1.0mmol/L，N-2羥乙基哌嗪-N』-乙基磺酸(HEPES)含量為50mmol/L；底物液中底物為亞乙基-4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽七糖苷(EPS-G7)含量為3.5mmol/L；酶貯存液中α-葡萄糖苷酶(a-AMY)含量為60U/ml，人血清白蛋白含量為20g/L。
2.根據權利要求1所述的血清澱粉酶試劑盒，其特徵是此試劑盒測試時溫度為37℃，緩衝液PH為7.15，酶工作液中酶含量為7.1U/ml。
3.根據權利要求1所述的血清澱粉酶試劑盒中試劑的製備方法，其特徵是a.緩衝液的製備方法將1.02gNaCl、2.98gHEPES溶於約220ml蒸餾水中，加入0.07ml 258mmol/L CaCl2，37℃下用約24ml 0.2mmol/L NaOH調節PH值到7.15，準確加水至250ml；b.底物液的製備方法將157mgEPS-G7溶於1液中，準確加1液至100ml；c.酶貯存液的製備方法將含量25U/mg，37℃的α-葡萄糖苷酶10mg和80mg人血清白蛋白用50mmol/L PH7.15 HEPES緩衝液溶解至4.2ml；d.酶工作液的製備方法取酶貯存液2.4ml加到17.6ml PH7.15 HEPES緩衝液中。
全文摘要
一種血清澱粉酶試劑盒，其包括緩衝液、底物液及酶貯存液，其緩衝液中NaCl含量70mmol/L，CaCl
文檔編號C12Q1/40GK1912580SQ20051001472
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月8日 優先權日2005年8月8日
發明者蘇作軍, 徐心 申請人:蘇作軍, 徐心